Tom 51, 2002 Numer 3 (256) Strony 241254

MIROSAWA WODARCZYK
Zakad Genetyki Bakterii Instytut Mikrobiologii Uniwersytet Warszawski Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa miraw@biol.uw.edu.pl

RNORODNO CECH FENOTYPOWYCH BAKTERII KODOWANYCH PRZEZ PLAZMIDY

W zalenoci od wielkoci czsteczki, plazmidy nios geny kodujce od kilku do kilkuset rnych biaek. Jednake, jak ju wspomniaam w poprzednim artykule, produkty genw o plazmidowej lokalizacji nie s niezbdne do wzrostu komrki w standardowych (normalnych) warunkach. Na plazmidach nie znajdziemy wic genw kodujcych polimeraz RNA, podjednostki rybosomw, enzymw cyklu Krebsa itp. W rzadkich przypadkach, gdy na plazmidzie stwierdzamy obecno tego typu genw, lub gdy nie jestemy w stanie usun replikonu uznawanego za plazmid z komrki, mamy podstawy do podjcia rozwaa czy istotnie mamy do czynienia z plazmidem, czy te jest to replikon niezbdny do ycia komrki, a wic chromosom. Przypominam, e od modelowej zasady, i jedna komrka bakteryjna zawiera jeden chromosom s wyjtki; przykadem mog by niektre gatunki Rhizobium i Paracoccus. Geny o lokalizacji plazmidowej daj bakteriom selekcyjn przewag w pewnych specjalnych warunkach, czsto wrcz umoliwiajc im przeycie. Powstaje zatem pytanie, dlaczego geny te nie s po prostu czci chromosomu, tak aby wszystkie bakterie w sytuacjach nietypowych mogy odnosi korzy z ich obecnoci. Dyskusja tego problemu zostanie podjta na kocu artykuu, po przedstawieniu przegldu rnorodnoci funkcji fenotypowych kodowanych przez geny plazmidowe.

TYPY GENW OBECNYCH NA PLAZMIDACH

Wrd genw obecnych na plazmidach moemy wyrni dwa ich podstawowe typy. Pierwszy, to geny absolutnie niezbdne dla funkcjonowania plazmidu jako autonomicznego replikonu i obecne w kadym plazmidzie, a wic geny i sekwencje (np. oriV), niezbdne do replikacji i stabilnego utrzymywania czsteczki plazmidu w komrce. Drugi typ, to wszystkie pozostae geny stanowice dodatkowe wyposaenie plazmidu, od ktrych zaley rnorodno fenotypw kodowanych przez plazmidy, lecz ktre nie s niezbdnym elementem skadowym kadego plazmidu. Na

Ryc. 1 w schematyczny sposb przedstawiono zoono struktury plazmidu, wyrniajc w obrbie jego czsteczki kilka umownych moduw strukturalno-funkcjonalnych (THOMAS 2000). Plazmid zawierajcy tylko modu replikacyjny, bdzie spenia kryteria definicji plazmidu, lecz jego obecno nie bdzie nadawaa komrce gospodarza adnych specjalnych fenotypowych waciwoci odrniajcych j od komrki bezplazmidowej. Bdzie to wic plazmid sensu stricto kryptyczny. Zwracam uwag, e mianem plazmidu kryptycznego okrela-

242

MIROSAWA WODARCZYK

Rejon replikacyjny Rejon cichy Geny zwizane z warunkowanym przez plazmid fenotypem Geny zwizane z transferem koniugacyjnym Sekwencje insercyjne

Ryc. 1. Typy genw wystpujce w czsteczce plazmidowej.

Rejon replikacyjny to modu absolutnie niezbdny w plazmidzie, pozostae grupy genw mog lecz nie musz by obecne.

my te zwyczajowo plazmid zidentyfikowany poprzez wykrycie w komrce fizycznej obecnoci DNA plazmidowego, lecz ktrego obecnoci nie kojarzymy (na tym etapie analizy) z okrelon cech fenotypow komrki gospodarza. Geny warunkujce replikacj czsteczki plazmidu s zazwyczaj skupione na jednym fragmencie DNA plazmidowego, ktry w duych plazmidach stanowi niewielki procent caego genomu. Identyfikacja takiego fragmentu i wyposaenie go w marker selekcyjny pozwala na konstrukcj pochodnej plazmidu zawierajcej tylko modu replikacyjny. Taki minimalny replikon jest niezwykle przydatny w molekularnej analizie systemu replikacyjnego plazmidu macierzystego.

Kolejny wyrniony zesp genw to geny odpowiedzialne za horyzontalny transfer plazmidw (autotransfer drog koniugacji lub transfer wspomagany obecnoci innego plazmidu, tzw. mobilizujcego). S one bardzo wane dla moliwoci rozprzestrzeniania si plazmidw w rodowisku, lecz ich brak nie powoduje zaburze w funkcjonowaniu plazmidu w komrce. Modu zaznaczony na schemacie jako sekwencje insercyjne to okrelenie umowne; sekwencje IS nie s oczywicie zgrupowane w jednej czci genomu plazmidowego, stanowi jednak skadnik bardzo wany, odpowiedzialny gwnie za wszelkiego rodzaju przegrupowania genw w obrbie czsteczki plazmidu oraz ich transfer midzy rnymi replikonami w komrce. Czsto sekwencje IS ograniczaj inne zespoy genw (np. opornociowych) tworzc due, zoone elementy mobilne, transpozony. O istotnym znaczeniu sekwencji insercyjnych w funkcjonowaniu i ewolucji plazmidw wiadczy moe ich stosunkowo dua (w porwnaniu do chromosomw) zawarto w plazmidach (MAHILLON i wspaut. 1999). Na schemacie najwikszy obszar zajmuje modu grupujcy geny zwizane z rnymi cechami fenotypowmi gospodarza, zwykle metaboliczno-fizjologicznymi, wynikajcymi z obecnoci plazmidu. W konkretnych plazmidach takich genw moe by rna liczba, a wielko obszaru tego moduu ma raczej obrazowa oglny ogromny zakres rnorodnoci tych cech. W kadym plazmidzie wystpuje pewna frakcja sekwencji DNA, ktrych funkcji nie znamy, pozostaje to prawdziwe nawet w odniesieniu do plazmidw o kompletnie poznanej sekwencji nukleotydowej. Ten obszar oznaczono jako rejon cichy (ang. silent).

CECHY FENOTYPOWE BAKTERII DETERMINOWANE PRZEZ GENY PLAZMIDOWE

Cech takich jest niezwykle duo, dlatego te dla zwikszenia przejrzystoci opisu w Tabeli 1 zgrupowano je w kilka powszechnie wyrnianych typw, aby nastpnie, na wybranych przykadach omwi niektre z nich bardziej szczegowo.
OPORNO NA ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI

Cecha opornoci bakterii, zwaszcza chorobotwrczych, na antybiotyki jako najbardziej

bezporednio dotykajca czowieka, bya od dawna i wci jest przedmiotem bardzo intensywnych bada naukowcw na caym wiecie. Cecha lekoopornoci jest te fenotypem bakterii najpowszechniej kojarzonym z obecnoci w nich plazmidw z grupy tzw. opornociowych (plazmidy R), chocia naley pamita, e geny warunkujce oporno bakterii na antybiotyki mog by te zlokalizowane w chromosomie komrki. Jednak oporno kodowana plazmidowo istotnie jest przedmiotem szczeglnego zainteresowania, co wynika z kil-

Rnorodno cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy

243

Tabela 1. Przykady fenotypw zalenych od obecnoci plazmidw

Fenotyp Oporno na antybiotyki i inne leki Tetracyklina Streptomycyna Chloramfenikol Penicylina Erytromycyna Sulfamidy Oporno na jony metali cikich Rt Kadm, cynk, kobalt Mied Arsen Produkcja antybiotykw i bakteriocyn Metylenomycyna Kolicyna E1 Kloacyna DF13 Megacyna BII Katabolizm toksycznych zwizkw Toluen (inne przykady patrz Tabela 2) Patogenno bakterii Produkcja hemolizyny Czynnik wirulencji Antygen kolonizacyjny Adhezyna YadA Wirulencja Interakcje z rolinami Rakowate guzy rolin Kdzierzawo korzeni Tworzenie brodawek korzeniowych Wizanie azotu Zdolno do koniugacji F RK2 NR1 pAD1 pSCP1 Inne waciwoci Tworzenie pcherzykw gazowych Pigmentacja Fermentacja laktozy Wykorzystywanie sacharozy pHH1 pPL376 pLM3601 CTnscr94 Escherichia coli Klebsiella aerogenes Shigella flexneri Enterococcus fecalis Streptomyces coelicolor Halobacterium sp. Erwinia herbicola Streptococus cremoris Salmonella senftenberg Plazmid RP4 NR1 R6K R938 R6K pIP1527 pSa NR1(Tn21) pI258 pMOL30 pRJ1004 R773 pSCP1 ColE1 CloDF13 pSE203 TOL (pWWO) Naturalny gospodarz Pseudomosnas aeruginosa Shigella flexneri Proteus rettgeri Serratia marcescens Proteus rettgeri Escherichia coli Shigella sp. Shigella flexneri Staphylococcus aureus Ralstonia eutropha Pseudomonas syringae Escherichia coli Streptomyces coelicolor Escherichia coli Enterobacter cloaceae Bacillus megaterium Pseudomonas putida

pJH1 pX01 pK88 pYV pMYSG6000 pTi pRi pPN1 pIJ1007

Streptococcus faecalis Bacillus anthracis Escherichia coli Yersisnia spp. Shigella flexneri 2a Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Rhizobium leguminosarum Rhizobium leguminosarum

ku powodw. Po pierwsze, bardzo czsto plazmidy nios genetyczne determinanty opornoci na wicej ni jeden antybiotyk rwnocze-

nie, co a priori stwarza utrudnienie w terapii, po drugie, w naturalnych plazmidach opornociowych genetyczne determinanty opornoci

244

MIROSAWA WODARCZYK

na antybiotyki s czsto czci skadow ruchomych elementw genetycznych, transpozonw. Ponadto plazmidy opornociowe s zwykle zdolne do koniugacyjnego transferu swego DNA. Wszystkie te cechy sprzyjaj niebezpiecznemu rozprzestrzenianiu si cechy opornoci na antybiotyki w rodowisku (take szpitalnym!). Poniewa problemowi plazmidowo kodowanej opornoci na antybiotyki powicony jest oddzielny artyku (patrz art. J. PORTYKUS w tym zeszycie KOSMOSU), w tym miejscu poprzestan na podkreleniu kilku wanych oglnych aspektw tego zagadnienia. Najoglniej mwic antybiotyki mona podzieli na kilka kategorii w zalenoci od mechanizmu ich dziaania: takie ktre (i) oddziauj na syntez ciany komrkowej bakterii (b-laktamy), (ii) naruszajce integralno bony cytoplazmatycznej (polimyksyna), (iii) hamujce metabolizm kwasw nukleinowych (kwas nalidyksowy, aktynomycyna D) lub (iv) hamujce syntez biaek (chloramfenikol, streptomycyna). Bakterie wyksztaciy szlaki opornoci tak rnorodne, e potrafi one zapobiec skutecznemu dziaaniu kadego z wymienionych mechanizmw. Oporno na antybiotyk wynika moe na przykad z: (i) detoksyfikacji lub inaktywacji antybiotyku, (ii) zmniejszenia poziomu pobierania antybiotyku lub jego aktywne usuwanie z komrki, (iii) nadprodukcji komrkowego celu dziaania antybiotyku (tzw. tarczy), lub z jej modyfikacji, (iv) wytworzenia zastpczego wobec zahamowanego przez antybiotyk kompletnego szlaku metabolicznego lub tylko jego zablokowanego etapu, czyli tzw. mechanizm bypass. Tylko niektre z drg zyskiwania opornoci na antybiotyk mog wynika z pojedynczej mutacji istniejcego w komrce genu. W wikszoci przypadkw wymagane jest uzyskanie nowego genu (lub kilku genw),

genw te pochodz od mikroorganizmw produkujcych antybiotyki, u ktrych stanowi one naturalne zabezpieczenie przed zabjczym dziaaniem wasnego metabolitu.

OPORNO NA JONY METALI CIKICH

Obecno w rodowisku kationw metali cikich (rtci, niklu, oowiu, kadmu, bizmutu, antymonu czy srebra) oraz niektrych anionw (arsenianw, boranw, chromianw) nie jest rzadka w okolicach uprzemysowionych. S to zwizki wysoce toksyczne dla wszystkich organizmw ywych, take dla wikszoci bakterii. Jednak z gleb i wd zanieczyszczonych tymi zwizkami izolowane s bakterie oporne na ich dziaanie, a najczciej oporno ta warunkowana jest obecnoci plazmidw. W wielu przypadkach mechanizmy opornoci na jony metali cikich zostay poznane bardzo dokadnie. Szczeglnie ciekawy jest system genetyczny warunkujcy oporno bakterii na jony Hg2+ oraz organiczne zwizki rtci. Enzymy uczestniczce w detoksyfikacji tych zwizkw tworz tzw. operon mer i s najczciej zlokalizowane na transpozonach (najlepiej poznane to Tn501 z Pseudomonas aeruginosa i Tn21 z plazmidu NR1 Shigella flexneri). Najistotniejsz cech mechanizmu opornoci bakterii na jony rtci jest wytworzenie wysoce specyficznego systemu transportu zwizkw rtci do wntrza komrki, gdzie s one, z udziaem reduktazy rtcianowej, przeksztacane w mniej toksyczn i lotn form Hg0. W przypadku organicznych zwizkw rtci, system wyposaony jest w dodatkowy enzym, liaz, uwalniajcy rt w formie jonowej przed jej redukcj do formy Hg0 (MISRA 1992). Genetyczna organizacja operonu mer pokazana jest na Ryc. 2.

merR OP merT merP

2+

merA

merD

Ryc.2. Genetyczna organizacja operonu mer (Tn501) warunkujcego oporno na jony rtci.
Geny merT i merA odpowiadaj za transport jonw Hg do wntrza komrki, gen merA koduje reduktaz rtcianow, a geny merR i merD peni funkcje regulacyjne, OP to rejon operatora i promotora.

co, podobnie jak w sytuacji pojawiania si wielorakiej opornoci jest najczciej zwizane z wprowadzeniem do komrki plazmidu opornociowego. Oczywicie nie wyjania to pierwotnego rda genw determinujcych opornoci niesionych przez plazmid. Aktualnie powszechnie akceptowana jest hipoteza, i

Na cakowicie innych zasadach opiera si mechanizm opornoci na Ca2+, Co2+ i Zn2+ (NIES 1992). W tym przypadku, obecne w rodowisku toksyczne jony wnikaj do wntrza komrki niespecyficznie lub przez systemy transportujce jony Mg2+. Jeeli w komrce obecny jest jeden z plazmidw kodujcych

Rnorodno cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy

245

tzw. system CZC, to jony ktre wnikny do komrki ulegaj specyficznemu transportowi na zewntrz. Jednym z najdokadniej scharakteryzowanych plazmidw odpowiedzialnych za oporno bakterii na jony kadmu, kobaltu i cynku jest bardzo duy (238 kb) plazmid pMOL30 zidentyfikowany w Ralstonia eutropha (MERGEAY i wspaut. 1985). Rycina 3 ilustruje zasad opornoci tej bakterii na jony kadmu, cynku i kobaltu warunkowan obecnoci plazmidu pMOL30. + + + 2 2 2

Co

Zn

Cd

Mg

+ 2

plazmid pMOL30

Mg Co
+ 2

+ 2

Zn

+ 2

Cd

+ 2

CzcD
+ 2 + 2

CzcABC
+ 2

Co

Zn

Cd

Ryc. 3. System opornoci Ralstonia eutropha na kobalt, cynk i kadm warunkowanej przez pMOL30. Zasady funkcjonowania w tekcie.

Czytelnikw zainteresowanych problemami plazmidowo kodowanej opornoci na sole metali cikich odsyam do powiconego temu tematowi caego numeru specjalistycznego czasopisma Plasmid 1/1992 oraz do artykuw przegldowych (SILVER i MISRA 1988, SILVER 1996, SILVER i PHUNG 1996).

PRODUKCJA BAKTERIOCYN

Zdolno pewnych bakterii do produkcji antybakteryjnych czynnikw zdolnych do zabijania jedynie szczepw blisko spokrewnionych, lecz niezdolnych do produkcji tyche czynnikw opisana zostaa ju w 1925 r. przez belgijskiego mikrobiologa Andre Gratia jako tzw. principle V (ang. virulence, gdy producent tego czynnika by jednoczenie wirulentny w stosunku do wi). Czynniki te okrelane obecnie oglnie mianem bakteriocyn (lub kolicyn, jeeli producentami s szczepy Escherichia coli) syntetyzowane s najczciej pod

kontrol genetyczn genw zlokalizowanych na plazmidach, ktre jednoczenie nios genetyczne determinanty opornoci (ang. immunity) producenta na dziaanie obecnej w rodowisku bakteriocyny (BAREFOOT i wspaut. 1992, JOERGER i wspaut. 2000). Pod wzgldem chemicznym bakteriocyny to substancje biakowe o masie 2090 kDa, chocia znane s te tzw. mikrocyny o masie <1 kDa. Mechanizm dziaania bakteriocyn na komrki obejmuje zaburzenia struktury i funkcji membran, tzw. depolaryzacj (np. kolicyna E1), uszkodzenia DNA (np. kolicyna E2 dziaajca jako niespecyficzna endonukleza), lub hamowanie syntezy biaek poprzez inaktywacj rybosomowego RNA (kolicyna E3 i kloacyna DF13). Bakteriocyny, jako substancje antybakteryjne o bardzo wskim (w odrnieniu od prawdziwych antybiotykw) spektrum dziaania, nie znalazy szerszego zastosowania praktycznego. Zasadniczo jedynie produkowana przez Lactococcus lactis nizyna (ktra jest jednak kodowana przez geny chromosomowe) znalaza prawnie usankcjonowanie zastosowanie jako konserwant ywnoci. Prby stosowania bakteriocyn w medycynie weterynarii s wci w stadium niezbyt zaawansowanym. Systemy genetyczne determinujce produkcj bakteriocyn (np. kolicyny E1 kodowanej przez plazmid ColE1 czy kloacyny kodowanej przez plazmid CloDF13) s jednak niezwykle ciekawe w swojej organizacji i regulacji i choby z tego powodu wzbudzaj due zainteresowanie badaczy (LURIA i SUIT 1992). Zesp genw stanowicych kaset kolicynow plazmidu ColE1 przedstawiony jest na Ryc. 4. Ciekaw cech systemu jest to, e wytwarzanie kolicyny jest zabjcze dla producenta, gdy uwolnienie produktu genu cea do rodowiska zwizane jest z liz komrki przy udziale produktu genu kil. Jednak cay ten zlokalizowany na plazmidzie system jest w stanie represji wynikajcej z zablokowania gwnego promotora (Pcol) przez komrkowe biako LexA, i praktycznie w populacji nie wicej ni 10-3 komrek na generacj produkuje aktywnie kolicyn i w wyniku samobjczego aktu wydziela j do rodowiska. Komrki nie produkujce aktualnie kolicyny, lecz niosce plazmid ColE1, s chronione przed dziaaniem egzogennej kolicyny dziki funkcji produktu genu imm, (ulegajcemu ekspresji take z wasnego promotora, patrz Ryc. 4), natomiast eliminacji ze rodowiska ulegaj pokrewne bakterie bezplazmidowe. Wszelkie sytuacje powodujce zniszczenie

246

MIROSAWA WODARCZYK

represora (biaka LexA), a wic indukujce komrkowy system SOS uruchamiaj jednoczenie lawinow produkcj kolicyny przez ca populacj nioscych plazmid bakterii. Biologiczny sens zjawiska bakteriocynogenii rozwaany jest gwnie w aspekcie roli tego zjawiska w rodowisku, w ktrym bakterie dysponujce takim egzotycznym mechanizmem zyskuj przewag selekcyjn nad wspistniejcymi bakteriami bezplazmidowymi (RILEY i GORDON 1999).

mysowych zwizkw to substancje toksyczne. Z bakterii yjcych w zanieczyszczonych glebach, wodach i osadach dennych izolowano plazmidy niosce geny kodujce szlaki metaboliczne odpowiedzialne za degradacj zarwno prostych zwizkw organicznych, jak np. alifatyczne (oktan), jednopiercieniowe aromatyczne (fenol, toluen) wglowodory, zwizki aromatyczne wielopiercieniowe (naftalen, bifenyl) i heterocykliczne (nikotyna) jak rwnie licznych, bardzo toksycznych ich chloropo-

Pcol

cea

imm

kil

Pimm
Ryc. 4. Schemat kasety kolicynowej plazmidu ColE1.
Gen cea koduje biako kolicyny ColE1, imm biako immunity, kil biako lityczne, uwalniajce kolicyn z komrki. P indukcyjny promotor caego systemu, P niezaleny promotor genu imm.
col imm

Zjawisko bakteriocynogenii jest do powszechne wrd rnych grup bakterii i w wikszoci przypadkw jest zwizane z obecnoci plazmidw. Najlepiej poznane s plazmidy warunkujce syntez kolicyn. Wyrniamy wrd nich dwie grupy; mae plazmidy niekoniugacyjne (ColE1, CloDF13) oraz due plazmidy koniugacyjne, ktre czsto determinuj produkcj wicej ni jednej kolicyny, a take nios geny opornoci na antybiotyki oraz geny wirulencji (ColIb, ColIa, ColV). Co ciekawe, najpopularniejszy plazmid kolicynogenny, opisany wyej ColE1, sw saw zawdzicza nie tyle zjawisku kolicynogenii, ile moliwoci prostego dostosowania jego czsteczki do roli wektora do klonowania genw. System replikacyjny typu ColE1 obecny jest w wielu wektorach, zarwno oglnego (np. pBR322), jak i specjalistycznego (pUC18 , pBluScript, pTZ19U itp.) zastosowania.

BIODEGRADACJA TOKSYCZNYCH ZWIZKW ORGANICZNYCH (PLAZMIDY KATABOLICZNE)

Oglnie znana jest nieograniczona wrcz rola bakterii w procesach biodegradacji gromadzcej si w rodowisku materii organicznej w wyniku wykorzystywania tyche zwizkw jako rde wgla i energii. Jednak wiele naturalnych lub syntetyzowanych w prowadzonych przez czowieka procesach prze-

chodnych (WALLACE i SAYLER 1992, TOP i wspaut. 2000, HAY i wspaut. 2000). Plazmidy takie okrelamy ogln nazw plazmidw degradacyjnych lub katabolicznych, a przykady degradowanych z ich udziaem zwizkw przedstawione s w Tabeli 2. Szlaki kataboliczne prowadzce do przeksztacenia toksycznych substancji w metabolity porednie, ktre mog by nastpnie wprowadzone do tzw. metabolizmu podstawowego s zwykle do skomplikowane i moe w nich uczestniczy nawet kilkanacie enzymw kodowanych przez geny o plazmidowej lokalizacji. Oglne wyobraenie o roli plazmidw degradacyjnych w katabolizmie toksycznych zwizkw organicznych daje schemat na Ryc. 5. Wida tu jednoczenie, e w wielu przypadkach wanym metabolitem porednim jest katechol, ktry dalszym przemianom moe ulega w dwojaki sposb: wedug szlaku metakodowanego przez geny plazmidowe lub ortokodowanego przez geny chromosomowe. Jednym z najlepiej scharakteryzowanych szlakw degradacji fenolu jest plazmidowo kodowany system obecny w Pseudomonas sp.CF600. Na plazmidzie pVI150 obecnym w tym szczepie zidentyfikowano 16 genw zorganizowanych w jeden operon dmp, poznano produkty tych genw, ich funkcje i sposb regulacji (PAWLOWSKI i SHINGLER 1994). Naleaoby wspomnie, e pierwszym zidentyfikowanym w 1974 r. plazmidem degra-

Rnorodno cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy

247

Tabela 2. Przykady toksycznych zwizkw (naturalnych i syntetycznych) degradowanych pod kontrol genw plazmidowych
Nazwa degradowanego zwizku Oktan, dekan Niecykliczne izoprenoidy Salicylan Benzen Anilina Styren Bifenyl Nikotyna Dibenzotiofen Chlorobenzen Kwas 3-chlorobenzoesowy (3CBA) Kwas para-toluenosulfonowy Polichlorobifenyle (PCBs) Oligomer nylonu Paration Kwas dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) Plazmid OCT pSRQ50 SAL1 pWW174 pCIT1 pEG pWW100 NIC pDBT2 pP51 pBR60 pTSA pSS60 pKF1 pOAD2 pCS1 pJP4 Szczep bakterii Pseudomonas oleovorans PpG6 Pseudomonas putida PPU2 Pseudomonas putida R1 Acinetobacter calcoaceticus Pseudomonas sp. CIT1 Pseudomonas putida ST Pseudomonas sp. CB406 Pseudomonas convexa Pcl Pseudomonas alcaligenes DBT2 Pseudomonas sp. P51 Alcaligenes sp. BR60 Comamons testosteroni T-2 Achromobacterium sp. Arthrobacter sp. Flavobacterium sp. Pseudomonas diminuta Ralstonia eutropha

dacyjnym by plazmid TOL (117 kb) z Pseudomonas putida, ktremu nastpnie nadano symbol pWWO i sta si on prototypem duej grupy plazmidw TOL odpowiedzialnych za degradacj toluenu i jego pochodnych. Pierwsza cz szlaku katabolizmu toluenu (tzw. grny operon), prowadzca do przemiany toluenu do katecholu, jest przedstawiona na

toluen kamfora benzen

naftalen salicylan katechol

p-krezol

szlaki zalene od genw plazmidowych szlaki zalene od genw chromosomowych METABOLIZM PODSTAWOWY

rozprzestrzenianie si w rodowisku nawet jeeli plazmid bdcy pierwotnym nonikiem transpozonu nie moe replikowa si w nowym gospodarzu (TAN 1999). Przykady transpozonw katabolicznych to Tn4651 (z pWWO), Tn4655 (z plazmidu NAH7), Tn5280 (z pP51 degradacja chlorokatecholu), Tn4371 (obecny w wielu plazmidach IncP1). Plazmidy kataboliczne s niezmiernie wane z praktycznego punktu widzenia. Znajduj one szerokie zastosowanie w procesach bioremediacji. Wiele z nich posuyo do konstrukcji chronionych patentami systemw wykorzystywanych w profesjonalnych urzdzeniach usuwajcych zanieczyszczenia ze ciekw, gleby wok zakadw przemysowych i innych skaonych miejsc.

CECHY ZWIZANE Z PATOGENNOCI BAKTERII WOBEC CZOWIEKA I ZWIERZT

Ryc. 5. Schematyczne przedstawienie roli plazmidw katabolicznych w szlakach degradacji zwizkw toksycznych.

Ryc. 6. Geny kodujce enzymy szlakw degradacyjnych zgrupowane w operony s czsto zlokalizowane na transpozonach, co pozwala na ich efektywny transfer midzy obecnymi w komrce replikonami, a take na horyzontalne

Genetyczna determinacja zjawiska patogennoci bakterii (czyli ich zdolnoci do wywoywania chorb) to problem bardzo zoony. Wiele spord czynnikw odpowiedzialnych za patogenno bakterii, czyli tzw. czynnikw wirulencji, jest kodowanych przez geny umiejscowione na plazmidach. Naley jednak zda sobie spraw, ze czynnikw ktre moemy uwaa za zwizane z chorobotwr-

248
CH3
TOLUEN 1

MIROSAWA WODARCZYK

CH2OH
ALKOHOL BENZYLOWY 2

CHO
ALDEHYD BENZYLOWY 3

COOH
BENZOESAN 4

HOOC
1-2 DIHYDROKSYCYKLOHEKSADIENO KARBOKSYLAN

OH

OH

OH OH
KATECHOL

szlak meta(plazmidowy)

szlak orto(chromosomowy)

aldehyd octowy + pirogronian

acetylokoenzym A + bursztynian

Ryc. 6. Szlak degradacyjny toluenu determinowany przez geny zlokalizowany na plazmidzie pWWO.
Enzymy przeprowadzajce kolejne reakcje: (1) monoksygenaza ksylenowa, (2) dehydrogenaza alkoholu benzylowego, (3) dehydrogenaza aldehydu benzylowego, (4) oksygenaza toluenianowa, (5) dehydrogenaza dwuhydroksycykleheksadienokarboksylenowa.

czoci jest wiele. Jednym z omawianych ju czynnikw jest chociaby cecha opornoci bakterii na antybiotyki. Oczywicie brak tej cechy nie zmienia zdolnoci patogenu do wywoania choroby, ale jej wystpowanie stwarza ogromne problemy w terapii. Wrd czynnikw bezporednio zaangaowanych w proces wywoywania choroby, kodowanych przez geny plazmidowe, moemy wyrni zdolno do adhezji do powierzchni odpowiednich komrek atakowanej tkanki i ewentualnej penetracji do wntrza komrki, rozprzestrzenianie si midzy komrkami (czyli inwazyjno patogena), zdolno do produkcji rnego typu toksyn, oporno na antybakteryjne czynniki obecne w surowicy (ang. serum resistance) itp.

Dla zilustrowania roli plazmidw w procesach patogenezy bardzo spektakularne (aczkolwiek dobrane zupenie arbitralnie) s zjawiska zwizane z wirulencyjnymi plazmidami popularnych enteropatogenw takich jak Salmonella i Shigella, a take rola plazmidw w uzjadliwianiu si szczepw nieszkodliwego komensala, mieszkaca naszego jelita, czyli paeczki okrnicy, E. coli (BAHRANI- MOUGEOT i DONNENBERG 2000). Na przykadzie chorobotwrczych szczepw Salmonella i Shigella moemy przeledzi te bardzo ciekawe zjawisko wspdziaania genw chromosomowych i plazmidowych w warunkowaniu zdolnoci bakterii do wywoania kompletnego procesu chorobowego. Bakterie z rodzaju Salmonella s jedn z najczstszych przyczyn zakae pokarmowych (dur brzuszny, dur rzekomy) przejawiajcych si jako zapalenia jelita cienkiego lub grubego, ale take s odpowiedzialne za znacznie groniejsze tzw. infekcje systemowe u ludzi i zwierzt. Wiele genw zwizanych z wirulencj, zwaszcza tych wymaganych do adhezji i inwazji komrek nabonka, ale take odpowiedzialnych za oporno na fagocytoz odnaleziono w tzw. wyspach patogennoci (SPI) w chromosomie (MARCUS i wspaut. 2000). Jednak powszechna jest take obecno w rnych serowarach Salmonella tzw. plazmidw wirulencji (ROTGER i CASADESUS 1999). S to plazmidy heterogenne, zazwyczaj due (50 ponad 200 kb), lecz wiele z nich zawiera konserwanty (~8 kb) region, w ktrym zlokalizowany jest operon spv, ktrego produkty wymagane s do kolonizacji gbiej pooonych tkanek. Potwierdza to fakt, e szczepy bezplazmidowe wywouj objawy zapalne jelita, lecz nie s zdolne do infekcji systemowej. Kilka spord plazmidw wirulencji Salmonella (np. pSLT, 94 kb plazmid z S. typhimurium LT2 oraz plazmidy pHCM1 i pHCM2 z S. enterica CT18) zostao kompletnie zsekwencjonowanych, a poniewa od niedawna znana jest take kompletna sekwencja nukleotydowa chromosomw szczepw LT2 i CT18 naley spodziewa si znacznego postpu w zrozumieniu molekularnych mechanizmw wirulencji tego patogena, w tym take roli genw plazmidowych w tym zjawisku. Take wikszo genw wirulencji odpowiedzialnych za chorobotwrczo Shigella spp. gwnego czynnika etiologicznego bakteryjnych dezynterii, zlokalizowanych jest na duych, ~220 kb plazmidach obecnych we

Rnorodno cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy

249

wszystkich chorobotwrczych szczepach Shigella oraz enteroinwazyjnych szczepach E. coli. W 2001 r. poznano kompletn sekwencj nukleotydow jednego z plazmidw wirulencji Shigella (pWR501 z S. flexneri, VENKATESAN i wspaut. 2001); okazao si, e geny zwizane z wirulencj stanowi a 35% jego genomu. Geny te zgrupowane s w funkcjonalne zespoy. Na przykad na ~30 kb fragmencie DNA plazmidowego zlokalizowane s geny ipa (ang. invasion plasmid antigens) kodujce biaka niezbdne do adhezji (IpaD) i inwazji (Ipa A,B,C), oraz geny mxi (10 loci) i spa genetyczne determinanty specyficznego systemu sekrecyjnego tych biaek. Na innym fragmencie plazmidu zgrupowane s geny warunkujce midzykomrkowe rozsiewanie si bakterii (icsA i icsB). Natomiast wiele genw regulacyjnych caego systemu mieci si w chromosomie. Rwnie chromosomow lokalizacj maj geny kodujce letaln cytotoksyn produkowan tylko przez S. dysenteriae (tzw. Shiga toxin) odpowiedzialn za wywoywanie najciszego przejawu shigellozy, tzw. zespou HUS (ang. hemolytic uremic syndrome), prowadzcego do trwaego uszkodzenia nerek oraz powanych symptomw neurologicznych. Nieplazmidowa lokalizacja genw kodujcych t toksyn jest dla czowieka korzystna, obnia bowiem prawdopodobiestwo przenoszenia si tego niebezpiecznego fenotypu do szczepw innych enteropatogenw. Wiele zjadliwych, tzw. enteropatogennych (EPEC) szczepw E. coli, wywouje objawy podobne do zakae Shigella spp.; w nich stwierdzono obecno plazmidw (podobnych do wirulencyjnych plazmidw Shigella) odpowiedzialnych za niektre objawy chorobowe, inne wynikaj z pojawienia si w chromosomie wysp patogennoci. Kilka lat temu due zainteresowanie wzbudza izolowany w 1982 r. enterohemokrwotoczny (EHEC) szczep E. coli oznaczony symbolem O157:H7. Produkuje on dwie grone werotoksyny (STX-1 i STX-2), podobne do wspomnianej wyej toksyny Shiga toxin, a zachorowa mona po spoyciu pokarmu zakaonego bardzo ma dawk bakterii (10100 komrek), trudn do wykrycia w czasie rutynowej kontroli procesu technologicznego (np. produkcji hamburgerw). Dla analizowanego tematu wana jest informacja, e szczep ten niesie 93 kb plazmid (pO157) kodujcy szereg cech zwizanych z patogennoci swego gospodarza (BURLAND i wspaut. 1998).

Przedstawione przykady nie wyczerpuj tematu moim celem byo jedynie zasygnalizowanie roli plazmidw w tak wanym i bezporednio dotykajcym czowieka temacie jakim jest genetyczna determinacja procesw patogenezy. Przykady innych plazmidowo-kodowanych cech odgrywajcych rol w zdolnoci bakterii do wywoywania procesu chorobowego zamieszczono w Tabeli 1.
INTERAKCJE BAKTERII Z KOMRKAMI ROLINNYMI

Niewtpliwie najlepszym modelowym ukadem do zaprezentowania tematu zawartego w tytule rozdziau jest analiza roli duych (>200 kb) plazmidw Ti oraz Ri w genetycznym uwarunkowaniu procesu powstawania rakowatych naroli (ang. crown gall tumors) lub wosowatoci/kdzierzowatoci korzeni (ang. hairy roots) w wyniku infekcji roliny (najczciej dwuliciennej) przez szczepy Agrobacterium tumefaciens lub A. rhizogenes. Jest to system bardzo zoony, wymagajcy wspdziaania wielu genw chromosomowych i plazmidowych bakterii, lecz jego efekt biologiczny jest unikatowy cz genomu plazmidowego, fragment okrelany jako T-DNA, zostaje wprowadzony w procesie specyficznego rodzaju koniugacji, warunkowanego przez zesp plazmidowych genw vir do komrki rolinnej, aby nastpnie wnikn do jej jdra komrkowego i trwale wbudowa si do chromosomowego DNA. Konsekwencj tej integracji jest indukcja niekontrolowanych podziaw komrek prowadzcych do utworzenia rakowatego guza u nasady odygi roliny (Ti plazmid), ale take do syntezy specyficznych substancji (typu opin lub nopalin) stanowicych unikatowe rdo substancji odywczych dla bakterii nioscych plazmid (Ti lub Ri) wyposaony w geny umoliwiajce katabolizm tych wanie zwizkw. Naszkicowany tutaj krtki zarys procesu jest rozbudowany w odrbnym artykule (patrz art. A. ZIEMIENOWICZ w tym zeszycie KOSMOSU), tame mona znale odsyacze do innych pozycji literatury z tego tematu. Wspomniany artyku przedstawia take drogi modyfikacji tego naturalnego procesu biologicznego dla celw konstrukcji systemu przydatnego w tworzeniu transgenicznych rolin. Innym przykadem udziau genw plazmidowych w procesach oddziaywania pomidzy bakteriami a rolinami jest zaleno pomidzy

250

MIROSAWA WODARCZYK INNE WYBRANE WACIWOCI FENOTYPOWE

zdolnoci rolin motylkowych do wizania azotu czsteczkowego z powietrza a ich symbiotycznym zwizkiem z bakteriami z rodziny Rhizobiaceae, ktre dla uproszczenia okrelam dalej oglnym terminem rizobia (FREIBERG i wspaut. 1997) Plazmidy w rizobiach wystpuj bardzo powszechnie, a niektre z nich s bardzo due, osigajc wielko nawet 1700 kb (=1,7 Mb), czyli wiksz ni niektre bakteryjne chromosomy. Nawiasem mwic, to w stosunku do tych plazmidw zastosowano pierwotnie termin megaplazmidy, ktry nastpnie rozszerzono na inne plazmidy, te bardzo due lecz nie przekraczajce wielkoci 1 Mb (np. wymieniany wyej megaplazmid pMOL30 0,24 Mb). Rizobia wyksztaciy bardzo skomplikowane symbiotyczne zwizki z korzeniami rolin motylkowych, przejawiajce si tworzeniem brodawek korzeniowych, w ktrych nastpuje proces enzymatycznej redukcji azotu czsteczkowego. Lista genw symbiotycznych zidentyfikowanych w rizobiach liczy ponad 50 pozycji. Wiele spord genw determinujcych proces symbiozy mieci si na tzw. plazmidach symbiotycznych (pSym), inne w chromosomie. W rnych gatunkach dystrybucja tych genw pomidzy rne replikony w komrce nie jest jednakowa. Gwne grupy genw to: zesp genw odpowiedzialnych za tworzenie brodawek (nod), ich rozwj (ndv), specyficzno wobec gospodarza (hsn), tzw. efektywno nodulacji (nfe), za syntez komponentw strukturalnych powierzchni komrki takich jak np. egzoopolisacharydy (exo) oraz genw, ktrych produkty zwizane s bezporednio z procesem wizania azotu: nif (gen strukturalny nitrogenazy), hem (gen strukturalny leghemoglobiny chronicej nitrogenaz przed destrukcyjnym dziaaniem tlenu) i wiele innych. Rizobia zawieraj take liczne plazmidy tzw. niesymbiotyczne (MERCADO-BLANCO i TORO 1996), ktre, chocia nie nios genw bezporednio zaangaowanych w proces symbiotycznego wizania azotu odgrywaj wan rol w adaptacji komrek gospodarza do lokalnych warunkw rodowiskowych, chociaby dziki kodowaniu enzymw pozwalajcych na katabolizm rnych nietypowych zwizkw obecnych w ryzosferze (pRtrW14-2c), jak te np. tolerancj niskiego pH (pRtrANU1173b), podwyszonego stenia chlorku sodu (pRtrW14-2b) itp., co pozwala przetrwa potencjalnym symbiontom w okresie tzw. freeliving state (TOP i wspaut. 2000).

W tej czci, stosujc absolutnie subiektywne kryteria, chc wskaza niektre kodowane przez plazmidy fenotypy, ktre nie zostay zakwalifikowane do wyej wyrnionych grup, a wedug mojej oceny rozszerzaj i urozmaicaj wachlarz kodowanych plazmidowo cech. I tak na przykad, poza wyej wymienionymi typami opornoci (oporno na antybiotyki, na substancje toksyczne), obecno plazmidu R46 w S. typhimurium lub plazmidu pMK101 w E. coli powoduje efekt ochronny (a wic zwiksza oporno) wobec letalnego skutku dziaania promieniowania UV, przy jednoczesnym zwikszonym poziomie jego (UV) mutagennoci. Wydaje si, e obserwowany fenotyp wynika z aktywacji systemu naprawczego typu error prone czyli powodujcego bdy podczas naprawy. Podobny efekt w stosunku do P. aeruginosa wywouj plazmidy R takie jak: pMG1, R2, R931. Take wiele spord genw odpowiedzialnych za niezwyk w wiecie ywym oporno na promieniowanie jonizujce bakterii Deinococcus radiodurans mieci si na duym plazmidzie pMP1 (177 kb). Niektre proste waciwoci metaboliczne, u pewnych gatunkw bakterii s kodowane przez geny plazmidowe. Jako przykady mog posuy: fermentacja laktozy przez Streptococcus cremoris (pML3601), dekarboksylacja lizyny przez Proteus morgani (pGC1070), wykorzystywanie sacharozy przez S. senftenberg (CTnscr94), produkcja proteazy przez Streptococcus lactis (pLM3001), a take zdolno Ralstonia eutropha do utleniania wodoru (pHG1). Plazmidy koduj takie cechy jak: zdolno do produkcji antybiotykw (plazmid pSCP1 u Streptomyces coelicolor), insektocydobjczego biaka (pHD2 u Bacillus thuringiensis), pigmentacj (pPL376 u Erwinia herbicola) oraz pcherzykw gazowych przez halofilnego archeona (pHH1 u Halobacterium sp.). Dalsze wyliczanie cech kodowanych przez geny zlokalizowane w genomach plazmidowych wyduaoby te list czynic j nuc dla Czytelnika a przecie nowe jej pozycje pojawiaj si nieustannie. Na zakoczenie tego przegldu chciaabym wspomnie o nowej, opisanej w 2001 r. waciwoci bakterii E. coli nioscych plazmid F. Okazao si, e ten najstarszy i niemal doskonale scharakteryzowany plazmid (patrz nastpny rozdzia) poza zdolnoci do

Rnorodno cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy

251

koniugacji warunkuje zdolno komrek do tworzenia bon biologicznych (GHIGO 2001),

w czym kluczow, rol, niewtpliwie odgrywaj pilusy.

ZDOLNO BAKTERII DO KONIUGACYJNRGO TRANSFERU DNA

Przenoszenie si plazmidw z komrki do komrki, zarwno w rodowisku naturalnym, jak i w laboratorium, czyli tzw. transfer horyzontalny, moe nastpowa w wyniku transformacji, transdukcji i koniugacji. Jednak jedynie w przypadku koniugacji kluczowe genetyczne determinanty takiego procesu zlokalizowane s w obrbie DNA plazmidowego, a plazmidy niosce takie determinanty nazywamy plazmidami koniugacyjnymi. Koniugacyjny transfer materiau genetycznego pomidzy bakteriami to zagadnienie bardzo obszerne; doczekao si ono bardzo wielu opracowa przegldowych, do ktrych odsyam zainteresowanych Czytelnikw (np. CLEWELL 1993, FIRTH i wspaut. 1996, ZATYKA i THOMAS 1998, WODARCZYK 1998, FROST 2000, ZECHNER i wspaut. 2000), a w tym miejscu zwracam jedynie uwag na niektre aspekty tego zjawiska. Prototypem plazmidu koniugacyjnego bakterii Gram-ujemnych jest plazmid F Escherichia coli. Struktura genetyczna regionu czsteczki plazmidu F odpowiedzialnego za koniugacyjny transfer jego DNA (tzw. region tra ang. transfer) zostaa bardzo dokadnie poznana. Region tra plazmidu F obejmuje okoo 33 kb (co stanowi niemal 30% wielkoci jego
RepFIC IS3 Tn1000 100/0 Tra
80 90 10 20

czsteczki) i niesie ponad 35 genw. Wrd nich wyrniamy du grup genw warunkujcych syntez pilusw (tworzenie materiau budulcowego piliny i jej montowanie w ostateczn form strukturaln) odgrywajcych rol w tworzeniu par koniugacyjnych, geny kodujce biaka stabilizujce pary koniugacyjne oraz geny odpowiedzialne za proces koniugacyjnego metabolizmu DNA. W tej ostatniej grupie genw bardzo wan funkcj peni gen traI kodujcy biako o aktywnoci helikazy (enzymu rozwijajcego helis DNA), lecz take aktywnoci nikazy, wprowadzajcej specyficzne nacicie nici DNA w miejscu oriT (ang. origin of transfer), od ktrego zaczyna si proces rozwijania DNA i przekazywania nici o wolnym kocu 5 do komrki biorcy. W obszarze tym znajduj si take geny regulacyjne caego systemu tra. Organizacja genetyczna regionu tra plazmidu F przedstawiona jest w sposb uproszczony na Ryc. 7. Plazmidw posiadajcych system tra, homologiczny do opisanego w plazmidzie F jest wrd plazmidw bakterii Gram-ujemnuch bardzo wiele, okrelamy je zbiorcz nazw plazmidw F-like, czyli podobnych do F (np. NR1, ColV, R6, pSC50, R386 oraz kilkadziesit innych). Na oglnie podob-

a)
IS3 IS2

F
60 50 40

Ryc. 7. Uproszczona mapa genetyczna caego plazmidu F (a) oraz jego regionu tra (b).
Na mapie zaznaczono lokalizacj systemw replikacyjnych plazmidu F (RepF), regionu tra punktu pocztkowego transferu (oriT) oraz elementw translokacyjnych IS i TN (a), oraz w czci (b): 16 genw warunkujcych syntez pilusw pciowych (wysokie szare supki), geny koniugacyjnego metabolizmu DNA (M-Y-D-I), geny odpowiedzialne za stabilizacj par i wykluczanie powierzchniowe (N-S-T-G), oraz geny regulacyjne (J, finO, finP). Pominito geny, ktrych funkcja nie jest w peni jasna.

70

30

oriT

RepFIB RepFIA

b)
HG ST D h I X finO

ALEKB V C i W Uc M finP J Y

F N e a Qbjf

Pd g R

oriT

70

80

90

100

F (kb)

252

MIROSAWA WODARCZYK

nej zasadzie (kontakt komrek warunkowany obecnoci specyficznych struktur powierzchniowych, pilusw pciowych, syntetyzowanych pod kontrol genw plazmidowych) dziaaj systemy koniugacyjne determinowane przez plazmidy z grupy IncP. W odrnieniu od bardzo wyspecjalizowanego systemu koniugacyjnego warunkowanego przez plazmid F, plazmidy koniugacyjne z grupy IncP umoliwiaj transfer koniugacyjny w obrbie szerokiego krgu niespokrewnionych filogenetycznie bakterii (system typu broad host range). Czasem plazmid nie niesie penego kompletu genw potrzebnych do przeprowadzenia procesu koniugacji, lecz przy pomocy innego plazmidu, tzw. mobilizujcego, jego DNA moe by przekazany do komrki biorcy. O takich plazmidach mwimy, e s one mobilizowalne (Mob+); przykadem plazmidu mobilizowalnego jest znany nam ju ColE1. Na zupenie innej zasadzie funkcjonuje system koniugacyjny Gram-dodatniej bakterii Enterococcus faecalis. W tym przypadku plazmid koniugacyjny (np. pAD1) jest elementem skadowym mechanizmu odpowiadajcego na wytwarzane przez szczep biorcy, pod kontrol genw chromosomowych, feromony pciowe. Warunkuje on syntez przez komrk dawcy substancji agregacyjnej (adhezyny), niezbdnej do utworzenia par lub agregatw koniugacyjnych.

Jeszcze inny mechanizm odpowiada za koniugacyjny transfer u promieniowcw (Streptomyces sp.). Plazmidy koniugacyjne promieniowcw mog by mae (9 kb plazmid pIJ101) lub bardzo due (liniowy plazmid SCP1 350 kb). Wiele spord tych plazmidw wykazuje waciwo CMA (ang. chromosome mobilizing activity). Genetyczne uwarunkowanie systemu koniugacyjnego plazmidw Streptomyces nie jest tak dokadnie poznane jak systemw wspomnianych wyej. Zjawisko zalenej od plazmidw koniugacyjnej wymiany materiau genetycznego, ktre jest moliwe nie tylko midzy blisko spokrewnionymi szczepami (plazmid F), ale take gatunkami bakterii odlegymi filogenetycznie (systemy obecne na plazmidach z grupy IncP), a nawet midzy rnymi domenami wiata ywego (np. bakterie/roliny), zwaszcza, e moe zachodzi nie tylko w laboratorium, ale i w rodowiskach naturalnych, ma zupenie niewymierny udzia w kreniu i mieszaniu si puli materiau genetycznego caego wiata ywego. W tym momencie nie naley zapomina, e plazmidy tzw. koniugacyjne zwykle nios take geny determinujce opisane powyej przerne inne waciwoci bakterii, ktre w akcie koniugacji take przekazywane s nowym gospodarzom.

PODSUMOWANIE

Problem pochodzenia plazmidw, drg i mechanizmw ich ewolucji to zagadnienie samo w sobie bardzo ciekawe i zoone i wykracza poza przyjte ramy tego rozdziau. Pytanie, ktre nasuwa si jednak niewtpliwie po spojrzeniu na wielo i rnorodno funkcji jakie plazmidy mog peni w komrkach swoich gospodarzy to dlaczego wobec tylu korzyci pyncych z posiadania plazmidw nie s one po prostu czci chromosomu gospodarza, ktry wtedy w kadej sytuacji mgby korzysta z ich obecnoci ? Najbardziej oczywiste wyjanienie tej sytuacji to konieczno utrzymania wielkoci chromosomu w rozsdnych granicach mniejszy chromosom replikuje si szybciej ni duy, co w przypadku bakterii moe stanowi wany czynnik dajcy przewag selekcyjn poprzez moliwo skrcenia czasu generacji, szybszego namnaania si i zdominowania jakiej niszy

ekologicznej. Plazmidy replikujce si jako autonomiczne jednostki, niezalene od chromosomu nie wpywaj w znaczcy sposb na tempo wzrostu populacji bakteryjnej. Oczywicie konieczno replikowania dodatkowego DNA w komrce (nawet tego teoretycznie autonomicznego) jest dla niej pewnym obcieniem metabolicznym, jednak to obcienie w mniejszym stopniu odbija si na czasie generacji komrki ni gdyby replikacji ulegaa jedna dua struktura. Ponadto, poniewa cechy fenotypowe zalene od konkretnych plazmidw nie s komrce potrzebne w kadej sytuacji, w populacji nie poddawanej odpowiedniej presji selekcyjnej (czyli gdy nie istniej warunki wymagajce korzystania z tych potencjalnych moliwoci) plazmidy moe zachowa tylko niewielka frakcja bakterii, ktra w warunkach zagroenia zdominuje bakterie bezplazmidowe majc nad nimi przewag selekcyjn.

Rnorodno cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy

253

Innym elementem, ktry naley potraktowa jako uzasadniajcy funkcjonowanie plazmidw w formie jednostek genetycznych odrbnych od chromosomw, to wanie fakt, e zawarta w nich olbrzymia pula informacji genetycznej moe by, poprzez uatwion (w porwnaniu z pul informacji zawartej w chromosomie) wymian horyzontaln z innymi organizmami. traktowana jako uniwersalny, oglnie dostpny magazyn genw.

Na zakoczenie pozwol sobie sformuowa myl, ktr kiedy uyam jako tytu swego wykadu na Festiwalu Nauki: BAKTERIE POTRAFI PRAWIE WSZYSTKO ALE TYLKO DZIKI PLAZMIDOM

Serdecznie dzikuj Dr Dariuszowi Bartosikowi za przygotowanie ilustracji do obu artykuw mojego autorstwa.

DIVERSITY OF PLASMID ENCODED BACTERIAL PHENOTYPIC TRAITS

S u m m a r y Preceded by general information on the type of genes existing as obligatory or facultative modules in plasmid genomes, the range of bacterial phenotypic functions depending on plasmid located genes is reviewed. The plasmid encoded functions are divided into several commonly distinguished functional groups. Representatives of the individual groups are characterized in more detail except for those dealt with in separate articles of this issue. Special attention is given to the plasmid-encoded mechanisms of bacterial resistance to heavy metal ions (mercury, cadmium, zinc and cobalt) as well as to plasmid-dependent pathways of the degradation of natural and man-made toxic substances. The phenomenon of plasmid dependent bacteriocinogeny is presented. Also several examples of the role of plasmids in the relationship of bacteria with eukaryotic organisms are given. The last subject covered concerns the plasmid-encoded functions involved in the pathogenicity of bacteria to humans as well as the role of rhizobial plasmids in symbiotic relations with nitrogen fixing plants. A section presenting a general description of the role of plasmids in conjugational horizontal gene transfer is also included.

LITERATURA
BAHRANI-MOUGEOT F. K., DONNENBERG M.S., 2000. Enteropathogenic bacteria. [W:] Encyclopedia of Microbiology. LEDERBERG J. (red). Academic Press. Wyd. 2, 187200. BAREFOOT S. F., HARMON K. M., GRINSTED D. A. NETTLES C. G., 1992. Bacteriocins, Molecular biology. [W:] Encyclopedia of Microbiology. LEDERBERG J. (red.). Academic Press, San Diego, New York, Boston, 417430. BURLAND V., SHAO Y., PERNA N.T. PLUNKETT G., SOFIA H. J., BLATTNER F. R., 1998. The complete DNA sequence and analysis of the large virulence plasmid of Escherichia coli O157:H7. Nucleic Acid Res. 28, 41964204. CLEWELL D. B., 1993. Bacterial Conjugation. Plenum, New York. FIRTH N., IPPEN-IHLER K., SKURRAY R. A., 1996. Structure and function of the F factor and mechanism of conjugation. [W:] Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology. NEIDHARDT F.C. (red.). ASM Press, Washington, D.C., 32773401. FREIBERG C., FELLAY R., BAIROCH A., BROUGHTON W. J., ROSENTHAL A., PERRET X., 1997. Molecular basis of symbiosis between Rhizobium and legumes. Nature 387, 394401. FROST L. S, 2000. Conjugation, bacterial. [W:] Encyclopedia of Microbiology. LEDRBERG J. (red). Academic Press, Wyd. 2, 847862. GHIGO J. M., 2001. Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature 412, 442445. HAY A.G., RIPP S., SAYLER G. S., 2000. Plasmids, catabolic. [W:] Encyclopedia of Microbiology. LEDERBERG J. (red.). Academic Press, Wyd. 3, 730744. JOERGER R. D., HOOVER D. G., BAREFOOT S. F., HARMON K. M., GRINSTEAD D. A., NETTLES CUTTER C. G., 2000. Bacteriocins. [W:] Encyclopedia of Microbiology. LEDREBERG J. (red.). Academic Press, Wyd. 1, 383397. LURIA S. E., SUIT J. L., 1987. Colicins and Col plasmids. [W:] Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology. NEIETHARDT F. C. (red). ASM Press, Washington, D.C., 16151624. MAHILLON J., LEONARD C., CHANDLER M., 1999. IS elements as constituents of bacterial genomes. Res. Microbiol. 150, 678687. MARCUS S. L., BRUMELL J. H., PFEIFER C. G., FINLAY B. B., 2000. Salmonella pathogenicity islands: big virulence in small packages. Microbes Infect. 2, 145156. MERCADO-BLANCO J., TORO N., 1996. Plasmids in Rhizobia: the role of nonsymbiotic plasmids. Mol. Plant-Microbe Inter. 9, 535545. MERGEAY M., NIES D., SCHLEGEL H. G., GERITS J., CHARLES P., VAN GIJSEGEM F., 1985. Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemolithotroph with plasmid-bound resistancee to heavy metals. J. Bacteriol. 162, 328334.

254

MIROSAWA WODARCZYK

MISRA T. K., 1992. Bacterial resistance to inorganic mercury salts and organomercurials. Plasmid 27, 416. NIES D.H., 1992. Resistance to cadmium, cobalt, zinc, and nickel in microbes. Plasmid 27, 1728. PAWLOWSKI J., SHINGLER V., 1994. Genetics and biochemistry of phenol degradation by Pseudomonas sp. CF600. Biodegradation 5, 219236. RILEY M. A., GORDON D. M., 1999. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbol. 7, 129 133. ROTGER R., CASADESUS J., 1999. The virulence plasmids of Salmonella. Int. Microbiol. 3, 177184. SILVER S., 1996. Bacterial resistance to toxic metal ions-a review. Gene 179, 19. SILVER S., MISRA T. K., 1988. Plasmid-mediated heavy metal resistances. Annu. Rev. Microbiol. 42, 717743. SILVER S., PHUNG L. T., 1996. Bacterial heavy metal resistance: new surprises. Ann. Rev. Microbiol. 50, 753789. TAN H. M., 1999. Bacterial catabolic transposons. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 112. THOMAS C. M., 2000. Paradigms of plasmid organisation. Mol. Microbiol. 37, 485491. TOP E. M., MENNE-LOCCOZ Y., PEMBROKE T., THOMAS C. M., 2000. Phenotypic traits conferred by plasmids.

[W:] The Horizontal Gene Pool: Bacterial Plasmids and Gene Spread. THOMAS C. M. (red). Harwood Academic Reading, UK, 249280. VENKATESAN M. M., GOLGBERG M. B., ROSE D. J., GROTBECK E. J., BURLAND V., BLATTNER F. F., 2001. Complete DNA sequence and analysis of the large virulence plasmid of Shigella flexneri. Infect. Immun. 69, 32713285. WALLACE W. H., SAYLER G. S., 1992. Catabolic plasmids in the environment. [W:] Encyclopedia of Microbiology. LEDERBERG J. (red.). Academic Press Wyd. 1, 417430. WODARCZYK M., 1998. Wymiana materiau genetycznego i rekombinacja u bakterii. Kosmos 47, 137146. ZATYKA M., THOMAS C. M., 1998. Control of genes for conjugative transfer of plasmid and other mobile elements. FEMS Microbiol. Rev. 21, 291319. ZECHNER E. L., DE LA CRUZ F., EISENBRANDT R., GRAHN A. M., KORAIMANN G., LANKA E., MUTH G., PANSEGRAU W., THOMAS C.M., WILKINS B. M., ZATYKA M., 2000. Conjugative-DNA transfer processes. [W:] The Horizontal Gene Pool: Bacterial Plasmids and Gene Spread. THOMAS C. M. (red.). Harwood Academic Reading, UK, 87174.