VIEN CNG NGHE SINH HOC & THUC PHAM

Tiu Lun Mn: VI SINH THUC PHAM

D tai: Phn Tich ColiIorm Va E.Coli trong Thuc Phm






Giao Vin Huong Dn: Th.S Luu Huvn Trang
Nhom : 07 (CDTP8LT-CDTP10TB)
1. D Vn Toan 08845384
2. Hoang Thi Nguyt 08835414
3. Nguyn Thi Ha 08844884
4. Vuong Thi Thuy
MUC LUC

LOI MO DAU ....................................................................................................... 3
TONG QUAN VE COLIFORM VA E.COLI ........................................................ 4
I. COLIFORM: ................................................................................................ 4
1. Dinh Nghia ................................................................................................ 4
2. Dc Dim .................................................................................................. 4
II. Escherichia coli ............................................................................................ 4
1. Dinh Nghia ................................................................................................... 5
2. Dc Dim. .................................................................................................... 5
PHUONG PHAP PHN TICH COLIFORM VA E.COLI TRONG THUC PHAM
............................................................................................................................... 6
1. QUY TRINH THUC HIEN: ......................................................................... 7
2. QUY TRINH DINH LUONG COLIFORMS VA E. COLI BANG
PHUONG PHAP MPN. ...................................................................................... 8
3. TIEN HANH PHN TICH ..........................................................................10
3.1. Pha mi truong va dung cu ....................................................................10
3.2. Khu trung dung cu va mi truong d pha...............................................11
3.3. Tin hanh phn tich. ..............................................................................12
3.4. Cach Tinh Kt Qua. ...............................................................................17
KET LUAN ..........................................................................................................19
TAI LIEU THAM KHAO .....................................................................................20



LI MO DAU
Xung quanh chung ta, ngoai cac sinh vt lon ma chung ta co th nhin thy
duoc, con co v van vi sinh vt nho be, mun nhin thy chung phai su dung kinh
hin vi, nguoi ta goi chung la vi sinh vt. Mn khoa hoc nghin cuu v hoat dng
sng cua cac vi sinh vt duoc goi la Vi sinh vt hoc.
Vi sinh vt hoc phat trin rt nhanh va d dn dn vic hinh thanh cac linh
vuc khac nhau: vi khun hoc (Bacteriology), nm hoc (Mycology), tao hoc
(Algology) virus hoc (Virolory),... Vic phn chia cac linh vuc con co th dua vao
phuong huong ung dung. Do do chung ta thy hin nay con co y sinh vi sinh vt
hoc, vi sinh vt hoc thu y, vi sinh vt cng nghip, vi sinh vt hoc nng nghip.
Vi sinh vt phn b rng ri trong tu nhin: trong dt, nuoc, khng khi, trn
co th cac sinh vt khac, trn long thuc, thuc phm va cac loai hang hoa. Chng
nhung th, su phn b cua chung con theo mt h sinh thai v cung phong phu, da
dang, tu lanh dn nng, tu chua dn kim, tu hao khi dn ki khi,... Do su phn b
rng ri va do hoat dng manh m nn vi sinh vt co tac dung rt lon trong vic
tham gia cac vong tun hoan vt cht trn trai dt cng nhu tham gia vao cac qua
trinh san xut nng nghip.
Trong thin nhin, vi sinh vt giu nhung mt xich trong yu trong su chu
chuyn lin tuc va bt dit cua vt cht, nu khng co vi sinh vt hay vi mt ly do
nao do ma hoat dng cua vi sinh vt bi ngung tr du chi trong thoi gian ngn, co
th no s lam ngung moi hoat dng sng trn trai dt.
Hin nay vi sinh vt la mt mn khoa hoc mi nhon trong cuc cach mang
sinh hoc. Nhiu vn d quan trong cua sinh hoc hin dai nhu, ngun gc su sng,
co ch thng tin, co ch di truyn, co ch diu khin hoc va cac t chuc sinh vt
hoc, vi sinh vt hoc dang co nhung buoc tin vi dai, dang tro thanh v khi sc ben
trong tay con nguoi d nhm chinh phuc thin nhin phuc vu dc luc cho san xut
va doi sng.


TONG QUAN VE COLIFORM V E.COLI
I. COLIFORM:

1. Dinh Nghia
ColiIorms la nhung truc khun Gram m khng sinh bao tu,
hiu khi hoc ky khi tuy y, co kha nng ln men lactose sinh acid va
sinh hoi o 370
o
C trong 24 48 gio. ColiIorms duoc xem la nhom vi
sinh vt chi thi: s luong hin din cua chung trong thuc phm, nuoc
hay cac loai mu mi truong duoc dung d chi thi kha nng hin
din cua cac loai vi sinh vt khac.
2. Dc Dim
- Hinh que, Gram (-), khng bao tu
- Ln men lactose sinh hoi
- Nhit d phat trin; (-) 2-50
o
C
- pH: 4.4-9.0
- Ngun nhim: nuoc hoc thuc phm nhim phn
- Loai tiu biu: E.Coli, Enterobacter aerogenes, Shigella
II. Escherichia coli

1. Dinh Nghia
- Thuc ho Enterobacteriaceae, catalose (), oxidase (-), Gram(-) , truc
khun ngn, khng tao bao tu.
- Sng trong rut gia cua nguoi va dng vt, theo phn di ra ngoai
- Co kha nng ln men nhiu loai duong, sinh hoi, khu nitrat thanh
nitrit
- Kha nng gy bnh da dang: gy nhim khun duong tiu; voi co th
yu gy nhim khun mau; gy vim mang no o tre so sinh; gy tiu chay.
2. Dc Dim.
- Hinh que, khng tao bao tu
- Nhit d phat trin: 7-50
o
C, nhit d thich hop: 37
o
C
- pH thich hop: 7.0-7.5
- Gy bnh duong rut, tiu chay, nhim khun mau, vim mang no..
PHUONG PHP PHAN TICH COLIFORM V
E.COLI TRONG THUC PHAM

PHUONG PHAP MOST PROBABLE NUMBER (MPN) THEO
TCVN 6505-2:1999
Dy la phuong phap dinh luong dua trn kt qua dinh tinh cua mt loat thi
nghim duoc lp lai o mt s d pha long khac nhau. Thng thuong, vic dinh
luong nay duoc thuc hin lp lai 3 ln o 3 d pha long bc 10 lin tip, tng cng
3 x 3 9 ng nghim.
Quv trnh dnh luong:
Cho cac ng nghim chua mi truong dang long thich hop voi vi sinh vt cn
xac dinh voi 3 muc nng d:b 1/10, 1/100, 1/1000 mi muc 3 ng nghim. U o
nhit d voi thoi gian thich hop. Dua vao kt qua nhin thy chung minh su tang
truong cua vi sinh vt cn kim dinh (thuong la nhung hin tuong nhu: sinh hoi,
di mau, duc.) ghi nhn s luong cac ng nghim duong tinh o tung d pha
long. Su dung cac s liu nay va dua vao bang Mac Crady suy ra mt d vi sinh
vt duoc trinh bay duoi dang MPN/100ml hay s MPN/gam.
D chinh xac cua tri s MPN phu thuc vao s luong ng nghim lp lai
trong mi d pha long.
Su dung mi truong BGBL o 37oC co th dinh luong nhom ColiIorm, cung
mi truong nay o 45oC cho phep dinh luong ColiIorm trong phn.

. QUY TRINH THUC HIEN:

Ghi nhn s luong ng nghim
duong tinh
o tung d pha long. Tra bang Mac
Crady
U o nhit d va thoi gian thich
hop
Kt qua biu kin chung minh su
tng
truong cua vi sinh vt cn kim
Pha long mu phn tich o 3 nng
d pha long bc 10 lin tip.

Mt d vi sinh vt MPN/100 ml hay

MPN/1g mu
Da s cac bang MPN cung cp s liu o dang s MPN trong 100ml dung
dich duoc su dung d phn tich o cac liu luong la 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trn thuc t
phn tich, nguoi ta thuong dung 1ml cho mu d pha long 10-1, 10-2, 10-3.
Luong mu voi cac d pha long nay tuong duong voi 1/100 luong mu su dung
theo bang MPN/100ml tinh theo luong mu la 10ml, 1ml, 0.1 ml nu trn. Vy
s liu cua bang MPN/100ml tinh theo luong mu la 10ml, 1ml, 0.1 ml tuong
duong voi MPN/ml mu chua pha long khi 1ml cua cac dung dich co d pha
long 10-1, 10-2, 10-3duoc dung d phn tich.
- Truong hop mt d vi sinh vt qua cao, cn phai su dung loat nng d pha
long tip theo cn phai nhn tri s tra bang MPN nu trn voi h s pha long. Vi
du: su dung 1ml cho mi d pha long 10-2, 10-3, 10-4 tuc la chi su dung 1/10
luong mu o mi nng d so voi truong hop dung 1ml mu o cac d pha long 10-
1, 10-2, 10-3. Do vy, tri s tra bang MPN cn nhn thm h s pha long la 10.

. QUY TRINH DINH LUONG COLIFORMS V E. COLI BANG
PHUONG PHP MPN.

ColiIorms
E.Coli
. TIEN HNH PHAN TICH
Mu phn tich: Nuoc mia nguyn cht
.. Pha mi trung v dung cu
Tn mi truong Thanh phn Tng th tich
SPW (Saline
Pepton
Water)
NaCl : 42.5g
Pepton: 5g
500 ml nuoc
ct
LSB
(LaurylSulphateBr
oth)
Tryptose: 20g
Lactose: 5g
Sodiumchloride: 5g
KH
2
PO
4
: 2.75g
K
2
HPO
4
: 2.75g
Lauryl sulphate: 0.1g
1000 ml nuoc
ct pH 6.8
0.2
BGBL(Brilliant
Green Bile
Lactose Broth)
Peptone: 10g
Lactose: 10g
Mt bo: 20g
Brilliant green: 0.0133g
1000 ml
nuocct pH
7.4
EC
(E.coli medium)
Trypticase or tryptose: 20g
Mui mt No.3: 1.5g
Lactose: 5g
KH
2
PO
4
: 1.5g
K
2
HPO4: 4g
NaCl: 5g
1000 ml nuoc
ct pH 6.9
EMB
(Eosin Methylene
Blue Agar)
Pancreatic digest oI gelatin:
10g
Lactose: 10g
K
2
HPO
4
: 2g
Eosin Y: 0.4g
Methylene blue: 65mg
Agar: 15g
1000 ml nuoc
ct. pH 7.1
0.2
Tryptone water Tryptone hoc
trypticase:10g
1000ml nuoc
ct pH 7.2
0.2
MR-VP
Both
(Glucose
Phosphate)
trung 1:
BuIIered peptone-water
powder: 7g
Glucose: 5g
K
2
HPO
4
: 5g
1000ml nuoc
ct. pH 6.9
0.2
trung 2:
Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest oI animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 0.2
trung 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buIIer: 5g
pH 7.5 0.2
SCA
(Simmons Citrate
Agar)
Sodium citrate: 2g
NaCl: 5g
K
2
HPO
4
: 1g
NH
4
H
2
PO
4
: 1g
MgSO
4
: 0.2g
Bromothymol blue: 0.08g
Agar: 15g
1000ml nuoc
ct. Dun nong
nhe va thinh
thoang lc.
Dun si 1-2
phut cho dn
khi hoa tan
ht. pH 6.8
0.2
.. Khu trng dung cu v mi trung d pha
Bao goi dung cu va phn phi mi truong vao dungcu, gn nut va
bao goi. Hp tit trung o 121
0
C trong 15 phut.
.. Tin hnh phn tch.
f !ha long mu.

b. v mu vao canh LSB

Chuyn 1ml dung dich 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
vao ng 10ml canh LSB, mi nng d
co 3 ng lp lai, u o 37
0
C, 48 gio.
So d cy mu tu cac d pha long

Ong Mu
c. nh luong oliform va E.oli
Dinh luong ColiIorm Dinh luong E. coli
Ghi nhn s ng co sinh hoi () Ghi nhn s ng co sinh hoi ()
Dung que cy vong cy chuyn
dich mu tu cac ng LSB ()
sang cac ng co chua canh
BGBL va u o 37
0
C 1
0
C, 48 gio
Dung que cy vong cy chuyn
dich mu tu cac ng LSB ()
sang mi truong canh EC, u o
44.5
0
C 0.2
0
C, 24 gio
Ghi nhn s ng co sinh hoi
() ung voi mi d pha long
Ghi nhn s ng co sinh hoi
() ung voi mi d pha long
Tinh kt qua (3.4 cach tinh kt
qua)
Dung que cy vong ria dich mu
tu cac ng () trn canh EC sang
mi truong thach dia EMB. U o
37
0
C, 24 gio.
Chon khun lac duong kinh lon
hon 1mm (tron, det hinh dia va
co anh kim xanh)
(xem hinh 4 ), cy vao Trypton,
MR-VP, SC Citrate, u o 44.5
0
C
0.2
0
C, 24 gio

/. Th nghim IMJi


Kt qua IMViC cua Escherichia coli sau 24gio u o 37C. (Anne Hanson,
University oI Maine, Orono%
Ong A: duong tinh thu nghim indole trn mi truong tryptone. Xut hin
lop mau do trn b mt mi truong sau khi nho thuc thu Kovacs.
Ong B: duong tinh thu nghim methyl red xut hin mau do cua methyl red.
Ong C: m tinh thu nghim Voges-Proskauer biu hin qua su khng thay
di mau sau khi cho thuc thu Barritt`s A va Barritt`s B.
Ong D: m tinh thu nghim citrate biu hin qua su thay di mau sc va
khng co khun lac trong ng nghim.
Thu nghim Indol (I):
Nguyn tc: Tryptophan la mt acid amin co th bi oxi hoa boi mt s vi
sinh vt co h enzyme tryptophanase tao nn cac san phm chua gc indol. Vic
phat hin indol duoc thuc hin bng phan ung cua phn tu nay voi cac thuc
thu chua p-Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tao nn mt phuc cht
dang quinone co mau do.
Phuong phap tin hanh: Mi truong su dung cho thu nghim nay la
nuoc tryptone. Sinh khi chung thun duoc cy vao mi truong long tryptone,
u o nhit d 37
0
C trong 24-48 gio. B sung 1ml ether hoc xylene vao ng
nghim, lc du d chit tach indol ln lop dung mi huu co. Nho 5 giot thuc
thu vao ng dich nui cy, d yn vai phut, theo di su tao mau do trong lop dung
mi huu co.
Thu nghim Indol.

Doc kt qua: () xut hin cua lop mau do trn b mt mi truong. (-) lop
mau vang cua thuc thu. Di khi co su xut hin cua mau cam do skatol, la tin
cht cua methyl hoa cua indol, tao ra.

Thu nghim Methyl Red (MR):
Nguyn tc: chi thi do methyl red giup phn bit nng d H hin din
trong mi truong sau khi vi sinh vt ln men glucose. Chi thi nay thay di mau nhu
sau: pH4.4 do; pH 5.0-5.8 mau cam; pH~6.0 mau vang.
Phuong phap tin hanh: Mi truong su dung cho thu nghim nay la mi
truong long Glucose Phosphate (MR-VP Broth). Dung que vong cy mt luong
nho khun lac trn mi truong MR-VP, u o 37
0
C trong khoang 2-5 ngay. Thm
vao vai giot thuc thu do methyl red (0.02 trong hn hop cn nuoc co ty l 3:2,
bao quan o 4
0
C) vao trong ng nghim dich nui cy, doc kt qua ngay.

Thu nghim MR.
Doc kt qua: () mi truong co mau do sau khi b sung thuc thu. (-)
khi co mau vang. Truong hop mau cam, cn tip tuc u ng mi truong co ging
trong 4 ngay va thuc hin lai thu nghim.

Thu nghim Citrate (iC)
Nguyn tc: su bin dung citrate boi vi sinh vt s tao ra CO2 lam km hoa
mi truong. Mt khac moi VSV co kha nng su dung citrate lam ngun carbon duy
nht du co kha nng dung mui ammonium lam ngun dam duy nht. Su
phn giai cua mui ammonium dung lam ngun dam trong mi truong s
sinh NH3 lam kim hoa mi truong. Su gia tng gia tri pH nay duoc chi thi
bng su di mau cua chi thi pH trong mi truong.
Phuong phap tin hanh: Mi truong su dung cho thu nghim nay la mi
truong long SCA. Dung que vong cy ria mt luong nho khun lac ln mi
truong SCA rn trong ng nghim thach nghing, u o 35
0
C trong khoang 24-48
gio.
Thu nghim Citrate.
Doc kt qua: () khi xut hin khun lac va mi truong chuyn sang
mau xanh duong. (-) khi khng co khun lac va mi truong giu nguyn mau xanh
luc.

.4. Cch Tnh Kt Qua.
Tu s luong cac ng nghim co E. coli () o mi d pha long cua mu,
dung bang MPN loat 3 ng nghim o 3 nng d pha long lin tip d tinh ra
mt d vi sinh vt trong mu va biu din duoi dang tri s MPN/ml mu ban du
chua pha long.

Bang Tra MPN dung cho loat 3 ng nghim o 3 nng d pha long lin tip.

KET LUAN

Phuong phap Most Probable Number (MPN) la phuong phap ph

bin va dat hiu qua trong vic xac dinh ColiIorm va E.Coli co trong
thuc phm. Dy la phuong phap dua trn bang MPN d tim ra co su hin
din cua ColiIorm va E.Coli.
Phuong phap nay doi hoi thoi gian tuong di dai va phuong phap
thuc hin cng tuong di phuc tap. Cac buoc thuc hin dam bao phai
dung tranh khng co su nhm ln trong cac buoc nu khng ta s phai
thuc hin lam lai tu du.

TI LIEU THAM KHAO

1. Giao trinh phn tich Vi Sinh Thuc Phm, Ths. L Thuy Linh , Truong Dai
Hoc Cng Nghip Thuc Phm Tp.HCM
2. TCVN 6505-2:1999 Sua va cac san phm tu sua dinh luong E.Coli gia
dinh bng phuong phap MPN.
3. Google.com.vn
4. Giao trinh Vi Sinh Thuc Phm, truong Dai Hoc Cng Nghip Tp.HCM.