ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG
--------------------------

BÀI GIẢNG:

CÔNG NGHỆ HOÁ SINH

Người soạn: ThS. Trịnh Đình Khá

THÁI NGUYÊN - 2010

 CHƯƠNG 1
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH VÀ KHÁNG SINH BÁN
TỔNG HỢP

1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH

2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁN SINH PENICILLIN

3. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT β-LACTAM BÁN TỔNG HỢP

 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH
1.1. LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU
Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để
mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên
động vật nhiễm bệnh.
Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tính
tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng.
Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus
subtilis có liên quan đến quá trình hình thành loài bào tử.
Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng điều
trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn và ông là người đầu tiên
xây dựng hoàn thiện phương pháp tìm kiếm và phát hiện vi sinh vật sinh tổng hợp
chất kháng sinh trong tự nhiên.
Năm 1929 thuật ngữ “chất kháng sinh” mới được Alexander Fleming mô tả một cách
đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về penicillin
Năm 1931, các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên
men bề mặt. Năm 1938 ở Oxford, Ernst Boris Chain và Howara Walter Florey đã tiếp tục triển khai
nghiên cứu này. các ông đã tinh chế được một lượng lớn penicillin (1939) đủ để thử nghiệm trên
các loạt động vật thí nghiệm. Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên
chuột và chính thức được dùng điều trị thành công trên người (1941) trong nỗ lực cuối cùng nhằm
cứu sống các thương binh bị nhiễm khuẩn nặng trong chiến tranh thế giới thứ hai.
Trong thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc của ngành công nghệ sản
xuất chất kháng sinh non trẻ như:
* Khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh như: griseofulvin (1939), gramicidin S (1942), streptomycin
(1943), bacitracin (1945), chloramphenicol và polymycin (1947), clotetracyclin và cephalosporin
(1948), neomycin (1949), oxytetracyclin và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954),
vancomycin (1956), kanamycin và rifamycin (1957),...
* Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến đã tạo ra những biến chủng công
nghiệp có năng lực “siêu tổng hợp” các chất kháng sinh cao gấp hàng vạn lần các chủng ban đầu.
* Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công nghiệp để sản xuất penicillin G
(1942) và hoàn thiện công nghệ lên men này trên những sản phẩm khác trong những năm tiếp
theo.
* Năm 1959, phát hiện và tinh chế sử dụng thành công 6-aminopenicillinic acid (6APA) làm nguyên liệu
để sản xuất các chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp
 1.2. KHÁI NIỆM CHẤT KHÁNG SINH
• Theo các nhà sinh học, kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật
tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một
nhóm vi sinh vật xác định hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp.
• Còn các nhà hoá học thì muốn định nghĩa kháng sinh sinh phải bao hàm cả
các chất tổng hợp bằng hoá học có tác dụng diệt khuẩn như các chất thuộc

quinolon.

“Chất kháng sinh (antibiotic) là các chất hoá học xác định, không
có bản chất enzyme, có nguồn gốc sinh học với đặc tính ngay ở
nồng độ thấp có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được
các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo được an toàn cho người
hay động vật được điều trị”.
 Tên kháng sinh Vi sinh vật sản xuất kháng sinh Hoạt phổ
Penicillin Penicillium chrysogenum Kháng khuẩn
Steptomycin Str. griseus Kháng khuẩn
Tetracyclin Str. aureofaciens Kháng khuẩn
Chloramphenicol Str. venezuela Kháng khuẩn
Oxytetracyclin Str. rimosus Kháng khuẩn
Cephalosporin Cephalosporium acremonium Kháng khuẩn
Actinomycin D Str. antibioticus Kháng ung thư
Bleomycin Str. verticillum Kháng ung thư
Daunorubicin Str. peuceticus Kháng ung thư
Mitomycin C Streptomyces sp. Kháng ung thư
Kanamycin Str. kanamyceticus Kháng khuẩn
Nystatin Str. noursei Kháng nấm
Fumagillin A. fumigatus Kháng protozoa
Griseofulvin P. griseofulvum Kháng nấm
Nistin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm
Natamycin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm
Rifamycin Nocardia sp. Kháng lao
Polymycin B Bacillus polymyxa Kháng khuẩn
Gentamycin Micromonospora sp. Kháng khuẩn
 1.3. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH
• Làm rối loạn cấu trúc thành tế bào
• Rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào
chất
• Làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein
• Rối loạn quá trình tổng hợp DNA
• Hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển
hoá trao đổi chất.

Đánh giá hiệu quả ứng dụng của chất kháng sinh:

• hoạt tính kháng sinh đặc hiệu, phổ kháng sinh

• đáp ứng phản hồi của mầm bệnh đối với kháng sinh đó

• phản ứng phụ của thuốc, đường cấp thuốc

• sự chuyển hoá thuốc trong cơ thể bệnh nhân, đường hướng đào thải thuốc

• tương tác qua lại giữa các loại thuốc khi sử dụng phối hợp.
 1.4. CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA CHẤT KHÁNG SINH

• Việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh

tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay

kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển

trong hệ sinh thái cục bộ đó.

• Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho

khả năng sống sót cao cho chủng vi sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên,

nhất là đối với các loài có bào tử.

 1.5. ĐIỀU CHỈNH SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH
• Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh
• Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành
quá trình lên men.

1.5.1. Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng
hợp chất kháng sinh
Trải qua 6 giai đoạn cơ bản:
• Phân lập từ tự nhiên
• Nghiên cứu xử lý tạo các biến chủng siêu tổng hợp có hoạt lực cao
• Tuyển chọn sơ bộ
• Tuyển chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm
• Thử nghiệm và tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot
• Thử nghiệm và chọn lọc lại các chủng phù hợp với điều kiện lên men
sản xuất lớn công nghiệp.
1.5.2. Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá
trình lên men

• nguồn cacbon thường được lựa chọn là: các loại bột và hạt ngũ cốc, cám
mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, các loại đường, dextrin, glyxerin, axit
axetic, dịch thuỷ phân gỗ,...

• Nguồn nitơ có thể là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước
chiết nấm men, pepton, các loại muối vô cơ chứa nitơ,...

• Các nguyên tố khoáng đa lượng như: P, S, Mg, Fe, Ca, K, Na. Các nguyên tố
vi lượng như: Cu, Zn, Co, Mo,... và các chất kích thích sinh trưởng.

• Khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố khác trong môi trường
như: nhiệt độ lên men tối ưu, pH, nồng độ oxy, thế oxy hoá - khử,
cường độ sục khí, cường độ khuấy trộn dịch lên men,...
 1.6. CÁC BƯỚC CƠ BẢN TẠO CHẤT KHÁNG SINH DÙNG TRONG Y HỌC

Bước 1: Phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh dưới dạng thuần khiết. Chọn lọc chủng có
hoạt phổ kháng sinh mong muốn. Định tên chủng vi sinh vật tuyển chọn được.
Bước 2: Nuôi cấy vi sinh vật sinh kháng sinh trong thiết bị lên men dung tích từ 5 – 100 lít.
Chiết xuất, tinh chế để thu kháng sinh tinh khiết, xác định cấu trúc hoá học, thử sơ bộ về
độc tính và một vài hằng số lý hoá của kháng sinh tìm được.
Bước 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật sinh kháng sinh, tìm môi
trường tối ưu để nuôi cấy. Đột biến cải tạo giống bằng kỹ thuật di truyền cổ điển và kỹ
thuật gen để thu được chủng giống có năng suất cao, ổn định.
Bước 4: Nghiên cứu dược lý của kháng sinh tìm được, tác dụng điều trị của kháng sinh
bằng cách gây bệnh thực nghiệm trên động vật thí nghiệm.
Bước 5: Nghiên cứu sản xuất kháng sinh trên qui mô công nghiệp bao gồm: môi trường lên
men, các thông số kỹ thuật của quá trình lên men, phương pháp chiết xuất và tinh chế để
đạt tiêu chuẩn dùng làm thuốc,...
Bước 6: Nghiên cứu kinh tế và thị trường
 1.7. PHƯƠNG HƯỚNG PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG
SINH
• Nghiên cứu sản xuất thêm các chế phẩm bán tổng hợp, mở rộng phổ điều trị và mang lại các
đặc tính ưu việt hơn. Nghiên cứu các hoạt tính mới của kháng sinh như: kháng nấm, kháng
virus, kháng sinh có khả năng kìm hãm sự phát triển của các khối u,...
• Hoàn thiện các phương pháp phân lập, tuyển chọn, tạo các biến chủng siêu tổng hợp, điều
chỉnh đường hướng các quá trình trao đổi chất và đường hướng quá trình lên men, áp dụng
các công nghệ tách chiết và tinh chế mới, hoàn thiện và áp dụng các kỹ thuật phân tích hiện
đại (đặc biệt là kỹ thuật “in vivo assay systems”),... để triển khai sản xuất công nghiệp các
chất kháng sinh.
• Tiếp tục tìm kiếm phát hiện các chất kháng sinh mới, bao gồm cả mở rộng tìm kiếm phát hiện
khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh sang các nhóm sinh vật khác
• Sản xuất các chế phẩm điều trị với sự phối hợp nhiều loại thuốc, mở rộng khả năng ứng dụng
và điều trị của các chất kháng sinh đã biết; đồng thời góp phần làm giảm nguy cơ kháng
thuốc và hạn chế bớt các hiệu ứng không mong muốn của mỗi chất kháng sinh.
• Mở rộng thêm khả năng ứng dụng các chất kháng sinh vào các lĩnh vực kinh tế và khoa học
khác như: ứng dụng trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, nông nghiệp, bảo vệ môi trường,
nghiên cứu khoa học,...
 2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN
2.1. GIỚI THIỆU KHÁNG SINH PENICILLIN

β-lactam Penam

Hình 1.1. Cấu trúc vòng β-lactam và khung penam

Hình 1.2. Cấu trúc của penicillin

 Bảng 1.3. Cấu trúc phân tử của một số penicillin tự nhiên

Gốc R Tên gọi gốc Tên penicillin

C6H5-CH2- Benzylpenicillin Penicillin G

C6H5-O-CH2- Phenooxymethylpenicillin Penicillin V

CH­3-CH2-CH=CH-CH2- 2-pentenylpenicillin Penicillin F

CH3-(CH2)4- n-amylpenicillin Dihydropenicillin F

CH3-(CH2)6- Hepthylpenicillin Penicillin K

HOOC-(NH2)CH(CH2)3- 1-amino-1-carboxyl- Penicillin N

buthylpenicillin
HO-C6H5-CH2- p-hydroxybenzylpenicillin Penicillin X
Cơ chế tác dụng của họ kháng sinh β-
lactam
 Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn?

Gram dương Gram âm

Cơ chế tác dụng
 2.2. CƠ CHẾ SINH TỔNG HỢP PENICILLIN Ở NẤM MỐC P.
CHRYSOGENUM
O O OH
H2N CH C OH
H2N CH C OH O C CH3
(CH2)3
CH2 CH CH CH3
C O
OH SH NH2
axit aminoadipic Cystein Valin

H 2N
SH
CH (CH2)3 CONH

HOOC
N
O
aminoadipyl- cystein - valin

H 2N

CH (CH 2)3 CONH

S (H­íng 2)
HOOC Penicillin N
Isopenicillin N N
O
COOH

axit aminoadipic 3 (H Phenylacetic acid

ng ­í
­í ng
H 1)
H2N
RCONH
S
S

N
N
O
COOH O
COOH
6-APA Benzylpenicillin
(6 amino penicillinic acid) (Penicillin G)

Hình 1.3. Sơ đồ cơ chế tổng hợp penicilin ở nấm mốc P. chrysogenum

 2.3. QUY TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG
NGHIỆP

2.3.1. Đặc điểm chung

Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan) thì toàn bộ

dây chuyền sản xuất penicillin có thể phân chia làm 4 công đoạn chính

như sau:

• Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc G).

• Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên.

• Sản xuất các penicillin bán tổng hợp

• Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại
2.3.2. Chuẩn bị lên men
a. Giống, bảo quản và nhân giống cho sản xuất
• Giống công nghiệp P. chrysogenum được bảo quản lâu dài ở dạng đông

khô, bảo quản siêu lạnh ở -70oC hoặc bảo quản trong nitơ lỏng.

• Giống từ môi trường bảo quản được cấy chuyền ra môi trường thạch hộp

để hoạt hoá và thu bào tử. Dịch huyền phù bào tử được cấy chuyền tiếp

sang môi trường bình tam giác, rồi thiết bị nhân giống nhỏ, thiết bị nhân

giống trung gian,... và cuối cùng trên thiết bị nhân giống sản xuất.
b. Chuẩn bị môi trường và thiết bị lên men

 Các thành phần môi trường thường được cân đong rồi pha chế riêng rẽ

trong các thùng chứa phù hợp, sau đó thanh trùng gián đoạn ở 121oC (hay

thanh trùng liên tục ở khoảng 140-146oC) hoặc bằng phương pháp siêu

lọc rồi mới bơm vào trong thùng lên men.

 Thiết bị lên men trước khi đưa vào sử dụng phải được vô khuẩn, thường

được thanh trùng bằng hơi nước ở áp suất 2,5-3 at trong thời gian 1-3h.

Sau khi khử trùng xong thiết bị được đưa vào sử dụng ngay. Không khí

thường được khử khuẩn sơ bộ bằng nén đoạn nhiệt, sau đó được lọc khử

khuẩn bằng cách lọc qua màng vô khuẩn hoặc siêu lọc.
 Bảng 1.4. Thành phần môi trường lên men cơ bản để lên men sản xuất
penicilin

 Lactose 20-50 kg/m3

 Glucose 0-10 kg/m3, bổ sung gián đoạn hoặc liên tục trong quá trình lên
men
 Dịch chiết ngô cô đặc 15-50 kg/m3
 Các khoáng chất
NaNO3 0-5 kg/m3; Na2SO4 0-1 kg/m3; CaCO3 0-10 kg/m3; KH2PO4 0-4 kg/m3;
MgSO4.7H2O 0-0,25 kg/m3; MgSO4 0-0,02 kg/m3; ZnSO4 0-0,04 kg/m3
 Tiền chất tạo nhánh bổ sung liên tục theo nhu cầu. Theo lý thuyết nhu cầu
về phenylacetat là 0,47g/g penicilin G hoặc 0,5g phenooxyacetat/g
penicillin V
 Chất chống tạo bọt bổ sung liên tục theo nhu cầu
2.3.3. Kỹ thuật tiến hành lên men

• kỹ thuật lên men chìm được áp dụng trong hầu hết các cơ sở sản xuất penicillin và
thường được vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục gồm phương án
lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hoặc bán liên tục) một hay một vài
cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại một phần hệ sợi của mẻ lên men

trước.

• Quá trình lên men được vận hành theo hai pha. Pha đầu nuôi thu sinh khối
trong khoảng 2-3 ngày, pha sau lên men thu sản phẩm. Nhiệt độ lên men
pha đầu thường khống chế ở 30oC, pha sau từ 22-25oC. Tốc độ sục khí và
khuấy trộn được điều chỉnh để duy trì nồng độ oxy hoà tan khoảng 30%.
Dịch lên men ban đầu thường có pH khoảng 6,5-6,8; trong quá trình lên
men thường khống chế pH ổn định trong khoảng 6,2-6,8. Nồng độ NH4+
thường khống chế trong khoảng 0,3-0,4 kg/m3. Chất phá bọt thường sử
dụng là các loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng,... Thời
gian lên men mỗi mẻ thường kéo dài trong khoảng 144-180h.
2.4. XỬ LÝ DỊCH LÊN MEN, TINH CHẾ THU PENICILLIN 2.4.1. Lọc
dịch lên men
• Thông thường, chỉ cần tiến hành lọc một lần trên thiết bị lọc hút kiểu băng tải
hoặc kiểu thùng quay rồi làm lạnh dịch ngay chuyển sang công đoạn tiếp theo.
• Phần sinh khối nấm được rửa sạch, sấy khô và sử dụng để chế biến thức ăn gia

súc.

2.4.2. Trích ly
• Penicillin thường được trích ly ở dạng acid ra khỏi dịch lọc bằng dung môi
amylacetat hoặc butylacetat ở pH=2-2,5; nhiệt độ từ 0-3oC. Quá trình trích
ly được thực hiện trong thời gian rất ngắn. Dịch lọc được bơm trộn đồng
thời với dung dịch H2SO4 hoặc H3PO4 loãng có bổ sung thêm chất chống
tạo nhũ và bơm song song cùng với dung môi vào thiết bị trích ly.

• Tỷ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn trong khoảng 4-10V dịch lọc/1V dung
môi.
2.4.3. Tẩy màu
• Để tẩy màu người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa
penicillin sau trích ly. Chất hấp phụ phổ biến thường là than hoạt tính. Sau đó than
hoạt tính được tách và rửa lại bằng sử dụng thiết bị lọc kiểu băng tải hoặc thùng
quay. Phân than sau lọc tiến hành chưng thu hồi dung môi và xử lý hoàn nguyên
phục vụ cho mẻ lên men sau

2.4.4. Kết tinh, lọc, rửa và sấy thu penicillin tự nhiên

• Penicillin G hoặc V thường được kết tinh dưới dạng muối bằng cách bổ
sung trực tiếp vào dung môi sau khi tẩy màu một lượng nhỏ Kali acetat
hoặc Natri acetat hoặc tiến hành trích ly lại sang dung dịch KOH loãng rồi
tiến hành cô trong chân không ở nhiệt độ thấp. Sau đó bổ sung BuOH để
penicillin tự kết tinh.
• Sau khi kết tinh, tinh thể penicillin được lọc tách bằng máy lọc hút thùng
quay. Khi sản phẩm đã đạt độ tinh sạch theo yêu cầu (thường độ tinh khiết
không dưới 99,5%) tiến hành lọc tách tinh thể. Sau đó, rửa và làm khô sơ
bộ bằng dung môi kỵ nước như isopropanol hay butylalcohl, hút chân không
để tách dung môi và sấy bằng không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối
penicillin.
 3. SẢN XUẤT CÁC β-LACTAM BÁN TỔNG HỢP TỪ PENICILLIN G

3.1. NHU CẦU SẢN XUẤT CÁC PENICILLIN BÁN TỔNG HỢP
3.1.1. Tác dụng điều trị của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

Tác dụng điều trị chính của penicillin và các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam là do
cấu trúc của penicillin có nhiều điểm gần gũi với dipeptid D-analin-D-analin, một hợp
phần cấu trúc lớp peptidoglucan của thành tế bào. Do đó, hoạt tính các enzyme tham
gia tổng hợp thành tế bào bị biến đổi, các enzyme nhận nhầm cơ chất. Kết quả là
phần thành tế bào mới tổng hợp với sự nhầm lẫn sẽ không được hình thành, làm
cho thành tế bào của mầm bệnh chỉ có từng phần hoặc không có thành tế bào, dẫn
đến chúng dễ dàng bị tự phân trong môi trường và bị hệ thống miễn dịch của cơ thể
tiêu diệt.
Đồng thời, các kháng sinh β-lactam còn liên kết đặc hiệu với một số protein trên
màng tế bào chất. Sự liên kết này làm “bất hoạt” và “hoà tan” các protein đặc hiệu
trên màng, dẫn đến làm mất hoạt tính polymerase và ATPase. Ngoài ra, các nhà
khoa học còn phát hiện thấy ảnh hưởng của penicillin đến các chuyển hoá
phospholipid trong tế bào.
 3.1.2. Tại sao phải sản xuất kháng sinh bán tổng hợp
• Lý do 1: Nhiều trường hợp điều trị với penicillin đã xuất hiện hiện tượng kháng thuốc.
• Biến chủng E. coli gram âm và một số biến chủng B. subtilis kháng thuốc phát triển bình
thường trong môi trường chứa penicillin.
• Nguyên nhân của hiện tượng này?
• Để vô hiệu khả năng kháng thuốc, về nguyên lý có thể tiến hành như thế nào?
• Lý do 2: Trên phương diện điều trị.
• Trong từng trường hợp cụ thể người thầy thuốc mong muốn có những chế phẩm kháng
sinh tương ứng với những đặc tính khác nhau như: thuốc có phổ kháng khuẩn rộng hoặc
phổ kháng khuẩn hẹp hơn, thuốc bền với enzyme β-lactamase, thuốc dễ hấp thu, thuốc
ít phản ứng phụ, thuốc đào thải nhanh,... hay đối với bệnh nhân các loại thuốc có thể
uống thường an toàn và dễ được chấp nhận hơn. Do đó, luôn mong muốn tìm ra các chế
phẩm penicillin mới với đặc tính đa dạng và có khả năng chỉ định điều trị phong phú
hơn.
3.1.3. Nguyên tắc tạo kháng sinh mới

• nguyên tắc có thể hoàn thiện theo hướng lên men trực tiếp với các tiền chất

tạo nhánh khác nhau để thu kháng sinh mong muốn hoặc không sử dụng

tiền chất thu 6-APA làm nguyên liệu để tổng hợp các penicillin khác nhau.

• Con đường kinh tế hơn cả và được triển khai trong sản xuất lớn là chỉ lên

men trực tiếp thu penicillin G hoặc V làm nguyên liệu từ đó tổng hợp các

kháng sinh khác nhau bằng con đường bán tổng hợp.
 3.2. SẢN XUẤT 6-APA VÀ SẢN XUẤT PENICILLIN BÁN TỔNG HỢP

3.2.1. Sản xuất 6-APA

Hình 1.7. Công thức cấu tạo của 6-APA

Có hai con đường khác nhau để tổng hợp 6-APA

• Con đường thứ nhất tiến hành lên men nhưng không bổ sung tiền chất tạo
kháng sinh như sơ đồ hình 1.3.

• Con đường hiệu quả hơn cả hiện nay là lên men sản xuất penicillin G hoặc V;
sau đó áp dụng phương pháp hoá học hay sử dụng enzyme penicillin-acylase
để phân cắt mạch nhánh bên R.
 Con đường 1
O O OH
H2N CH C OH
H2N CH C OH O C CH3
(CH2)3
CH2 CH CH CH3
C O
OH SH NH2
axit aminoadipic Cystein Valin

H 2N
SH
CH (CH2)3 CONH

HOOC
N
O
aminoadipyl- cystein - valin

H 2N

CH (CH 2)3 CONH

S (H­íng 2)
HOOC Penicillin N
Isopenicillin N N
O
COOH

axit aminoadipic 3 (H Phenylacetic acid

ng ­í
­í ng
H 1)
H2N
RCONH
S
S

N
N
O
COOH O
COOH
6-APA Benzylpenicillin
(6 amino penicillinic acid) (Penicillin G)
 Con đường 2.1

C6H5CONH
S
PCl5
(CH3)3SiCl (2)
Penicillin G (1) N -400C
O
COOSi(CH3)3

C6H5CONH C6H5CONH
S S
(2) ROH (4)
(3)
N 0 N
-40 C
O O
COOSi(CH3)3 COOSi(CH3)3

H2N
S
H2O
(4) C6H5-CH2-COR +
N
O
COOH
6-APA
(6 amino penicillinic acid)

Hình 1.8. Sơ đồ tổng hợp 6-APA bằng con đường hoá học
 Con đường 2.2

Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp 6-APA bằng enzyme penicillin-acylase

3.2.2. Sản xuất penicillin bán tổng hợp

Bảng 1.5. Một số kháng sinh

penicillin bán tổng hợp
• Từ 6-APA có thể dễ dàng tạo ra được nhiều chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác
nhau bằng cả hai con đường: acyl hoá trực tiếp từ 6-APA theo phương pháp hoá
học hay sử dụng enzyme penicillin-acylase. Tuy nhiên trong thực tế thường áp

dụng phổ biến con đường acyl hoá trực tiếp theo phương pháp tổng hợp hoá học.

Ví dụ: Sản xuất Ampicillin bán tổng hợp từ 6-APA

Phương pháp A:
Phương pháp B:
 3.3. SẢN XUẤT CEPHALOSPORIN BÁN TỔNG HỢP
3.3.1. Giới thiệu cephalosporin

β-lactam Cephem
Hình 1.10. Công thức cấu tạo vòng β-lactam và khung cephem

Hình 1.11. Công thức cấu tạo chung của họ kháng sinh
cephalosporin và cephalosporin C
Công thức cấu tạo chung của họ kháng sinh
cephalosporin
Kháng tốt Gram (+), rất kém với Gram (-)

Tăng hoạt tính kháng Gram (-) nhưng

kém hơn thế hệ thứ 3

hoạt tính kháng Gram (+) kém nhưng

kháng được Enterobactericeae bao gồm
cả vi khuẩn sinh β-lactamase

Mở rộng hoạt tính kháng hơn thế hệ 3 và

bền với β-lactamase
3.3.2. Sản xuất cephalosporin
Tổng hợp 7-ACA?
Con đường
hóa học
Con đường
enzyme
Con đường Con đường
hóa học enzyme
Hình 1.12. Sơ đồ tổng hợp 7-ACA từ cephalosporin C
Từ 7-ACA nếu loại nhóm acetoxy ở nhóm thế C3 thì sẽ nhận được 7-amino deacetyl

cephalosporinic acid (7-ADCA) bằng phản ứng hydrogen hoá. Mặt khác từ 7-ADCA

bằng phản ứng brom hoá và acetyl hoá sẽ nhận được 7-ACA.
Từ 7-ACA và 7-ADCA bằng con đường hoá học đã tổng hợp được các kháng sinh
cephalosporin bán tổng hợp thế hệ 1, thế hệ 2 và thế hệ 3. Một số quy trình bán tổng
hợp các chất kháng sinh như sau:
 CHƯƠNG 2

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE

• 1. KHÁI NIỆM CHUNG VỀ VACCINE VÀ MIỄN DỊCH

• 2. HƯỚNG CHIẾN LƯỢC TẠO VACCINE VÀ PHÂN LOẠI

VACCINE

• 3. ĐẶC ĐIỂM CỦA MỘT SỐ LOẠI VACCINE

• 4. CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI

 1. KHÁI NIỆM CHUNG VỀ VACCINE VÀ MIỄN DỊCH

1.1. KHÁI NIỆM CHUNG

Yếu tố quyết định miễn dịch là gì?
Là thành phần protein đặc biệt có trên bề mặt của tác nhân gây bệnh hay
trên bề mặt của chế phẩm vaccine của chính tác nhân gây bệnh đó.

Thành phần này được gọi là kháng nguyên (antigen) do một gen hay một
số gen của vi sinh vật mã hoá quyết định tổng hợp lên. Những gen chịu
trách nhiệm tổng hợp thành phần protein có tính kích thích miễn dịch được
gọi là gen kháng nguyên.

Các loại hình miễn dịch?

• Miễn dịch dịch thể (humoral immunity)

• Miễn dịch qua trung gian tế bào (cellular mediated immunity).

Kháng thể là gì?

kháng thể (antibody) là một loại protein mới có chức năng bảo vệ
tạo nên miễn dịch cho cơ thể.

Bản chất kháng thể trong hai loại hình miễn dịch?

Trong miễn dịch dịch thể, kháng thể hoà tan vào hệ tuần hoàn
hay trong dịch cơ thể nên gọi là kháng thể thể dịch.

Trong miễn dịch qua trung gian tế bào thì kháng thể không phải
chất hoà tan mà chính là các tế bào của hệ miễn dịch cảm ứng
kháng nguyên mà thành – kháng thể tế bào. Chúng không phải
chất hoà tan mà là thành phần hữu hình.
Thế nào là vaccine?

“Vaccine là chế phẩm sinh học hoặc bán sinh học được con người

tạo ra và đưa vào cơ thể gây miễn dịch, tập dượt cho cơ thể thực

hiện quá trình đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh khi

trung xâm nhập vào những lần sau đó”.

1.2. TIÊU CHUẨN CỦA VACCINE VÀ QUÁ TRÌNH ĐÁP ỨNG MIỄN
DỊCH

Tiêu chuẩn vaccine?

An toàn là tiêu chuẩn đánh giá khi sử dụng vaccine trên đối tượng được
hưởng phải không được gây bệnh hay gây phản ứng có hại.

Vô trùng là vaccine chỉ chứa duy nhất một hay một vài loại được chọn làm
vaccine mà không bị nhiễm tạp các loại khác.

Hiệu lực là vaccine phải kích thích sinh miễn dịch cho cơ thể. Tính hiệu lực
thực chất là mức độ biểu hiện gây miễn dịch của kháng nguyên.
Đặc điểm quá trình đáp ứng miễm dịch của cơ thể?

Miễn dịch được tạo ra nhờ sự tham gia của hệ thống miễn dịch trung ương

và hệ thống miễn dịch ngoại biên cũng như nhiều loại tế bào có thẩm quyền

miễn dịch khác.

Hệ thống tuỷ xương tạo ra các loại tế bào nguồn, từ đó sinh ra các tế bào có

thẩm quyền miễn dịch: lympho B, lympho T, đại thực bào và một số tế bào

chuyên biệt khác.

Được hỗ trợ và tham gia của hạch, lách, các mô lympho đường ruột, đường

hô hấp cũng như tế bào tua và một số thành phần khác.

2. HƯỚNG CHIẾN LƯỢC TẠO VACCINE VÀ PHÂN LOẠI VACCINE

2.1. HƯỚNG CHIẾN LƯỢC TẠO VACCINE

Vaccine tạo nên theo công nghệ cổ truyền – vaccine cổ điển (classical
vaccine)
Vaccine tạo nên bằng công nghệ sinh học phân tử hay vaccine thế hệ
mới – vaccine công nghệ gen (genetically engineered vaccine).

2.2. PHÂN LOẠI

* Căn cứ vào tính chất sinh học của vaccine chia làm 3 loại:

- Vaccine vô hoạt bằng các yếu tố lý, hoá học.

- Vaccine sống: gồm vaccine vô độc và vacine nhược độc

- Vaccine phân tử: được tạo ra bằng kỹ thuật gen

* Căn cứ vào nguồn cung cấp kháng nguyên, xét dưới góc độ tạo
miễn dịch cho cơ thể chia làm 2 nhóm:

-Vaccine sống: bao gồm vaccine nhược độc, vaccine vô độc va vaccine

nguyên độc. Trong đó, vaccine nhược độc có thể thuộc loại: qua vật chủ

không cảm thụ, nhạy cảm nhiệt độ, thích ứng nhiệt độ thấp, xoá gen độc.

- Vaccine vô hoạt: bao gồm vaccine nguyên thể và vaccine phân tử.

Trong đó vaccine phân tử có thể được tinh chế từ nguồn vi sinh vật chủ

trong thiên nhiên; sản xuất, tinh chế bằng kỹ thuật gen; chứa protein tổng

hợp bằng kỹ thuật gen.

3. ĐẶC ĐIỂM CỦA MỘT SỐ LOẠI VACCINE
3.1. NHÓM VACCINE CUNG CẤP KHÁNG NGUYÊN SỐNG ĐƯỢC
NHÂN LÊN
3.1.1. Vaccine sống vô độc

Là các chủng vi sinh vật vô độc được chọn lọc từ trong quần thể vi sinh
vật có trong tự nhiên. Chúng hoàn toàn không còn hay chỉ còn tính gây
bệnh rất yếu đối với đối tượng được hưởng vaccine nhưng vẫn có khả
năng tạo miễn dịch rất tốt cho cơ thể.

3.1.2. Vaccine sống nguyên độc

Là loại vaccine chứa các chủng vi sinh vật có độc lực với loài này nhưng
an toàn hơn đối với loài khác. Thực chất là loại vaccine vô độc đối với
loài là đối tượng được hưởng vaccine. Tuy nhiên, chúng vẫn giữ nguyên
tính cường độc đối với loài thích ứng mà chủng vi sinh vật được phân lập
để làm vaccine.
3.1.3. Vaccine sống nhược độc
* Vaccine nhược độc tạo ra qua tác dụng lý hoá:

• Hướng thứ nhất: Vaccine có thể được tạo ra bằng cách dùng hoá chất để xử lý các

chủng vi sinh vật gây bệnh để làm vaccine. Tuy nhiên ngày nay loại vaccine này

không được sử dụng vì không đảm bảo tính an toàn.

• Hướng thứ hai: chọn lọc và xử lý những chủng nhạy cảm với nhiệt độ. Các chủng

này không hoặc khó tìm thấy điều kiện thích hợp ở các điều kiện nhiệt độ bất

thường, do đó dẫn đến sự thích ứng mất kảh năng gây bệnh nhưng vẫn còn tính

kích thích miễn dịch.

• Hướng thứ 3: Làm thích ứng một số chủng gây bệnh ở điều kiện nuôi cấy liên tục

với nhiệt độ thấp (25oC). Loại này được gọi là vaccine thích ứng điều kiện lạnh.
* Vaccine nhược độc tạo ra bằng phương pháp tiếp truyền cổ
điển (Vaccine sống nhược độc cổ điển):

• Phương pháp tiếp truyền cổ điển là phương pháp tiếp truyền chủng vi sinh vật

chọn làm vaccine qua môi trường không hoặc ít cảm thụ như tiếp truyền qua môi

trường tế bào, qua trứng có phôi hay ngay trên động vật không hoặc ít cảm thụ.

• Quá trình tiếp truyền thường được thực hiện từ hàng chục đến hàng trăm đời liên

tục trong môi trường không hoặc ít cảm thụ (môi trường không cung cấp điều kiện

tối ưu để thực hiện đầy đủ chu kì sống).

• các chủng vi sinh vật phải có sự biến đổi thích ứng dẫn đến sự thay đổi nhất định

trong hệ gen để biểu hiện tính gây bệnh.

* Vaccine sống, tái tổ hợp có vectơ dẫn truyền:

Là loại vaccine có 2 thành phần chính: một thành phần là đoạn DNA chứa
gen kháng nguyên đưa từ bên ngoài và một thành phần là bản thân hệ
gen của vectơ. Hệ gen của vectơ có nhiệm vụ tiếp nhận và biểu thị gen
kháng nguyên trong những điều kiện thuận lợi.

* Vaccine Nucleic acid

• Thực chất vaccine DNA chính là sự sử dụng DNA của plasmid tái tổ
hợp chứa gen kháng nguyên được lấy từ một vi sinh vật nào đó và được
ghép vào vectơ biểu hiện đã được thiết kế phù hợp.

• Vectơ tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào chủ thích ứng, sau đó tiến
hành nuôi cấy và tách chiết plasmid tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên.

• Khi sử dụng làm vaccine, người ta chỉ pha loãng plasmid tái tổ hợp có
chứa gen kháng nguyên và tiêm vào cơ thể.
 3.2. NHÓM VACCINE CÓ NGUỒN KHÁNG NGUYÊN KHÔNG
ĐƯỢC NHÂN LÊN
3.2.1. Vaccine vô hoạt

Vaccine vô hoạt (vaccine chết) là chế phẩm chứa chính tác nhân gây
bệnh nhưng đã bị vô hoạt (giết chết) bằng các phương pháp khác nhau,
chủ yếu là lý học và hoá học.

3.2.2. Vaccine chứa protein kháng nguyên tinh chế

Một số vi sinh vật trong quá trình nhân lên và gây bệnh có thải ra môi
trường một số thành phần protein có thể thu nhận để làm kháng nguyên
của vaccine.

muốn sử dụng làm vaccine cần thiết phải có những chất bổ trợ thích hợp
nếu không các loại enzyme thuỷ phân protein sẽ dễ dàng phá huỷ trước
khi gây kích thích miễn dịch.
3.2.3. Vaccine chứa kháng nguyên là protein tái tổ hợp

• Thành phần vaccine chính là protein tinh chế được sản xuất bằng công nghệ gen.
• Gen kháng nguyên của đối tượng được cắt ghép vào hệ thống vectơ thích hợp đối
với một loại vi sinh vật dùng trong công nghệ gen.
• Khi nuôi cấy chủng vi sinh vật tái tổ hợp trong môi trường thích ứng, protein
kháng nguyên được tổng hợp với lượng lớn. Sau đó tiến hành tách chiết và tinh
sạch làm vaccine.

3.3.4. Vaccine tổng hợp

Vaccine tổng hợp (synthetic vaccine) là loại chỉ chứa duy nhất một đoạn ngắn
polypeptid kháng nguyên (nhóm quyết định kháng nguyên - epitope).

Sau khi được tổng hợp, muốn làm vaccine chúng phải được gắn vào các giá
đỡ có bản chất là các hạt polymer có khả năng hấp phụ cao.

Ngoài ra, chúng còn được sử dụng với những loại chất bổ trợ tốt khác.
 4. CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI
4.1. KHÁI NIỆM
Hạn chế trong sản xuất vaccine bằng công nghệ cổ truyền?
• Không phải tất cả các tác nhân lây nhiễm đều có thể nuôi cấy được, do vậy
không thể sản xuất vaccine cho một số bệnh.
• Sản xuất virus động vật và virus người đòi hỏi môi trường nuôi cấy tế bào rất
đắt tiền.
• Sản lượng thấp và tốc độ nuôi cấy virus động vật và người bằng nuôi cấy
thường chậm nên giá thành sản xuất vaccine còn cao.
• Cần bảo đảm an toàn trong phòng thí nghiệm và người sản xuất để họ không
bị nhiễm các tác nhân gây bệnh.
• Những mẻ vaccine có thể không chết hoặc giảm độc lực không đủ trong quá
trình sản xuất, do đó sinh vật độc được đưa vào vaccine và lan bệnh một
cách vô tình.
• Các chủng đã giảm độc lực có thể hồi độc, nên đòi hỏi phải kiểm tra tiếp để
đảm bảo không xẩy ra sự hồi độc.
• Không phải tất cả các bệnh (như AIDS) đều có thể phòng được qua sử dụng
vaccine truyền thống.
• Đa số các vaccine hiện nay có thời gian sử dụng hạn chế và thường đòi hỏi
bảo quản lạnh để duy trì công hiệu. Đây là một vấn đề khó cho các nước có
vùng nông thôn rộng lớn, không có điện.
 Phương pháp khắc phục?
• Các gen độc có thể được loại bỏ khỏi tác nhân lây nhiễm mà vẫn còn khả năng kích
thích miễn dịch.
• Có thể tạo được các hệ thống chuyển giao sống không gây bệnh mang quyết định
kháng nguyên riêng biệt của tác nhân gây bệnh không liên quan. Ở dạng này, hệ
thống chuyển giao tạo điều kiện để cảm ứng đáp ứng miễn dịch mạnh trực tiếp
chống lại tác nhân gây bệnh.
• Đối với các tác nhân lây nhiễm không thể duy trì bằng nuôi cấy, các gen quy định
protein kháng nguyên có thể được phân lập, nhân dòng và biểu hiện ở hệ thống
vật chủ khác. Các protein tái tổ hợp này có thể dùng để tạo vaccine.
• Có một số tác nhân lây nhiễm không trực tiếp phá huỷ tế bào vật chủ, thay vào đó
biểu hiện bệnh xảy ra khi hệ miễn dịch của vật chủ tấn công tế bào (bị lây nhiễm)
của chính cơ thể mình. Đối với các bệnh này, có thể tạo hệ thống diệt tế bào đích
đặc hiệu, chỉ tấn công vào tế bào bị lây nhiễm loại bỏ nguồn đáp ứng miễn dịch
không mong muốn. Khi đó, gen quy định một protein dung hợp được thiết kế. Đầu
tiên, một phần của protein dung hợp sẽ liên kết với tế bào bị lây nhiễm. Sau đó,
phần còn lại tiêu diệt tế bào đã bị lây nhiễm.
 Khái niệm vaccine thế hệ mới?

“Vaccine thế hệ mới (vaccine bằng công nghệ gen) là các chế phẩm được
dùng làm vaccine, gây miễn dịch cho người và động vật được tạo ra và sản
xuất thông qua các thao tác về kỹ thuật gen”.

Các loại vaccine thế hệ mới?

Vaccine xoá gen

Vaccine phân tử hay vaccine dưới nhóm

Vaccine tái tổ hợp có vectơ dẫn truyền

Vaccine DNA
 4.2. VACCINE XOÁ GEN

• Vaccine xoá gen hay còn gọi vaccine sống giảm độc lực sản xuất bằng kỹ

thuật di truyền.

• Quá trình sản xuất được tiến hành bằng việc:

- tách genome ra khỏi vỏ capsid.

- Dùng enzyme giới hạn loại bỏ các gen độc.

- Tạo virus không còn gen độc làm vaccine để đưa vào cơ thể. Virus sẽ nhân

lên trong tế bào gây đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào.
 4.3. VACCINE PHÂN TỬ

4.3.1. Vaccine phân tử phòng chống viêm gan B

Gen mã hoá cho protein vỏ virus HBV gồm 3 gen:
gen pre-S1 mã hoá chuỗi peptid có 128 amino acid, gen pre-S2 mã hoá chuỗi
peptid có 55 amino acid và gen S mã hoá chuỗi peptid có 226 amino acid
Bằng kỹ thuật PCR và các kỹ thuật phân tử khác, tách dòng gen kháng
nguyên S, gen mã hoá cho protein pre-S2, tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào
nấm men S. cerevisidae. Hoặc có thể tiến hành riêng phức hợp gen S với pre-
S1 hoặc phức hợp gen S với pre-S2, sau đó tiến hành biểu hiện trong hệ
thống biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp làm vaccine có hiệu quả khác
nhau.
Gần đây loại vaccine viêm gan B mới được tạo nên từ sự biểu hiện cả gen
kháng nguyên: S, pre-S1 và pre-S2 của HBV trong tế bào trứng chuột đất
vàng Trung Quốc. Vaccine này có khả năng tạo phản ứng miễn dịch nhanh,
nồng độ kháng HBsAg cao miễn dịch tốt, tạo miễn dịch chống bệnh viêm gan
lâu dài, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ ung thư gan.
 4.3.2. Vaccine tổng hợp (vaccine peptid)

4
2

1 5 Bên ngoài

Màng

Bên trong

Hình 3.1. Các epitop bên ngoài có thể gây miễn dịch
Người ta đã tổng hợp hoá học một số đoạn peptid của kháng nguyên hoà tan VP1 của
virus gây bệnh lở mồm long móng (FMDV). Các đoạn peptid được tổng hợp gồm: 141-
160, 151-160 và 200-213 nằm ở đầu C của VP1 và 9-24, 17-32, 25-41 nằm gần đầu N
của VP1 được liên kết với protein mang trơ.

Cầu nối
Protein mang

Các Peptid
ngắn

Hình 3.2. Cấu trúc của vaccine peptid với protein mang
Các đoạn peptid này được thử nghiệm trên chuột lang. Kết quả cho thấy tiêm chủng

một lần peptid 141-160 đã gây đủ kháng thể để bảo vệ động vật chống được FMDV ở

những lần gặp sau. Ngược lại, khi tiêm VP1 hoàn chỉnh hoặc các peptid nằm gần đầu N

cho nồng độ kháng thể trung hoà thấp.

vaccine peptid có các hạn chế nhất định:

• Để hiệu quả, một epitop phải gồm một đoạn các amino acid kế tiếp nhau, mà

điều này thường không xuất hiện tự nhiên.

• Peptid phải có cấu hình giống như epitop trên hạt virus nguyên vẹn.

• Một epitop đơn có thể không đủ để gây miễn dịch.

 4.3. VACCINE TÁI TỔ HỢP CÓ VECTƠ DẪN TRUYỀN

4.3.1. Đặc điểm chung

* Về nguyên lý:

Loại vi sinh vật làm vectơ dẫn truyền phải là loại thông dụng cho nhiều

loài và phải giảm độc hoặc vô độc bằng cách cắt bỏ hoặc xoá đi một hay

nhiều gen bằng kỹ thuật gen. Đồng thời muốn trở thành vaccine, loại vi

sinh vật làm vectơ đó phải được ghép hệ thống biểu hiện gồm promoter

mạnh và một hay vài gen kháng nguyên mà chúng ta cần để làm

vaccine.
* Về mặt cấu trúc: Cần phân biệt 2 thành phần chính cấu trúc nên
vaccine.

- Đối tượng làm nhiệm vụ vectơ dẫn truyền: là các loại virus và vi khuẩn đã bị cắt bỏ
những gen gây độc và tính gây bệnh được giảm đến một mực độ nào đó mà đối tượng
hưởng vaccine chịu đựng được, nhưng bản thân chúng vẫn duy trì được chu kỳ sống
của mình trong cơ thể. Có nhiều đối tượng vi sinh vật có thể sử dụng làm vectơ dẫn
truyền như vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Lao, E. co li,... hoặc một số loại virus như
virus đậu, virus adeno,...

- Đối tượng được tái tổ hợp vào: Đó là một hệ thống được ghép vào vectơ có
cấu trúc gồm 2 bộ phận. Một là gen kháng nguyên được tách từ một loại vi
sinh vật gây bệnh hay tác nhân gây bệnh nào đó. Một bộ phận khác là
promoter được gắn trước gen. Gen kháng nguyên sẽ chịu sự điều hoà của
vùng promoter để tạo ra protein kháng nguyên kích thích cơ thể sinh miễn
dịch.
 4.3.2. Vaccine tái tổ hợp vectơ dẫn truyền sử dụng vi khuẩn
Salmonella
• Ưu thế của vaccine có vectơ dẫn truyền Salmonella là dễ dàng thao tác, dễ sử dụng, dễ
nhân lên và dễ phân phối kháng nguyên cho cơ thể. Việc nuôi cấy chủng vi khuẩn tái tổ
hợp không phức tạp do đó đảm bảo việc tiếp giống, nhân giống và sản xuất vaccine để
ứng dụng. Salmonella hiện đang được sử dụng làm vectơ dẫn truyền các loại gen
kháng nguyên của virus cúm, HBV, virus sốt xuất huyết, vi khuẩn gây bệnh đường ruột,
vi khuẩn tả, liên cầu khuẩn, ký sinh trùng sốt rét,...
• Quá trình tạo vaccine bắt đầu bằng việc tạo chủng Salmonella nhược độc. Bằng kỹ
thuật gen đã cắt bỏ hoặc xoá hoạt tính những gen gây bệnh của vi khuẩn S.
typhimurium như gen aroA, gen cya, gen crp hoặc gen thyA,... nhưng vẫn giữ nguyên
các đặc tính sinh học, sinh trưởng và phát triển như vi khuẩn ban đầu. Sau đó tổ hợp
gen kháng nguyên cùng với hệ thống khởi động được thiết kế kèm theo được ghép vào
chủng Salmonella nhược độc. Chủng này tiếp nhận gen kháng nguyên tạo thành chủng
vi khuẩn tái tổ hợp. Chủng vi khuẩn tái tổ hợp được nuôi cấy và tạo vaccine.
4.3.3. Vaccine tái tổ hợp có vectơ dẫn truyển sử dụng virus đậu

Hình 3.3. Sơ đồ tạo vaccine tái tổ hợp có vectơ dẫn truyền sử dụng virus đậu
 Ưu nhược điểm của vaccine tái tổ hợp có vectơ dẫn truyền sử dụng
virus đậu:

• virus đậu có khả năng kích thích cả 3 loại hình miễn dịch gồm miễn dịch

dịch thể, miễn dịch qua trung gian tế bào và miễn dịch niêm mạc. Miễn

dịch có virus đậu tham gia thường kéo dài, bền lâu, hoạt phổ miễn dịch

rộng, thích ứng nhiều loài, phương pháp vaccine đơn giản và tương đối an

toàn, giá thành vaccine không cao.

• Tuy nhiên, mối lo ngại lớn nhất khi sử dụng là mặc dù đã nhược độc nhưng

vẫn còn sống nên có khả năng trao đổi gen trong tự nhiên để trở lên độc

và có thể tái gây bệnh đậu mùa.

 4.4. VACCINE DNA
4.4.1. Khái niệm
Vaccine DNA là một loại hình vaccine đặc biệt thuộc thế hệ mới nhất, đó
chính là một plasmid vectơ biểu hiện được tái tổ hợp gen kháng nguyên
(hoặc gene kháng thể) với hệ thống promoter mạnh được tạo ra bằng công
nghệ gen.
Vaccine DNA gồm 2 loại chủ yếu: loại vaccine tập hợp các gen kháng nguyên
và loại vaccine tập hợp các gen kháng thể.

Gen kháng nguyên được tách dòng từ virus, vi khuẩn gây bệnh. Trong tế bào,
các gen kháng nguyên được phiên mã và dịch mã tạo nên các protein kháng
nguyên kích thích tế bào sản xuất kháng thể đặc hiệu chống các tác nhân gây
bệnh. Vaccine DNA là tập hợp các gen mã hoá kháng thể đặc hiệu thường
được cài gắn vào các vectơ biểu hiện mạnh, khi đưa vào tế bào các gen được
dịch mã tạo các kháng thể đặc hiệu, giúp tế bào chống lại sự xâm nhiễm của
các tác nhân gây bệnh.
 4.4.2. Ưu điểm của vaccine DNA

• Khả năng biểu thị của gen kháng nguyên rất mạnh, thời gian sản xuất protein
kháng nguyên lâu, do đó nguồn kháng nguyên duy trì trong thời gian dài và cho
miễn dịch tốt ngay cả với cơ thể thiểu năng miễn dịch.

• vaccine DNA có khả năng kích thích loại hình miễn dịch qua trung gian tế bào. Ưu
thế an toàn của vaccine DNA hơn hẳn so với vaccine tái tổ hợp có vectơ dẫn
truyền ở chỗ: không có hiện tượng trao đổi gen để “lại độc”,

• Vaccine DNA cực kỳ bền với nhiệt độ, không đòi hỏi điều kiện lạnh như các loại
vaccine khác. Trong điều kiện -20oC, vaccine DNA có thể bảo quản được hàng năm
mà vẫn giữ được hoạt tính, còn trong điều kiện nhiệt độ thường có thể giữ được
trong 1-2 tháng.

• vaccine DNA là dễ dàng tạo được vaccine đa chủng và đa giá giúp cơ thể chống lại
nhiều loại bệnh nhiễm trùng với giá thành thấp.
 4.4.3. Phương thức sử dụng vaccine DNA

• Phương pháp tiêm (phương pháp tiêm vào da và cơ)

Tiêm vào cơ
Tiêm nội bì
Tiêm tĩnh mạch
Tiêm dưới da
Tiêm ổ bụng
• Phương pháp bắn gene (phương pháp bắn xuyên da và cơ)
• Phương pháp đưa qua đường niêm mạc (nhỏ mắt, mũi, uống)

Hiệu quả đáp ứng miễn dịch của các phương pháp như thế nào?
 4.4.4. Ví dụ về công nghệ sản xuất vaccine DNA phòng chống bệnh
Gumboro

• Thiết kế vectơ tái tổ hợp có thể sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp các đoạn gen mã

hoá kháng nguyên VP2, VP3, VP4 để tạo nên các loại vaccine DNA có hiệu quả

chống bệnh khác nhau.

• Vaccine DNA chứa hai đoạn gen mã hoá protein vỏ virus gồm đoạn gen VP2 và

phân đoạn A mang cả 3 gen (VP2, VP3, VP4) tách dòng từ các chủng virus

Gumboro P40 và D78 sử dụng phòng chống bệnh cho gia cầm ở Hungary có hiệu

quả cao.

• Vaccine DNA chứa phân đoạn A từ chủng Gumboro STC sử dụng trong phòng

chống virus Gumboro thành công tại Mỹ và nhiều nước khác và hiện đã được đăng

ký bản quyền chính thức tại Mỹ.

Quy trình công nghệ sản xuất vaccine DNA chống bệnh Gumboro
có thể thực hiện theo các bước cơ bản sau:

• Tách chiết RNA tổng số từ mẫu virus Gumboro

• Thực hiện phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu để thu nhận đoạn
gen mã hoá protein kháng nguyên cần thiết.
• Tạo vectơ tái tổ hợp giữa đoạn gen kháng nguyên và vectơ tách dòng
• Thực hiện kỹ thuật biến nạp, sàng lọc các tế bào mang vectơ tái tổ hợp
• Nuôi cấy các tế bào sau biến nạp, thu nhận và kiểm tra DNA tái tổ hợp
• Thử hiệu lực vaccine DNA.
VACCINE ĂN ĐƯỢC (VACCINE THỰC VẬT)
Thế nào là vaccine ăn được?
Đặc điểm của vaccine ăn được?
Làm thế nào để sản xuất vaccine ăn được?
 CHƯƠNG 3
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL SINH HỌC

1. XU THẾ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP ETHANOL SINH HỌC

2. CƠ SỞ HOÁ SINH CỦA NGÀNH CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT ETHANOL

SINH HỌC

3. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUỒN NGUYÊN LIỆU ĐƯỜNG,

TINH BỘT

4. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE

 1. XU THẾ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP ETHANOL SINH HỌC
• nhiều quốc gia và các tập đoàn năng lượng trên thế giới trong vài thập kỷ
qua đã có chiến lược kết hợp sử dụng tiết kiệm dầu mỏ, đồng thời đầu tư
cho nghiên cứu sử dụng các dạng nhiên liệu sạch thay thế một phần xăng
dầu khoáng, trong đó có ethanol sinh học.

• Braxin là quốc gia sản xuất và sử dụng cồn nhiên liệu lớn nhất thế giới. Hiện
có trên 60 000 đồn điền mía với 6,5 triệu ha và trên 324 nhà máy sản xuất
đường, ethanol chủ yếu dùng trong nước và xuất khẩu tương đương 220
000 thùng dầu/ngày. Cả nước có trên 3 triệu ôtô sử dụng hoàn toàn ethanol
khan làm nhiên liệu và 17 triệu ôtô sử dụng xăng pha 24% ethanol.
• Mỹ là quốc gia tiêu thu hằng năm 25% năng lượng trên thế giới với hơn
60% dầu mỏ phải nhập từ bên ngoài. Năm 1998, tổng thống Mỹ B. Clinton
đã ký sắc lệnh 13101 về sử dụng sản phẩm sinh học thay thế một phần dầu
mỏ. Năm 2004 Mỹ đã sản xuất trên 13 triệu m3 cồn.
• Trung Quốc là quốc gia sản xuất và sử dụng ethanol nhiên liệu lớn thứ 3
sau Braxin và Mỹ. Năm 2004 đã đưa vào hoạt động nhà máy sản xuất
ethanol lớn nhất thế giới với công suất 600 000 tấn/năm, tăng sản lượng
ethanol cả nước trên 3,5 triệu m3. Từ tháng 6/2002, nước này đã quyết
định sử dụng xăng pha 10% cồn khan ở 5 thành phố và đến cuối năm 2006
đã tăng thêm 27 thành phố đông dân khác.

• Ấn Độ đã sử dụng xăng pha 5% cồn ở 9 bang và 4 tiểu vùng từ ngày

1/1/2003.

• Thái Lan cũng là một trong những quốc gia tích cực đầu tư vào nhiên liệu
sinh học. Năm 2004, nước này đã sản xuất trên 280 000 m3 và đầu tư
thêm 20 nhà máy để đến năm 2015 có trên 2,5 triệu m3 ethanol làm nhiên
liệu.
2. CƠ SỞ HOÁ SINH CỦA NGÀNH CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT
ETHANOL SINH HỌC
Hình 3.2. Con đường đường phân
2.2. QUÁ TRÌNH LÊN MEN
3. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUỒN NGUYÊN LIỆU
ĐƯỜNG, TINH BỘT

Các loại TB được sử dụng

Loại nguyên Nước Protein Chất Gluxit Celluose Tro
liệu (%) (%) béo (%) (%) (%) (%)

Sắn tươi 70,25 1,102 0,41 26,58 1,11 0,54

Sắn khô 13,12 0,205 0,41 74,74 1,11 1,69
Khoai tây tươi 74,9 1,99 0,15 20,8 0,98 1,09
Khoai lang tươi 68,1 1,6 0,5 27,9 0,9 1,0
Khoai lang khô 12,9 6,1 0,5 76,7 1,4 2,4
Ngô 14 10 4,6 67,9 2,2 1,3
 Các loại TB được sử dụng
Loại nguyên Nước Protein Chất Gluxit Celluose Tro
liệu (%) (%) béo (%) (%) (%) (%)
Thóc 12 6,7 1,9 63 10,4 5,2

Đại mạch 14 10,5 2,1 66,4 4,5 2,5

Lúa mỳ mềm 14 12 1,7 68,2 2,6 1,6

Gạo gĩa 12,6 9 0,5 77 0,4 0,5

Gạo say 11,6 9,1 2,45 74,79 0,65 1,4

Tấm 11,8 8,9 1 77,38 0,6 0,7

Cám 12,5 13,17 10,12 72 14,05 11,14

Mỳ đen 14 11 1,7 69,6 1,9 1,8

Hiệu quả thu nhận ethanol từ một số loại
nguyên liệu
liệu??
Sơ đồ tổng quát công nghệ sản xuất Ethanol
 a. Nghiền nguyên liệu
• Mục đích: Phá vỡ cấu trúc màng tế bào thực vật, tạo điều kiện giải phóng các
hạt tinh bột khỏi các mô, để khi đưa vào nấu ở nhiệt độ và áp suất phù hợp
biến tinh bột thành dạng hòa tan.
• Có 2 phương pháp nghiền nguyên liệu:
- Nghiền ướt: nguyên liệu được nhúng vào nước hay axit hoà tan để tách thành
các thành phần trước khi chuyển hoá tinh bột thành đường để lên men thành
ethanol.
- Nghiền khô: nguyên liệu được nghiền thành bột mịn và chế biến mà không
phân tách thành các thành phần. Nguyên liệu ở dạng hạt được đưa vào máy
nghiền búa (ở Việt Nam).
+ Nghiền thô: búa có chiều dày 6-10mm.
+ Nghiền nhỏ: búa có chiều dày 2-3mm.
+ Tốc độ quay của máy nghiền: 2750 vòng/ phút.
 b. Nấu nguyên liệu

- Mục đích: phá vỡ cấu trúc dạng hạt của tinh bột tạo thành
các mạch pectin và amilopectin ở nhiệt độ cao tạo điều
kiện thuận lợi cho quá trình đường hóa.

- Có 3 phương pháp nấu nguyên liệu:

 Nấu gián đoạn

 Nấu bán liên tục

 Nấu liên tục

• Nấu gián đoạn: Toàn bộ quá trình nấu được thực
hiện trong cùng một nồi.
- Các bước: Cho nguyên liệu vào nồi, cho toàn bộ
nước vào nồi với tỷ lệ 3,5 – 4lít/kg nguyên liệu
tuỳ thuộc vào hàm lượng tinh bột, đậy nắp kín
cho máy khuấy làm việc rồi bắt đầu xông hơi sao
cho 45 – 60 phút thì áp suất trong nồi đạt yêu
cầu. Đối với nguyên liệu đã nghiền thì áp suất
đạt yêu cầu khoảng 3 – 3,5 kg/cm2.
- Thời gian nấu từ 60 – 70 phút được tính từ khi
đã đạt áp suất yêu cầu, nhiệt độ tương ứng là 135
– 1400C.
- Khi nấu có thể cho thêm H2SO4 loãng với hàm
lượng 2 – 4 kg/tấn nguyên liệu sẽ nấu nhanh
chín hơn và dịch cháo tinh bột ít hoặc không bị
lão hoá. Tuy nhiên nếu cho nhiều sẽ không có lợi
do ăn mòn thiết bị và làm giảm hoạt tính của
amylaza.
• Nấu bán liên tục : Quá trình nấu được tiến
hành trong 3 nồi khác nhau và chia thành nấu
sơ bộ, nấu chín và nấu chín thêm. Phương
pháp này tiết kiệm được hơi đốt và cho năng
suất cao đồng thời thời gian nấu được rút ngắn
tuy nhiên phải sử dụng tới 3 nồi để nấu do đó
tốn kém cho thiết bị.
- Nấu sơ bộ được thực hiện trong thiết bị hình
trụ. Lúc đầu cho lượng nước 40 – 500C vào
cùng với tỷ lệ 3,5 – 4lít/kg bột khuấy trộn rồi
dùng hơi thứ từ nồi nấu chín thêm để đun
dung dịch bột tới 70 – 850C và duy trì khoảng
50 – 60 phút sau đó đưa sang nồi nấu chín.
Sơ đồ hệ thống nấu bán liên tục
- Nấu chín: Áp suất nấu 2,8 – 3,2 kg/cm2, nhiệt
độ 130 – 1350C, thời gian nấu khoảng 60
phút. - Nấu liên tục : Nấu liên tục cho phép có được
- Dịch cháo sau khi nấu chín được đưa sang nồi năng suất cao, tổn hao năng lượng ít và thời
nấu chín thêm áp suất nấu từ 0,5 – 0,7 kg/cm2, gian nấu được rút ngắn. Tuy nhiên ở phương
nhiệt độ 105 – 1060C, thời gian nấu 50 – 60 pháp này đòi hỏi các điều kiện nghiêm ngặt
phút. như về kích thước của bột phải có một tỷ lệ
xác định,việc cung cấp điện, hơi nước,nước
phải ổn định. Quá trình nấu liên tục cũng được
thực hiện thông qua 3 giai đoạn thực hiện
trong 3 thiết bị khác nhau là : Nấu sơ bộ, nấu
chín và nấu chín thêm.
 c. Quá trình đường hóa

Quá trình đường hoá dịch cháo nấu

có thể thực hiện gián đoạn hay liên
tục. Tuy nhiên về cơ bản thì nó bao
gồm các công đoạn sau:
- Làm lạnh dịch cháo tới nhiệt độ
đường hoá.
- Cho chế phẩm amylaza vào dịch
cháo và giữ ở nhiệt độ trên trong
thời gian xác định để amylaza
chuyển hoá tinh bột thành dường.
- Làm lạnh dịch đường hoá tới nhiệt
độ lên men.
- Sau đường hoá nhiệt độ dịch đường
là 300C hàm lượng đường đạt 80 –
100g/l.
 d. Quá trình lên men

Chủng nấm men được sử dụng

Nấm mốc
 Vi khuẩn

Một số vi khuẩn:
- Sasina ventriculi,
Zymononas mobylis.
- Ngoài ra còn có vi khuẩn
lactic dị hình, vi khuẩn
đường ruột hay Clostridium
• Lên men rượu là một quá trình lên men yếm khí diễn ra rất
phức tạp, bao gồm các quá trình sinh hóa học và các quá trình
vi sinh vật.
• Quá trình lên men có thể được thực hiện gián đoạn hay liên
tục :
- Lên men gián đoạn: Men giống và dịch đường cùng được
bơm vào thùng, lượng men giống chiếm khoảng 10% thể tích
thùng lên men, dịch đường được bơm từ từ vào thùng
(khoảng 68 giờ/1 thùng) để hạn chế sự phát triển của tạp
khuẩn. Thời gian lên men là 3 ngày. Lên men gián đoạn có
ưu điểm là dễ làm,khi nhiễm tạp khuẩn dễ sử lý tuy nhiên
năng suất thu được thấp.
- Lên men liên tục : Dịch đường và men
được cho vào thùng đầu – gọi là thùng
lên men chính,luôn chứa một lượng lớn
tế bào trong 1ml dịch. Khi đầy thùng
đầu thì dịch lên men sẽ chảy tiếp theo
sang các thùng bên cạnh và cuối cùng
là thùng chứa giấm chín.
+ Quá trình lên men được tiến hành như
sau: Đầu tiên men giống được phát
triển rồi được đưa vào thùng lên men
cấp I. Sau đó được đưa sang thùng lên
men cấp II rồi mới được đưa sang
thùng lên men chính, sau đó được đưa
sang thùng lên men phụ.
+ Vấn đề chủ yếu của lên men liên tục là + Ưu điểm: ở thùng lên men chính nên lên men xảy ra
phải luôn luôn khống chế số tế bào ở nhanh,hạn chế được phát triển của tạp khuẩn. Mặt
thùng lên men chính khoảng 100 – 120 khác do độ chua của dịch đường cao, pH thấp cũng là
triệu TB / ml và phải đảm bảo vô yếu tố không thuận lợi cho vi khuẩn và nấm men
trùng. hoang dại. Sau 24 giờ đã có 78% đường được lên
men, trong khi đó ở lên men gián đoạn mới chỉ đạt
42%.
+ Nhiệt độ lên men: Đối với thùng lên men chính nên
giữ ở 25 – 270C thùng lên men phụ từ 27 – 300C các
thùng còn lại 27 – 280C. Quá trình lên men sẽ kết
thúc sau 60 – 62 giờ so với lên men gián đoạn là 72
giờ. Sau quá trình lên men nhiệt độ dấm 34 – 350C .
 e. Quá trình chưng cất

• Khi quá trình lên men kết thúc, ta tiến hành chưng cất để thu
được rượu thành phẩm.
• Quá trình chưng cất rượu nhằm tách hỗn hợp rượu và nước
có nhiệt độ sôi khác nhau. Ở áp suất thường, rượu sôi và bốc
hơi ở 780C, của nước là 1000C...
• Các hình thức chưng cất:
- Chưng cất liên tục.
- Chưng cất gián đoạn.
- Chưng cất bán liên tục.
 Một số phương pháp làm tăng độ cồn

• dùng các chất hút ẩm (như vôi sống, photphat kali, sunfat đồng).
• phương pháp chưng cất thường, chưng chân không ở áp suất thấp (0,0525
atm)
• Phương pháp chưng luyện đẳng phí: Đây là phương pháp cho thêm cấu tử
thứ ba (benzen, clorofooc, toluen...) vào nhằm thay đổi độ bay hơi tương đối
của hai cấu tử trong hệ ban đầu. Có nghĩa là thêm cấu tử thứ ba vào, nó tạo
thành với cấu tử dễ bay hơi (hay với cả hai cấu tử) dung dịch đẳng phí có độ
bay hơi lớn hơn và sản phẩm đáy tháp là cấu tử ở dạng nguyên chất.
• Phương pháp hấp phụ trên rây phân tử
4. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU
LIGNOCELLULOSE

Nguyên liệu Lignocellulose

Các giai đoạn sản xuất ethanol
4.1. THUỶ PHÂN BẰNG ACID ĐẶC

Công nghệ này dựa trên việc sử dụng axits đặc để phá huỷ cấu trúc tinh thể của
cellulose sau đó thuỷ phân bằng axit loãng. Các khâu tách axit khỏi đường, thu
hồi và cô đặc axit là những công đoạn mấu chốt của qui trình.

Trong công nghệ này, axit đặc sẽ phá huỷ các liên kết hydro giữa các mạch
cellulose và chuyển chúng sang trạng thái vô định hình. Sau đó, cellulose sẽ
hình thành trạng thái gelatin với axit và trở lên mẫn cảm với phản ứng tự thuỷ
phân. Khi pha loãng với nước và dưới tác động của nhiệt, cellulose nhanh
chóng bị thuỷ phân thành glucose.
Hình 3: Sơ đồ hệ thống sản xuất ethanol bằng công nghệ thủy phân dùng
axit đặc (Arkenol - Hoa Kỳ)
• Trong qui trình này, sinh khối thực vật có hàm ẩm 10% được xử lý bằng axit

sunfuric nồng độ 70 – 77%. Lượng axit sử dụng so với sinh khối là 1,25:1 và nhiệt

độ được giữ ở mức dưới 50oC. Sau đó nước được bổ sung để pha loãng axit tới

nồng độ 20 – 30% và gia nhiệt tới 100oC, giữ trong thời gian 1h. Dịch dạng gel

được lấy ra khỏi bể phản ứng và lọc ép để lấy dịch đường và axit. phần chất rắn

còn lại sẽ được tái thuỷ phân lần hai. Dịch đường và axit sẽ được phân tách sử

dụng cột sắc ký. Công đoạn lên men tiếp theo có thể chuyển hoá được đường

thành ethanol với hiệu suất 85% với đường xylose và 92% với glucose. Hãng

Arkenol tuyên bố có thể thu hồi 97% axit trong qui trình của mình.
 4.2. THUỶ PHÂN BẰNG ACID LOÃNG

Hình 4.2. Sơ đồ hệ thống sản xuất ethanol bằng công nghệ thuỷ phân dùng
axit loãng
Trong giai đoạn thuỷ phân thứ nhất, nguyên liệu được xử lý bằng dung dịch axit

sunfuric 0,7% ở nhiệt độ 190oC với thời gian 3 phút.

Giai đoạn 2: được thực hiện ở 215oC với nồng độ axit là 0,4% và thời gian là 3 phút.

Dịch thủy phân từ mỗi quá trình được thu hồi, trung hoà và lên men tạo ethanol.

Cellulose và lignin còn lại ở dạng rắn được sử dụng làm nhiên liệu cho sản xuất hơi.
 4.3. THUỶ PHÂN BẰNG ENZYME

Hệ enzyme tham gia và cơ chế thủy phân cellulose

• Quy trình sản xuất:
 Xử lý sơ bộ nguyên liệu bằng axit, kiềm, nhiệt độ nhằm đảm bảo khả
năng tiếp cận của enzyme tới các liên kết của phân tử cellulose.
 Công nghệ SHF: thủy phân và lên men riêng biệt.

Sản xuất
enzyme

Thủy phân
Cắt/nghiền nhỏ Xử lý sơ bộ bằng cellulose bằng Xử lý bã
axit loãng enzyme thải rắn

Dịch thủy phân Dịch thủy phân

hemicellulose cellulose Lên men
(đường xylose) (đường glucose)

Thu hồi
Sơ đồ tóm tắt quy trình công nghệ SHF ethanol
• Công nghệ SSF: thủy phân và lên men đồng thời.
 Giảm số lượng thiết bị: bỏ qua công đoạn thủy phân riêng biệt.
 Giảm ức chế ngược của sản phẩm với enzyme: glucose trong dung dịch sẽ
ức chế hoạt động thủy phân cellubiose của β-glucosidase.
 Hiệu suất chuyển hóa cellulose thành ethanol tăng 40% (so với SHF).
• Quy trình cải biến SSCF: lên men đồng thời nhiều loại đường.

Xử lý sơ bộ
bằng axit Sản xuất Xử lý bã
Cắt/nghiền nhỏ
loãng enzyme thải rắn

Đồng thời
đường hóa
và lên men

Sơ đồ tóm tắt quy trình SSCF Thu hồi

ethanol
Những khó khăn trong quy trình công nghệ?

 Sự khác nhau trong nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzyme cellulase
45--50oC) và nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật lên men ethanol (28
(45 28--
35oC)
C)..
 Một số thành phần dịch thủy phân
phân,, ethanol cũng có tác động ức chế
enzyme cellulase
cellulase..
 Giá thành cellulase quá cao

Những phương hướng khắc phục?