Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

I- GIỚI THIỆU

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học
và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều
nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.

Ngoài số enzyme đa được sử dụng rộng rãi và lâu đời( amylaza, prôtêaza…), còn
có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế.

Trước đây, các enzyme dùng nghiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất, thường thu
nhận từ động vật, thực vật. Nhưng vài chục năm gần đây, người ta đã chú ý đến
một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền, đó là nguồn enzyme từ vi sinh
vật. Thực ra đây là một nguồn enzyme rất quen thuộc đối với một số nước phương
đông( Trung Quốc, Nhật Bản…).

Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế ở nước ta và đáp ứng yêu cầu của
một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên
cứu tách và chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, nghiên cứu các điều
kiện thích hợp cho việc tổng hợp mạnh mẽ enzyme của chúng, thu nhận chế phẩm
enzyme .

Các protease khá phổ biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên sự phân
bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô, các cơ quan khác nhau. Một số
loài, cơ quan và mô của động thực vật có chứa một hay một số protesae nhất định
có thể dùng làm nguồn nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng.

Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở
trong tế bào( protease nội bào ) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy( protease
ngoại bào ). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều so
với protease nội bào.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 1
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Một số protease ngoại bào đã sản xuất trong quy mô công nghiệp và được sử dụng
rộng rãi trong nhiều ngành kĩ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và trong y học.

Trong bài này chúng tôi xin giới thiệu một phương pháp tách chiết enzyme
prôtêaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.

II- CHUẨN BỊ GIỐNG – TẠO SINH KHỐI

2.1. Phân lập giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae.

Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình
này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của 2
quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện thì
khác nhau hoàn toàn.

Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV. Tự
tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các VSV và
vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng đều về
chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không được kiểm soát,
bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn
định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất.

Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống
VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu
nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang
tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá
trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện .

2.1.1. Vai trò của giống trong công nghệ enzyme.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 2
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:

- Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
- Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt
tính enzyme).
- Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
- Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm.

Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV.

2.1.2. Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme.

Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản
xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ
enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:

- Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có
số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi
chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ
thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp
nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống
VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các
sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.
- Giống phải cho năng suất sinh học cao.
- Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều
kiện sản xuất công nghiệp.
- Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại
địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.
- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 3
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng tách
sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.
- Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản.

 Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men
công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết.

2.1.3. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.

Aspergillus oryzae

Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang
khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh,
chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều
bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng
thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào
tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía
đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những
tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân
chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của
Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 4
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào
( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu,
trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã
bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc,
có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị
gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.

2.1.4. Quá trình phân lập giống VSV.

VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có địa
thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ, những nơi
nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thế người, động
vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ cao. VSV có khả năng
thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà
VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất.

Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3 cách
phân lập:

+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng

Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho
phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt. Sau
đây là 1 số ưu điểm:

a. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 5
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần
phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ
chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều này thì không
thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất công nghiệp ) với
một loại enzyme thật sự mạnh.

Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng loạt
các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên VSV bắt
buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn.

Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt
đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự
nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã quá quen thuộc với
sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng ta đưa chúng vào điều
kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài
VSV giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp.
Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần
thiết.

Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung
ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và đặc điểm này để chúng ta
có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta
cần.

Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase cao, ta phải
tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV có khả
năng sinh tổng hợp protease ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều protein trong tự
nhiên.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 6
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV trong
điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến. Những đột biến
thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ hai là nhiều đột biến
tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao. Việc tìm ra những đột
biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành. Và một lợi điểm nữa là,
những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững. Rất thích hợp để đưa vào sản
xuất ở qui mô công nghiệp.

b. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất.

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều
kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản
xuất thử, thí nghiệm.

Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được
chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn
hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.

Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước
thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu nhận
được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao.

c. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng.

Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất nhiều
tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hoá.
Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt.

2.2. Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 7
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Ở
nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme protease này
là protein. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung
cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và
hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập
giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung
một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm.

Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát
đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ
sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nyclon và mang
về phòng thí nghiệm.

Tiến hành thí nghiệm phân lập:

Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây.

Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô
trùng sau đó đảo trộn mẫu.

Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác có
chứa 90ml nước cất vô trùng.

Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo.

Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc
phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar).

Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ
phòng trong vòng 3 ngày.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 8
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện
những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc.

Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác
dụng là chất chỉ thị cho tinh bột.

Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng
với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong
máy làm đông.

Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ).

Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm.

Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù.

Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi
trường sinh trưởng của nấm.

KH2PO4 1,4 MgSO4.7H2O 0,1

NH4NO3 10 FeSO4.7H2O 0,01 PH = 6,5

KCl 0,5 hồ tinh bột 20

Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi
Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem
ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân giống
thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả cao
cho nấm mốc giống ta cần có những phương pháp bảo quản thích hợp.

III: CÔNG NGHỆ LÊN MEN TẠO ENZYME PROTEASE

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 9
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

3.1. Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt

Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo
phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để
thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh
và một số quá trình lên men truyền thống.

3.1.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển
trên bề mặt môi trường. Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt là:

- Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không
phức tạp.
- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất
nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong
giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh
trở lại.
- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV,
enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc
vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn
kém.
- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường
đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta
chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực
khác sẽ hoàn toàn được an toàn.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc phục
và hoàn thiện dần phương pháp này. Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 10
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này
VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn)
nên rất cần nhiều diện tích.

a. Môi trường lỏng.

Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc
ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử dụng
chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình
tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào
dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV.

Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề
mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều
rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện
trong thao tác.

Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi
trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng
ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất
dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao.

Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có
chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.

b.Môi trường đặc.

Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người
ta thường sử dụng môi trường đặc. Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào
trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi
trường.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 11
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh
dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các
enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội
bào nằm trong sinh khối VSV.

VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi
trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi
trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và
vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không
khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ
không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm
khoảng 55-65% W là hợp lý.

Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người
ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không
khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi
trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae.

3.2. Sản xuất nấm mốc giống – nuôi cấy tạo sinh khối.

3.2.1. Môi trường cho sản xuất mốc giống:

dùng môi trường tổng hợp

Môi trường Benhamin.

Bột ngô 20g

Glucose 10g

Pepton 10g

Cao Nấm men 4g

Nước 1000ml

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 12
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

3.2.2. Chuẩn bị mốc giống.

Nuôi cấy giồng bao gồm:

Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm.

Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ).

Trên sàng, khay (nhân giống lớn).

3.2.3. Nuôi cấy tạo sinh khối .

Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển
những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác. Yêu cầu ống
giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV
nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng.

Tiếp tục nhân giống và nuôi cấy cho đến khi đạt được sinh khối theo mong muốn.

3.3. Thu nhận enzym protease từ nấm mốc Aspergillus Oryzae.

3.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp protease từ nấm.

Khi nuôi VSV tạo protease có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình
tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi
trường.

Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp protease tiến hành song song với quá trình
sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối.
Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme protease kết thúc ở pha logarit cùng
đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp theo
sau.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 13
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành protease cực đại thường xảy
ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh
trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme protease trong canh
trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực
lớn.

3.3.2.Qui trình thu nhận enzyme protease.

Nuôi cấy

Thu nhận phế phẩm Chế phẩm ezyme thô

enzyme thô đem sử dụng

Chế phẩm enzyme thô

đem tinh chế

Nghiền mịn

Trích ly

Lọc Bã Dùng trong chăn nuôi

Kết tủa enzyme Cồn hoặc Sulfat amon

Thu nhận kết tủa

Sử dụng chế phẩm

Sấy kế tủa ezyme tinh sạch

Tinh chế kết tủa

Thu nhận chế phẩm

enzyme tinh khiết

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 14
Enzyme tinh khiết
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Thuyết minh qui trình:

Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với
chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá
đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng
nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích
hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh
hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển.

Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán
rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến
toàn bộ khối môi trường.

Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ
thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc
vào điệu kiện nuôi cấy.

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương
pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở
giai đoạn này có những thay đổi sau:

-Nhiệt độ tăng rất chậm.

-Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.

-Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.

-Khối môi trường còn rời rạc.

-Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 15
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không
được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ.

Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay
đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát
triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt
môi trường trong lòng môi trường.

- Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám
bằng mắt thường.

- Môi trường được kết lại khá chặt.

- Độ ẩm môi trường giảm dần.

- Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C.

- Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.

- Enzym protease được tổng hợp mạnh.

-Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần
phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30 0C là tốt
nhất.

Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi
cơ bản như sau:

-Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại.

-Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường
xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy
trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzym

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 16
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

protease tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để
thu nhận enzym rất cần thiết.

Thu nhận sản phẩm:

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym protease, chế phẩm
này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn
chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường).

Để đảm bảo cho chế phẩm enzym protease không bị mất hoạt tính nhanh người ta
thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở
đây là máy sấy chân không- có thể xem ở phần phụ lục). Độ ẩm cần đạt được sau
khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzym
không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-400C. Enzym protease ở nấm
mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70 độ C.

Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải
quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm
sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau:

Toàn bộ khối lượng enzym thô protease được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của qúa
trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm
thô. Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào
sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzym protease ngoại bào khi được tổng
hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta
nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn.

Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp
này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ
không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 17
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC
để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV.

Trích ly:

Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym protease. Các loại
enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như
một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần
nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia
súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới
cho gia súc ăn).

Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các
chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách
enzym ra khỏi vật chất này.

Quá trình kết tủa enzym protease:

Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây
tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sunfat amon.
Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác.

Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả
những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa
enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính.

Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau:
Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon.

Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau
đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-7OC) theo thời gian, các

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 18
 Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật

enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu
nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W).

Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người
ta sấy kết tủa enzyn protease ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W
( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương – có thể xem ở phần phụ lục).

Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn
chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym ta quan
tâm.

II.Kết luận

Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày
càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau. Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và
các năm đầu của thế kỷ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng. Ở Việt Nam
bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản,
thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công
nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách
khoa Hà Nội…). Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp
cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ. Ví dụ, chế phẩm enzyme mới
ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng
suất cây trồng. Đã có các nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất rượu bia,
rút ngắn thời kỳ lên men cũng như sản xuất nước mắm ngắn ngày bằng công nghệ
enzyme protease.

Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 19