Prepared by : Submitted to:

Danda Pani Chapagain Dr. Pramod Aryal
Pramod Niraula (lecturer of Animal 
Gopal Karki Biotechnology,
Mukesh Maharjan SANN College, Gaihridhara)
Ujjwal Bhushal
Prem Bhat
Bijaya Sharma
The design and construction of new proteins or enzymes with novel or desired functions
by modifying amino acid sequences by using recombinant deoxyribonucleic acid
technology(RDT).

Protein engineering is the application of science, mathematics, and economics to 

the process of developing useful or valuable proteins. It is a young discipline, with 
much research currently taking place into the understanding of protein folding and 
protein recognition for protein design principles.
The major assumptions of the method are:

(1) mutation does not significantly change the

structure of the folded state

(2) the target groups do not make new

interactions with new partners during the
course of reaction energy
 DESIGNING  BETTER PROTEIN

Biochemical 
Thermodynamics

Structure

Folding 
Methods of protein engineering  :

¾ Site Directed Mutagenesis (rational design)

¾ Random Mutagenesis (direct  evolution)

¾ DNA  Shuffling

¾ Fusion proteins

¾ Glycosylation

¾ PEGylation
Detailed knowledge of the structure and function of the protein is used to make 
desired changes. 

This has the advantage of being generally inexpensive and easy, since site‐directed 
mutagenesis techniques are well‐developed. 

For the rational design we should have detailed knowledge of gene sequence and 
protein structure .

However, there is a major drawback in that detailed structural knowledge of a protein 
is often unavailable, and even when it is available, it can be extremely difficult to 
predict the effects of various mutations.
• Computational protein design algorithms seek 
to identify amino acid sequences that have low 
energies for target structures.
1)  To alter a single amino acid residue by 
mutating the codon that encodes for that 
amino acid.

ATG GCC GGA GAC GAG ACT ACT AAA

ATG GCC GGA GTC GAG ACT ACT AAA

translates to…..

Met ‐ Ala ‐ Gly ‐ Asp ‐ Glu ‐ Thr ‐ Thr ‐Lys

Met ‐ Ala ‐ Gly ‐ Val ‐ Glu ‐ Thr ‐ Thr ‐Lys

 Application

Medicine
Example:

• Effectiveness of Ribonuclease (RNase) used in 
anti tumor therapy can be improved by this 
site directed mutagenesis.
Native Monomeric 
Human Pancreatic 
RNase Engineered Dimeric human 
pancreatic RNase
Gln
Lys+
Arg Leu
Arg Cys cys
Cys Cys
Asn
Leu
Lys+

Dimerization

After Protein Engineering
By site directed mutagenesis
2) To create a new restriction site for manipulation of DNA without
introducing an amino acid change.

AAT TCG CAT TCT ATG GGT ACC 
Asn‐ Ser ‐ His ‐ Ser ‐ Met ‐ Gly ‐Thr

NcoI

AAT TCG CAT T(CC ATG G)GT ACC
Asn‐ Ser ‐ His ‐ Ser ‐ Met ‐ Gly –Thr

New restriction site, no change in amino acid sequence.  
TCT = Ser, TCC = Ser
• Possible without knowledge about 
sequence/structure
• Generation of mutant libraries
• efficient screening
 Random mutagenesis is applied

selection regime is used (for protein)

variants 

Further rounds of mutation and selection are then applied

produces superior results to rational design
Error prone PCR:
• based on the principle that Taq polymerase is 
capable of annealing incompatible base‐pairs 
to each other during amplification under 
imperfect PCR conditions.
• Error prone PCR:
Error prone PCR:

• 7 mM MgCl2
• add H2O to 100 μl
• 1 μl Taq 4°C
• 2 μM Primer as 72°C 10 min
• 2 μM Primer s 72°C 3 min
• 100 ng Template 58°C 45 s 30 x
• 0,2 mM dATP
94°C
• 0,2 mM dGTP
95°C 3 min
• 1 mM dCTP
• 1 mM dTTP
• 0,5 mM MnCl2
• 20 mM Tris (pH 8.4)
• 50 mM KCl
restriction
In vitro homologous recombination of pools of selected
genes by random fragmentation and polymerase chain
reaction reassembly

To mimic the natural design process and speed it up by

directed selection in vitro toward a simple specific goal.
For example: protein engineering
What do we need?
• applied to sequences > 1Kb
• Presence of homologous regions separating 
regions of Diversity
• Scaffold‐like protein structures may be 
particularly Suitable for shuffling
Phylogenetic tree of 4 cephalosporinase genes

% sequence
similarity
Chimeric DNA 
sequences 
Alpha interferons (IFN‐s) are members of the diverse 
helical‐bundle superfamily of cytokine genes. 

• The human IFN‐s (Hu‐IFN‐s) are encoded by a family of over 20 tandemly 
duplicated nonallelic genes that share 85–98% sequence identity at the amino 
acid level. 

• These proteins have potent antiviral and antiproliferative activities that have 

clinical utility as anticancer and antiviral therapeutics. Although the utility of 
chimeric IFNs derived from this gene family has been recognized, only a small 
fraction of the 1026 possible chimeras have been explored either in natural 
human evolution or by the methods of modern molecular biology; and only 
one natural IFN‐ subtype, Hu‐IFN‐2, has been used in clinical studies. 

• The most active engineered IFN‐, IFN alfacon‐1, is a consensus of 13 wild‐type 
Hu‐IFN‐ genes that is currently used in hepatitis C therapy.
• A novel protein engineered by fusing the 
protein coding sequence of one gene to the 
protein coding sequence of a different gene.
Can be used to direct toxins to a target site.

(IL‐2  +  Diptheria toxin)

aa 2nd ‐133 human IL‐2   + 1st ‐389 aa of diptheria toxin

targets IL‐2 receptors on CTCLs to kill them

Denileukin diftitox (Ontak) ‐ FDA approved for cancer
30% patients have 50% reduction in tumor burden

CTCL = cutaneous T‐cell lymphoma
Ontak      IL‐2 + diptheria toxin 
fusion protein

Ontak binds to surface of lymphoma 
cells via IL‐2 
receptor

Once internalized, diptheria toxin 
kills cell.
 •Add/remove glycosylation sites

•Change biochemical feature/activity of the protein

•Improve stability
 Altering Glycosylation Sites :

• Use site‐directed mutagenesis to introduce new 
glycosylation sites.

• Erythropoietin as an example
¾ direct relationship between carbohydrate content 
(sialic acid) and its serum half life and biological  
activity in vivo

¾ Inverse relationship with receptor binding (i.e., 
more glycosylation means poorer binding)
• Hypothesis was:
the more glycosylation ‐‐> longer half life
‐‐> more activity
‐‐> reduced binding affinity

• Hyperglycosylated EPO (Aranesp)

• In vivo
¾ no loss of drug function
¾ increased serum half‐life (3‐fold longer)
¾ reduced frequency of administration

• FDA approved 1/30/03 for anemia
• Similarly, PEGylation (monomethoxypolyethylene 
glycol ) is also in use to improve the protein stability 
and activity.
• Protein drugs have:
¾ relatively short half‐lives
¾ wide tissue distribution
¾ potential for immunogenicity 
• It is used to design the novel protein that has 
the enhanced activity.
• Protein engineering is the combination of 
science, mathematics and management.
• It can be applied in the fields like‐ medicine, 
industries,agriculture etc…
• Since it is very tough task, many researches is 
still done.
• Glick.B,R, Pasternark,j,j, Molecular Biotechnology, Principles in Applications of
Recombinant DNA,IIIrd edition ,ASM press washington D.C.

• Fresht,A. Structure and Mechanism in protein science,w.h. freeman and company,

New York.

• Chawala,H.S. Introduction to Plant Biotechnology, IInd edition, Oxford and IBH

publishing Co.Pvt. Ltd.,New Dehli.

• http://www.w3.org

• http://nar.oxfordjournals.org

• http://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

• http://www.upei.ca