Artigo

MTODOS ANALTICOS PARA A DETERMINAO DE AFLATOXINAS EM MILHO E SEUS DERIVADOS: UMA REVISO
Resumo
As aflatoxinas, metablitos altamente txicos de Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius, podem contaminar alimentos e raes base de milho no campo ou no armazenamento. Devido ao potencial risco sade humana, os nveis de aflatoxinas so monitorados em muitos pases. Com a finalidade de fornecer informaes a respeito dos mtodos empregados na determinao de aflatoxinas em alimentos e raes base de milho, foi realizada uma reviso da metodologia analtica relatada na literatura cientfica. Palavras-chave: aflatoxinas, mtodos analticos, milho
Kassia Ayumi Segawa do Amaral e Miguel Machinski Junior* Universidade Estadual de Maring Departamento de Anlises Clnicas, Laboratrio de Toxicologia *Autor para correspondncia: Av. Colombo, 5790 CEP: 87020-900. Maring. PR Fone: (44) 3261-4565 Fax: (44) 3261-4489 E-mail: mmjunior@uem.br

Summary
Aflatoxins are mycotoxins produced by Aspergillus flavus, A. parasiticus and A. nomius and occur in corn used for food and in corn-based animal feeds. They have been to the potential risk to the health human. The aflatoxins levels are monitored in many countries. The present paper reviews the analytical methodology currently described in the cientific literature for determination of aflatoxins in corn-based foods and feeds. Keywords: aflatoxins, analytical methods, corn

Introduo
As aflatoxinas podem ser produzidas por trs espcies de Aspergillus, A. flavus, A. parasiticus e A. nomius, que contaminam gros e seus produtos. O A. flavus produz apenas aflatoxinas do grupo B, enquanto as outras duas espcies produzem aflatoxinas dos grupos B e G (1). As aflatoxinas so conhecidas por serem compostos mutagnicos, carcinognicos e teratognicos. A exposio por ingesto de aflatoxinas pode levar ao desenvolvimento de srias condies clnicas que variam consideravelmente dependendo da espcie animal, dose, estado nutricional, idade e gnero (2,3). Aps a ingesto, a aflatoxina B1 biotransformada por enzimas dando origem a um produto reativo, o 8-9-epxido, que pode se ligar tanto ao DNA quanto albumina srica formando adutos de aflatoxina-N7-guanina e aflatoxina-N7-lisina, respectivamente. As ligaes covalentes dos adutos no DNA so consideradas um passo crtico na hepatocarcinognese das aflatoxinas (3). Uma vez que a presena do fungo no implica necessariamente na presena de toxinas, as determinaes analticas so necessrias para fiscalizao, monitoramento e pesquisa. Existem vrios fatores que dificultam este tipo
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de anlise como, por exemplo, distribuio no uniforme das micotoxinas nos lotes contaminados, nveis de contaminao serem extremamente baixos, extratos usualmente acompanhados de interferentes necessitando de uma fase de limpeza e a natureza variada das amostras, as quais requerem diferentes procedimentos na extrao (4). A necessidade de decises rpidas leva aos novos mtodos de triagem, por exemplo, imunoensaios, MIPs (Molecularly Imprinted Polymers), biossensores e a espectroscopia no infravermelho. Na anlise de multitoxinas a espectrometria de massas est sendo muito promissora (5).

Extrao
Os principais mtodos de extrao de aflatoxinas presentes em alimentos e raes base de milho encontramse descritos na Tabela 1. A extrao de aflatoxinas de amostras requer o uso de solventes ou mistura de gua e solventes relativamente polares (metanol, acetona, etilacetato) (5). As matrizes problemticas so, em particular, materiais secos, tais
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Solventes extratores Metanol:gua Metanol:gua Metanol:guahexano Acetonitrila: gua Celite:gua:clorofrmio Acetonitrila:gua Metanol:gua Metanol:KCl Clorofrmio:gua Acetonitrila:gua Clorofrmio:gua Clorofrmio:gua Metanol:gua Acetonitrila:gua

Proporo 70:30 6.5:3.5 80:205 9:1 25g:10ml:250ml 9:1 8:2 9:1 30:1 9:1 30:1

Referncia (6, 7) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (3) (15) (3, 16) (3, 16) (3, 16)

te tolueno-acetato de etila-clorofrmio-cido frmico 70:50:50:20 (19). A quantificao das aflatoxinas pode ser realizada utilizando tcnica visual sob luz UV ou a densitometria (20). Cromatografia lquida de alta eficincia A cromatografia lquida de alta eficincia de fase normal e fase reversa tem sido usada com deteco por absoro ultravioleta (UV), fluorescncia, espectrometria de massas e amperomtrica. O sistema de deteco por fluorescncia , cerca de 30-40 vezes mais sensvel que o sistema de deteco por UV para aflatoxinas. A sensibilidade pode ser aumentada atravs da converso de aflatoxinas em derivados por derivao pr-coluna com cido trifluoroactico ou derivao ps-coluna com iodeto ou brometo (3, 21). Imunoensaios Existem atualmente no comrcio vrios tipos de testes (kits comerciais) baseados em mtodos imunoqumicos tanto para a deteco qualitativa (triagem) como para a determinao quantitativa de micotoxinas. ELISA (ensaio imunoenzimtico) A tcnica de ELISA pode ser competitiva direta ou indireta, e consiste em dois passos: 1) a reao entre o anticorpo e a aflatoxina, e 2) a deteco da reao usando a hidrlise enzimtica do substrato pelo complexo aflatoxina-enzima. A tcnica de ELISA pode ser usada como procedimento de triagem na determinao de aflatoxinas, devido a sua sensibilidade, especificidade, rapidez e facilidade de manuseio (6, 22, 23). A principal desvantagem desta metodologia a alta incidncia de resultados falsopositivos, grande variabilidade nos resultados (30-300%), baixa reprodutibilidade e possibilidade de resultado falsonegativo (24). Biossensores Um biossensor fluoromtrico de imunoafinidade tem sido desenvolvido para detectar e quantificar aflatoxinas. O aparelho opera nos princpios de imunoafinidade e fluorescncia para um ensaio quantitativo (25). Os imunosensores geralmente se referem a um sistema que acopla um material imunoativo a um transdutor para produzir um sinal eltrico proporcional quantidade do analito presente (8). Imunoensaio de injeo sequencial (SIIA Sequential injection immunoassay) Ensaio imunoenzimtico colorimtrico de injeo sequencial utiliza a clula de jato de fluxo com fase slida de
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Tabela 1. Levantamento dos solventes para extrao de aflatoxinas em milho e derivados

como ps ou aqueles com um alto contedo de constituintes hidrossolveis. Nestes casos, o uso de extratores aquosos como o metanol ou acetona menos crtico que o uso daqueles contendo acetonitrila (17).

Limpeza
O extrato resultante da etapa anterior contm vrias impurezas, como lipdios e pigmentos. Os procedimentos de limpeza do extrato envolvem partio lquido-lquido, colunas de extrao em fase slida (slica gel, C18, silicato de magnsio) (11, 15) e colunas de imunoafinidade (3, 5, 12). O uso de agentes clarificantes como sulfato de cobre ou sulfato de amnio associado a terra diatomcea foi relatado por Soares e Rodrigues-Amaya (13). Deteco/Quantificao Deteco/Quantificao A determinao de aflatoxinas tem sido realizada por vrias tcnicas, como: cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e imunoensaios (ELISA, BIOSSENSORES, SIIA). Cromatografia em camada delgada a tcnica de referncia para a maioria dos laboratrios brasileiros porque no necessita de equipamentos onerosos e confivel (13). A CCD permite separao eficaz dos compostos, o que torna este mtodo muito til na caracterizao das aflatoxinas. Na CCD, o Rf das micotoxinas varia conforme a mistura de solventes da fase mvel (18), sendo muito utilizado o sistema-solvenRevista AnalyticaAgosto/Setembro 2006N24

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polimetilmetacrilato adsorvidas com AFB1-albumina srica bovina. uma tcnica de imunoensaio competitivo indireto com duplo anticorpo to sensvel quanto o ELISA na deteco de AFB1. A desvantagem que o mtodo de SIIA realiza os ensaios individualmente e seqencialmente, e no caso de muitas amostras, a anlise demorada (8).

Concluses
Um mtodo de anlise para aflatoxinas em milho e derivados deve ser simples, rpido, robusto, exato, preciso e seletivo para permitir determinaes simultneas. Alm disso, os baixos nveis de tolerncia em alimentos e raes requerem mtodos sensveis. De acordo com as recomendaes evidenciadas pelos diversos autores, pode-se concluir que os mtodos analticos para a determinao de aflatoxinas em milho e derivados tm sido amplamente desenvolvidos, mas so necessrios alguns melhoramentos para se tornarem exatos, baratos e rpidos. Dentre os mtodos mais acessveis aos laboratrios, os imunoensaios apresentam como vantagem a baixa utilizao de solventes orgnicos; a CCD a tcnica mais utilizada nos pases em desenvolvimento, devido o seu baixo custo e eficincia, enquanto a CLAE a mais empregada nos pases desenvolvidos.

Confirmao
A confirmao pode ser efetuada segundo Przybylski (26) por derivao qumica com cido trifluoroactico (TFA) com formao dos derivados hemiacetais caractersticos das aflatoxinas B1 e G1 (27) e analisadas por CCD. A espectrometria de massas acoplada ao cromatgrafo gasoso ou lquido de alta eficincia um procedimento de confirmao altamente especfico na anlise de aflatoxinas, mas requer equipamentos de alto custo.

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