Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS.

Phạm Minh Nhật

MỤC LỤC
LỜI NÓI ĐẦU....................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY ĐỘC CỦA CAMPYLOBACTER.......2
.......................................................................................................................19
CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................21
[7] THƯỜNG QUY KỸ THUẬT - PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH
CAMPYLOBACTER TRONG THỰC PHẨM (52 TCN - TQTP 0014 : 2006 do
Viện Dinh dưỡng biên soạn, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm đề nghị, Bộ
trưởng Bộ Y tế ban hành).....................................................................21

LỜI NÓI ĐẦU

Vi sinh vật có ở khắp mọi nơi xung quanh chúng ta như trong phân, nước thải, rác,
bụi, thực phẩm. Trong không khí và ngay ở trên cơ thể chúng ta cũng là nơi cho vi sinh
vật sinh sống, chúng có thể sống kí sinh trên da (đặc biệt là ở bàn tay), ở miệng, ở đường
hô hấp, đường tiêu hóa, bộ phận sinh dục, tiết niệu… Đặc biệt thức ăn và nước uống
chính là con đường chính để vi sinh vật xâm nhập và gây bệnh cho con người.
Hiện nay, ngộ độc do vi sinh vật gây ra là vấn đề được cả xã hội quan tâm. Liều
gây ngộ độc cho con người phụ thuộc vào loại độc tố của vi sinh vật, tuổi tác và tình
trạng sức khoẻ của mỗi con người. Một trong số những loài vi sinh vật gây bệnh cần phải
được quan tâm là Campylobacter tồn tại chủ yếu ở gia súc và gia cầm.
Camplybacter là loại vi khuẩn có hình xoắn, Gram âm, vi hiếu khí. Chúng gây ra
sốt, đau đầu, tiêu chảy, chuột rút, mê sảng. Trong đó loài Campylobacter gây bệnh tiêu
chảy cho người phổ biến nhất là C. jejuni và C. coli. Vì vậy việc nghiên cứu xác định tính
chất, đặc điểm của loài này là rất quan trọng, từ đó ta có thể xác định được cơ chế gây
bệnh của nó và có những công tác phòng chống, điều trị hợp lí nhằm đảm bảo sức khoẻ
cho con người.

08DSH2 Trang 1
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY ĐỘC CỦA CAMPYLOBACTER

Campylobacter là 1 loại vi khuẩn gây nhiễm trùng đường ruột bao tử gọi là
campylobacteriosic. Thường campylobacteriosix đươc gọi là campylobacter

1.1 Lịch sử phát hiện

Nhận thức về y tế công cộng về những tác động của Campylobacter đã phát triển
qua nhiều thế kỷ. Năm 1886 Escherich quan sát thấy các sinh vật tương tự như
Campylobacter trong các mẫu phân của trẻ em bị tiêu chảy.
Các triệu trứng nhiễm khuẩn Campylobacter được mô tả vào năm 1886 ở trẻ bởi
Theodor Escherich .
Campylobacter, nguyên nhân gây bệnh do súc vật đã biết từ năm 1909 nhưng sau này
người ta nhận thấy đó là nguyên nhân gây bệnh trên người.
Năm 1913 McFaydean và Stockman xác định Campylobacter trong mô bào
thai cừu bị hủy bỏ.

08DSH2 Trang 2
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

Năm 1927 vi trùng học lâm sàng tại Bỉ đầu tiên cô lập Campylobacter từ mẫu phân
của bệnh nhân bị tiêu chảy và đến năm 1957 mô tả sự cô lập của
Campylobacter từ mẫu máu của trẻ em bị tiêu chảy.
Năm 1969 Dekeyer phân lập được từ phân bệnh nhân tiêu chảy sau đó vi khuẩn được
đặt tên là campolybacter (campylo: cong ; bacter :que để phân biệt với Vibrio.
Sự phát triển của các phương tiện truyền thông có chọn lọc trong năm 1970 cho
phép nhiều phòng thí nghiệm kiểm tra mẫu Campylobacter và các loài Campylobacter đã
được thành lập như là tác nhân gây bệnh phổ biến ở con người.

1.2 Phân loại:

Campylobacter thuộc họ Campylobacteraceae
Gồm 2 hai chi là Campylobacter và Arcobacter , gần đây người ta phát hiện thêm
một chi mới đặt tên là Sulfurospirillum
Campylobacter loài sinh vật có ảnh hưởng đến sức khoẻ con người và động vật. Việc
xác đinh Campylobacter là cần thiết và đòi hỏi phải có sự phát triển của ngành vi sinh,
hoá sinh trong công nghệ sinh học bởi vì trong nhiều trường hợp các mẫu thử nghiệm có
tính chất khó xác định đã hạn chế sự phát hiện của Campylobacter trong phòng thí
nghiệm. Hiện nay bằng nhiều phương pháp hiện đại con người đã phát hiện và định
lượng được khoảng 16 loài Campylobacter đó là : C. coli, C. concisus, C. curvus, C.
fetus, C. gracilis, C. helveticus, C. hyointestinalis, C. jejuni, C. lari, C. mucosalis, C.
rectus, C. showae, C. sputorum, C. upsaliensi, C.hominis, C. insulaenirae, C.
lanienae. Trong đó loài Campylobacter gây bệnh tiêu chảy cho người phổ biến nhất là C.
jejuni và C. coli.

08DSH2 Trang 3
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

Campylobacter Coli Campylobacter Jejuni

1.3 Đặc điểm

1.3.1 Đặc điểm chung
Campylobacter là một loại vi khuẩn gây nhiễm trùng
đường ruột bào tử gọi là campylobacteriosis. Thường
campylobacteriosis được gọi là campylobacter.
Con người thường bị nhiễm trùng khi ăn hoặc uống các
thức ăn, nước uống bị ô nhiễm hoặc sữa không được tiệt trùng.
Phần lớn những người bị nhiễm campylobacter bị bệnh từ ba tới năm ngày, nhưng
trong khoảng 20 phần trăm trường hợp, triệu chứng có thể kéo dài tới hai tuần hoặc lâu
hơn. Đôi khi người nhiễm bệnh phải nằm bệnh viện. Tính gây bệnh của Campylobacter
tương đối cao, khoảng 500 tế bào có thể đủ để gây bệnh.
Campylobacter là vi khuẩn yếu. Nó rất khó sống trong môi trường chế biến thực
phẩm. Di động được nhờ một hoặc 2 tiên mao mọc lưỡng cực.
1.3.2 Đặc điểm sinh hoá
Campylobacter là những vi khuẩn có hình xoắn, Gram âm, vi hiếu khí (chỉ cần
5% Oxy cho sinh trưởng ,và sẽ sinh trưởng tốt trong điều kiện chỉ có khoảng 10% carbon
dioxide).
Đối với nhiệt độ, Campylobacter rất nhạy cảm , biên độ nhiệt độ thích hợp từ 30-
45oC. Nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 42OC, không phát triển ở nhiệt độ 210C. Tại

08DSH2 Trang 4
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

nhiệt độ 600C chỉ tồn tại trong khoảng 6 giây. Campylobacter nhạy cảm với điều kiện
đông lạnh (đóng băng) nhưng nó có thể sống được vài tháng trong điều kiện lạnh.
Campylobacter nhạy cảm với acid, phát triển được ở pH 4,8 -8,0, pH thích hợp từ
5-9, tối thích từ 6.5-7.5, Campylobacter cũng rất nhạy cảm với muối. Nồng độ 2,5% đủ
để hạn chế chúng ở trong điều kiện phát triển tối ưu.
1.4 Cấu trúc
Campylobacter là một vi khuẩn Gram âm như trực khuẩn. Nó có một tiên mao ở
một cực hoặc cả hai cực của tế bào.

Hai tiên mao Một tiên mao

Tế bào Campylobacter có chứa một màng ngoài và một màng trong với periplasm
ở giữa hai màng. Màng ngoài bao gồm các lipopolysaccharide có endotoxic (nội độc tố).
Protein màng được gắn trên bề mặt màng ngoài và đóng vai trò là kháng nguyên.
 Cấu tạo kháng nguyên:
• Kháng nguyên thân O: bản chất là lipopolisaccharid vững bền với nhiệt
độ. Dựa vào kháng nguyên O chia vi khuẩn thành hơn 90 typ huyết thanh
khác nhau.
• Kháng nguyên lông H: dễ bị nhiệt độ phân hủy, dựa vào kháng nguyên H
chia vi khuẩn thành 112 typ huyết thanh khác nhau.
1.5 Yếu tố độc lực
Các yếu tố độc lực mà Campylobacter tuân thủ các tế bào biểu mô là các protein,
tiên mao và lipopolysaccharide, nó tương tác với các dòng tế bào ruột, thâm nhập của
niêm mạc ruột gây tổn thương và làm viêm dạ dày ruột.

08DSH2 Trang 5
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

• Enterotoxins (độc tố đường ruột): độc tố gây độc tế bào và giết chết tế bào
bằng cách thay đổi đỉnh màng thẩm thấu (niêm mạc biểu mô) của tế bào thành
ruột. Nó chủ yếu hình thành độc tố lỗ (chủ yếu là clorua lỗ chân lông) tập hợp để
tạo thành lỗ chân long ở màng tế bào dẫn đến tính năng thấm ion clorua của màng
tế bào niêm mạc đường ruột gây chết tế bào. Độc tố enterotoxins gây tiêu chảy do
tác động trực tiếp lên cơ chế bài tiết của niêm mạc ruột.
• Cytotoxin: độc tố cytotoxin phá huỷ tế bào niêm mạc và gây tiêu chảy.
• Eurotoxin: tác động trực tiếp lên hệ thống thần kinh trung ương hay ngoại
biên
• Protein bám dính: các tiêm mao bám dính vào niêm mạc đường ruột trong
quá trình gây bệnh. Vì thế chúng phải cạnh tranh với vi khuẩn thường trú ở
ruột để chiếm lấy niêm mạc mới gây bệnh. Các vi khuẩn Campylobacter có
thể sản xuất ra một số protein bám dính bản chất là polysaccharde thường là
thành phần cấu tạo của màng tế bào, vách tế bào và vỏ vi khuẩn.

1.6 Cơ chế gây bệnh

Cơ chế lây nhiễm chủ yếu của các bệnh này là do những chất tiết ra như nước tiểu,
máu, nước bọt và đặc biệt là lông của chó, mèo… khi những thứ này bám vào thức ăn
của người, hoặc do người bệnh tiếp xúc thân thiết với chó mèo bằng các hành động như
ve vuốt, ôm ấp, ngủ chung với chúng. Một số trường hợp khác là do bị thú nuôi cắn trực
tiếp.
Cơ chế truyền bệnh của Campylobacter là theo đường phân – miệng và do tiếp
xúc người – người.
Khi mật độ vi khuẩn campylobacter tăng cao đến mức gây bệnh (khoảng 500 tế
bào) chúng sẽ theo thức ăn vào cơ thể qua đường tiêu hoá đến niêm mạc, đại tràng... sử
dụng roi của nó tại cả hai cực tiết ra protein bám dính để cư trú, vi khuẩn phải tạo ra độc
tố chống lại tế bào thực bào, từ đó mới có thể tồn tại được và sản sinh phát triển. Sau đó
sản sinh ra các độc tố enterotoxins gây tiêu chảy do tác động trực tiếp lên cơ chế bài tiết

08DSH2 Trang 6
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

của niêm mạc ruột, độc tố cytotoxin phá huỷ tế bào niêm mạc và gây tiêu chảy…chúng sẽ
thâm nhập vào đường nội bào, là con đường mà các tế bào sử dụng để tái tạo lại các phân
tử từ bề mặt của chúng. Sau đó, nó nhanh chóng chuyển hướng và tạo ra một mạng lưới
nội bào riêng gồm các không bào chứa đầy vi khuẩn campylobacter, hay còn gọi là các
túi tế bào, các túi này sẽ tiến dần đến nhân, và cuối cùng khu trú gần bộ Golgi - trung tâm
vận chuyển của tế bào. Kết quả là làm phá huỷ niêm mạc thành ruột gây viêm hoặc thủng
thành ruột dẫn đến tiêu chảy, đau bụng, mệt mỏi, sốt, buồn nôn và nôn.
Hầu hết các chủng C.jejuni sản xuất một chất độc (cytolethal distending độc tố)
mà gây cản trở cho các tế bào từ phân chia và kích họat hệ thống miễn dịch. Điều này
giúp các vi khuẩn né tránh hệ thống miển dịch và tồn tại trong một thời gian giới hạn
trong tế bào.
1.7 Bệnh và các triệu chứng bệnh
1.7.1 Các bệnh do Campylobacter
Campylobacter có thể gây nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm nội tâm mạc,
viêm màng trong tim, viêm khớp…. Vi khuẩn còn gây bệnh tiêu chảy và ngộ độc thực
phẩm cho người. Trong bệnh viêm ruột do Campylobacter (Campylobacteriosis), loài
C.jejunisubsp jejuni chiếm đến 89 – 93% , C. coli chỉ chiếm 7 – 10% và C. lari chiếm
một tỷ lệ không đáng kể khoảng 0.1 – 0.2 %. Hầu hết bệnh nhân Campylobacteriosis nếu
phát hiện sớm và điều trị đúng phác đồ, chỉ sau vài ngày là bệnh sẽ khỏi. Nhưng nếu
người bệnh là đối tượng suy yếu miễn dịch hoặc suy giảm miễn dịch trầm trọng (AIDS),
tính mạng người bệnh dễ bị đe dọa .
Trong báo cáo của mình, các nhà nghiên cứu cho thấy rằng nhiễm vi khuẩn
Campylobacter kết hợp với hội chứng Guillain-Barre (gây mất cảm giác và yếu cơ) là
nguyên nhân phổ biến nhất gây ra bệnh bại liệt tại Hoa Kỳ cũng như viêm khớp, nhiễm
trùng tim, và nhiễm trùng máu. Một số chủng C.jejuni sản sinh ra độc tố ruột giống vi
khuẩn tả gây bệnh tiêu chảy, mất nước trầm trọng.
Campylobacter là vi khuẩn có hại và gây ra một dạng phổ biến của ngộ độc thực
phẩm ở trẻ em. Nó cũng có thể ảnh hưởng đến người lớn, nhưng ở mức độ thấp hơn
nhiều.

08DSH2 Trang 7
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

1.7.2 Các triệu trứng khi nhiễm Campylobacter

Vi khuẩn Campylobacter gây ra các bệnh về đường ruột với các triệu chứng bệnh
như sau: Tiêu chảy, đau bụng, mệt mỏi, sốt, buồn nôn và nôn. Thời kỳ ủ bệnh có thể từ 2-
5 ngày, cũng có thể là từ 1-10 ngày tùy theo thể trạng của từng người. Phân của người
bệnh lỏng, có nhiều máu hoặc không rơ, lẫn với chất nhày và có bạch cầu. Ở các nước phát
triển, trẻ dưới 5 tuổi và thiếu niên có tỷ lệ mắc cao nhất, còn ở các nước đang phát triển,
đối tượng chủ yếu là trẻ dưới 2 tuổi, người ta cho rằng sự gần gũi của trẻ với các dạng vật
nuôi và kháng thể chưa phát triển hoàn thiện là điều kiện khiến trẻ dễ bị nhiễm bệnh.
1.8 Các biện pháp phòng và xử lý bệnh
1.8.1 Phòng ngừa:
Hiện nay chưa có vaccin phòng bệnh ,vì vậy phòng bệnh chung giống như đối với
các bệnh đường ruột khác: vệ sinh môi trường, vệ sinh hoàn cảnh, vệ sinh an toàn thực
phẩm, quản lý phân và chất thải của người bệnh.
Cần ăn chín, uống nước sôi, nấu chín kỹ các thức ăn có nguồn gốc từ gia cầm, chỉ
uống sữa đã tiệt khuẩn, tránh để thức ăn bị nhiễm bẩn lại sau khi đã nấu chín. Nếu gia
cầm, gia súc nuôi mắc bệnh cần phải được điều trị kháng sinh, người tiếp xúc nên mặc
quần áo bảo hộ, đi giày dép vào chuồng trại. Khi vật nuôi bị ốm vì bất cứ nguyên nhân gì
cũng không nên cho trẻ ôm ấp, gần gũi chúng. Nên thực hiện nghiêm chỉnh yêu cầu bàn
tay sạch, rửa tay trước khi ăn và sau khi đi vệ sinh bằng xà phòng tiệt khuẩn. Các chất
thải của người và gia cầm, gia súc, vật nuôi phải được tập trung ở những khu cách ly với
nơi sinh sống, không chỉ để tránh phát tán các vi khuẩn gây viêm ruột mà còn nhiều bệnh
truyền nhiễm khác.
1.8.2 Điều trị:
Đây là bệnh do nhiễm khuẩn vì vậy sử dụng kháng sinh là biện pháp quan trọng.
Ethyromycin, tetracyclin, quinolon có thể được sử dụng để điều trị. Những trường hợp
tiêu chảy nhiều sẽ có chỉ định bù nước và điện giải.
Ngoài việc điều trị các triệu chứng tùy theo thể bệnh .Việc dùng kháng sinh nên
dựa vào kết quả kháng sinh đồ đề có sự tham khảo cần thiết cho điều trị
Campylobacteriosis bởi vì theo một số nghiên cứu gần đây đã thấy xuất hiện

08DSH2 Trang 8
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

Campylobacter kháng lại ciprofloxacin, tetracycline , erythromycin. Địa phương nào

chưa có điều kiệm làm kỹ thuật kháng sinh đồ thì cẩn phải dựa vào các phác đồ hướng
dẫn điều trị của bộ y tế.

08DSH2 Trang 9
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

2.1 Phương pháp truyền thống (phương pháp nuôi cấy)

2.1.1 Phạm vi áp dụng
Phát hiện ô nhiễm Campylobacter trong các sản phẩm thực phẩm tươi sống
và thực phẩm chế biến sẵn.
2.1.2 Nguyên lý
Phân lập và xác định Campylobacter nuôi cấy trên môi trường chọn lọc
trong môi trường vi hiếu khí ở 42oC bằng các thử nghiệm sinh hoá học đặc trưng.
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, môi trường và thuốc
2.1.3.1 Dụng cụ, thiết bị chính:
- Tủ ấm 420C
- Máy đồng nhất mẫu
- Bình nuôi cấy kị khí
- Túi tạo khí trường vi hiếu khí
- Túi đồng nhất mẫu có rãnh lọc
- Đĩa petri, Φ 90 – 110 mm

- Que cấy, đầu niken/crom hoặc platin

2.1.3.2 Môi trường:

- Canh thang Preston

- Thạch Charcoal cefoperazone desoxycholat (CCD)

- Thạch 5% máu bò (hoặc thỏ).

- Thành phần bổ sung vào môi trường cơ sở

- Thạch dinh dưỡng

08DSH2 Trang 10
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

2.1.3.3 Thuốc thử:

- Dung dịch ôxy già (H2O2 3%)

- Dung dịch Natri hippurat 1%c

- Dung dịch Ninhydrin 3,5%

- Dung dịch thử Oxydase

- Bộ thuốc nhuộm Gram

2.1.4 Chuẩn bị môi trường và mẫu thử

2.1.4.1 Chuẩn bị môi trường:

Canh thang tăng sinh, môi trường nuôi cấy chọn lọc được pha chế theo
công thức và hấp tiệt trùng.

2.1.4.2 Chuẩn bị mẫu thử:

Cân 25g thực phẩm, cắt nhỏ, xay nhuyễn hoặc đập bằng máy đập mẫu ở
điều kiện vô trùng trong 225 ml canh thang tăng sinh Preston cho tới khi được
thể đồng nhất.

Các điểm cần lưu ý:

• Đối với các loại thực phẩm đóng trong túi kín cần phải kiểm tra nhiều chỉ tiêu
vi sinh vật thì nên tiến hành kiểm tra trước đối với Campylobacter vì
Campylobacter rất nhậy cảm với không khí và điều kiện khô hanh.

• Đối với các loại thực phẩm có nhiều chất béo thì sau khi đồng nhất mẫu phải
lọc bằng gạc vô trùng gập nhiều lớp.

2.1.5 Tiến hành xác định

• Bước 1: Tăng sinh trong canh thang Preston

08DSH2 Trang 11
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

Thực phẩm đã đồng nhất trong canh thang Preston được để vào bình kị khí.
Sau đó cho túi tạo khí đã được chuẩn bị như hướng dẫn trong phần phụ lục II vào
bình và đậy nắp lại. Ủ trong điều kiện vi hiếu khí ở 420C từ 24 đến 48 giờ.

• Bước 2: Cấy chuyển sang môi trường thạch chọn lọc CCD

Cấy vào 2 đĩa thạch CCD, mỗi đĩa 1 ăng canh thang tăng sinh chọn lọc ở trên

Ủ trong điều kiện vi hiếu khí như ở bước 1 và để vào tủ ấm 42oC / 24 – 48giờ

* Nhận dạng:

Đọc kết quả sau 24-48 giờ.

Khuẩn lạc nghi ngờ là Campylobacter dẹt, bóng, thường mọc lan, có màu từ xám
kem nhạt đến xám xanh.

• Bước 3: Xác định hình thể vi khuẩn

Nhuộm Gram xác định hình thể vi khuẩn:

Là một bước rất quan trọng trong việc xác định Campylobacter vì vi khuẩn này
có hình dạng rất đặc trưng

Campylobacter là vi khuẩn Gram âm (bắt mầu đỏ), có hình lượn sóng hoặc
hình cánh chim. Trường hợp vi khuẩn nuôi cấy để quá 48 giờ và có sự tiếp xúc với
oxy không khí, Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu.

• Bước 4: Cấy chuyển sang môi trường thạch máu

Từ khuẩn lạc đã xác định hình thể trên thạch đĩa CCD, dùng que cấy ria sang
môi trường thạch 5% máu bò hoặc thỏ sao cho có thể tạo thành các khuẩn lạc
riêng rẽ. Nuôi cấy trong điều kiện vi hiếu khí ở 42 oC / 24 giờ để thử các tính chất
sinh vật hoá học ở bước 5.

• Bước 5: Thử tính chất sinh vật hoá học:

a) Phản ứng Catalase:

08DSH2 Trang 12
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

Nhỏ 1 giọt H2O2 (oxy già) 3% lên lam kính, dùng que cấy lấy khuẩn lạc
thuần nhất đặt vào giữa giọt H2O2. Nếu thấy sủi bọt là phản ứng dương tính.

b) Phản ứng Oxydase:

Đặt 1 tờ giấy lọc nhỏ lên lam kính . Dùng que thuỷ tinh hoặc que gỗ vô
trùng lấy 1 ít khuẩn lạc phết lên tờ giấy lọc. Nhỏ vài giọt thuốc thử Oxydase
lên, đọc kết quả trong 10 giây đầu.

Phản ứng dương tính: Xuất hiện màu tím xanh tại chỗ phết khuẩn lạc trên
tờ giấy lọc.

* Lưu ý:

Trước khi làm phản ứng nên thử lại thuốc thử với hai chủng vi khuẩn chuẩn
có Oxydase âm tính và Oxydase dương tính đã biết tuỳ theo từng phòng thí
nghiệm. Có thể dùng hai chủng chuẩn E.coli ATCC25922 (Oxydase âm),
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853(Oxydase dương)

c) Phản ứng thuỷ phân Natri hippurat: là phản ứng cần thiết để phân biệt
Campylobacter jejuni với các loài Campylobacter khác (khuyến khích áp
dụng).

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cho vào ống
nhựa 2 ml đã có dung dịch natri hippurat 1% chuẩn bị sẵn theo hướng dẫn ở
phần phụ lục I và nghiền đều cho đến khi dung dịch có màu sữa, đem ủ ấm ở
37oC / 2 giờ. Sau đó lấy ra cho từ từ 200 µ l dung dịch ninhydrin 3,5% bằng
cách chạm nhẹ pipet vào thành ống để lớp dung dịch này nổi ở bên trên. Ủ ấm
lần nữa ở 37oC trong 10 phút và lấy ra đọc kết quả.

Phản ứng dương tính: Xuất hiện màu tím sẫm hoặc xanh

Phản ứng âm tính: Không màu hoặc mầu xám

Tiêu chuẩn xác định Campylobacter:

- Campylobacter là vi khuẩn Gram âm (bắt mầu đỏ), có thể có hình lượn sóng hoặc

08DSH2 Trang 13
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

hình cánh chim.

- Catalase (+)

- Oxydase (+)
- Gr (-)
- Catalase (+)
Ngoài các tính chất trên, C. Jejuni được thử khẳng định bằng phản ứng thuỷ phân
natri hippurat (+)

Tính chất sinh vật hoá học của một số loài Campylobacter thường gặp
Loài C. jejuni C. Coli C. lari
P/ứng
Catalase + + +
Oxydase + + +
Thuỷ phân natri + - -
hippurat

08DSH2 Trang 14
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

SƠ ĐỒ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER TRONG THỰC PHẨM

Bước 1:
25 gam TP
225 ml CT Preston

KT vi hiếu khí
420C/ 24-48h

Bước 2:

Thạch CCD
KT vi hiếu
khí
Khuẩn lạc 420C /24 –
nghi ngờ 48h

Bước 3:

Nhuộm Gram xác định hình thể vi

khuẩn

Bước 4:
Thạch máu
KT vi hiếu khí /420C/24h
08DSH2 Trang 15
 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

Thử Oxydase
Thử Catalase T/p Hippurat

08DSH2 Trang 16

Test
TP
Hippocrate
Oxidase
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

2.2 Phương pháp hiện đại (PCR).

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, vật liệu và hóa chất.

2.2.2.1 Dụng cụ, thiết bị chính:

- Máy li tâm
- Máy luân nhiệt
- Thang DNA chuẩn
- Pipetman và đầu típ tương ứng
- Eppendorf
2.2.2.2 Vật liệu và hóa chất.
- Thành phần dung dich đệm cho phản ứng PCR gồm tris-HCl 20 mM, KCl 50
mM, MgCl2 3 mM, 0,01% gelatin, dNTP 0,1 mM, Taq polymerase, nước cất vô
trùng
- DNA xét nghiệm
- Agarose gel
- Dung dịch TBE
- Cặp mồi xuôi va mồi ngược.
- Canh khuẩn BHI
2.2.3 Chuẩn bị DNA xét nghiệm và phương pháp tiến hanh
2.2.3.1 Chuẩn bị DNA
Cho 30 ml dung dịch nước rửa quày thịt gà vào 30 ml môi trường tiền tăng sinh có
bổ sung 5% máu ngựa dung huyết, polymyxin B (10.000 IU/L), rifampicin (20 mg/L),
trimethoprim (20 mg/L), cycloheximide (0,2 mg/L) và trộn đều. Ủ canh khuẩn tiền tăng
sinh trong điều kiện vi hiếu khí (7 % O2, 10 % CO2 và 83 % N2) ở 420 C trong 24 giờ.
Ly trích DNA bằng cách lấy 1 ml canh khuẩn BHI, ly tâm, bỏ phần nước phiá trên, thêm
vào 500μl nước muối sinh lý, trộn đều và sốc nhiệt ở 1000C trong 3 phút và ly tâm 8000
vòng/phút trong 5 phút (Van de Giessen, 1998). Lấy 5ml phần nước trong ở phía trên là
nguồn DNA xét nghiệm.

08DSH2 Trang 17
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

2.2.3.2 Phương pháp tiến hành.

Thành phần PCR gồm tris-HCl 20 mM pH 8.3, KCl 50 mM, MgCl2 3 mM, 0,01%
gelatin, mỗi dNTP 0,1 mM, 1 UI Taq polymerase, mỗi đoạn mồi 50 pmol, 5 μl DNA xét
nghiệm và thêm nước cất hai lần vừa đủ 25 μl. Phản ứng được thực hiện với máy luân
nhiệt Perkin Elmer DNA.
Giai đoạn biến tính ở 94 oC trong 5 phút,2 chu kỳ (biến tính 94 oC/2 phút)
- Làm đứt mạch liên kết hydrogen, hai sợi DNA tách rời
đoạn ủ bắt cặp ở 64 oC/1 phút
- Mồi bắt cặp mạch đơn DNA khuôn ở đầu 3’
Giai đoạn kéo dài chuỗi 72 oC/1 phút. Thích hợp cho hoạt động của
DNA polymerase
- DNA polymerase xúc tác gắn nucleotid vào cuối đoạn mồi
Từ chu kỳ thứ 3 đến 18, cứ mỗi 2 chu kỳ liên tiếp có nhiệt độ ủ bắt cặp
giảm 1 oC (từ 62 oC đến 58 0C) và 30 chu kỳ tiếp theo (94 oC/1 phút, 54oC/1
phút và 72 oC/ 1 phút).
Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1,6%. Gel được ngâm trong dung dịch
TBE có 1% ethidium bromide khoảng 30 phút. Kết quả được đọc dưới ánh sáng UV. Xác
định loài Campylobacter dựa vào kích thước sản phẩm khuếch đại và thang DNA chuẩn
(ladder). C. jejuni là băng có kích thước 362 bp, C. coli là băng có kích thước 773 bp
Bảng 1. Trình tự của các đoạn mồi để xác định C. jejuni và C. coli (Van de
Giessen, 1998)
Đoạn mồi Trình tự Kích cỡ (bp)
Primer COL1 5’ - AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC- 3’ 773
Primer COL2 5’- TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC- 3’
Primer JUN3 5’ - CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT- 3’
362
5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC-
Primer JUN4
3’

08DSH2 Trang 18
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

287

Hình 1 cho thấy gel PCR phát hiện các mảnh 287-bp (mũi tên) của
C. jejuni MAPA gen trong các trường hợp viêm ruột thừa cấp tính.

08DSH2 Trang 19
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Trong thời buổi hiện đại như hiện nay, sự toàn cầu hóa nhanh chóng của ngành
chế biến và công nghệ thực phẩm đã khiến gia tăng nguy cơ nhiễm độc thực phẩm. Nhiều
vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra trong một cộng đồng nhỏ có thể lan rộng ra phạm vi toàn
cầu. Các nhà chức trách về an toàn thực phẩm trên thế giới phải đảm bảo rằng không
những giải quyết khâu an toàn thực phẩm ở tầm quốc gia mà còn phải liên kết và hợp tác
hành động cùng các nhà chức trách phạm vi quốc tế. Điều này rất quan trọng để trao đổi
thông tin thường xuyên về vấn đề an toàn thực phẩm và để nhanh chóng đánh giá các
thông tin trong trường hợp khẩn cấp về an toàn thực phẩm.
Campylobacter là loài vi khuẩn cấp tính đường ruột cho con người và động vật,
con đường truyền nhiễm chủ yếu là qua con đường ăn uống không đảm bảo vệ sinh. Vậy
để ngăn ngừa và phòng trừ bệnh thì thực phẩm tiêu dùng phải đảm bảo vệ sinh an toàn,
phải qua kiểm nghiệm tránh tiêu thụ các loại thục phẩm không rõ nguồn gốc, chế biến và
bảo quản không hợp vệ sinh.
Các cơ quan thẩm quyền cần phát triển mạnh mẽ hơn công tác điều tra kiểm
nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm ở nhiều khu vực như: xí nghiệp, chợ, nhà hàng, …và
phải có hình thức xử phạt hợp lý cho những nơi vi pham.
Khi cơ thể có những biểu hiện khác thường( ngộ độc, tiêu chảy, …) cần đưa gấp
đến cơ sơ y tế để được điều trị kip thời.

08DSH2 Trang 20
Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS. Phạm Minh Nhật

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C6%A1_ch%E1%BA%BF_%C4%91%E1%BB%99c_l
%E1%BB%B1c_c%E1%BB%A7a_vi_khu%E1%BA%A9n

[2] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15373879

[3] http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/genus.cgi?Genus=Campylobacter

[4] http://en.wikipedia.org/wiki/Campylobacter

[5] BÀI GIẢNG MÔN HỌC VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM (Nguyễn Thanh Thủy
Khoa Công nghệ thực phẩm)

[6] NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT - Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 2
và 3/2005 Đại học Nông Lâm Tp. HCM - CAMPYLOBACTER TRÊN QUÀY THỊT
GÀ TẠI LÒ GIẾT MỔ GIA CẦM Ở THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - Võ Ngọc Bảo,
Nguyễn Ngọc Diễn, R. Fries, Trạm chẩn đoán Xét nghiệm và Điều trị, Chi cục Thú y Tp.
Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh Thịt và Công nghệ Chế biến, Đại học Freie Berlin, Cộng hoà
Liên bang Đức, Khoa Chăn nuôi Thú Y, Đại học Nông Lâm Tp. HCM

[7] THƯỜNG QUY KỸ THUẬT - PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER

TRONG THỰC PHẨM (52 TCN - TQTP 0014 : 2006 do Viện Dinh dưỡng
biên soạn, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm đề nghị, Bộ trưởng Bộ Y tế ban
hành)

08DSH2 Trang 21