Thực tập vi sinh đại cương

Nhóm 3_Lớp 071160C

BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa: Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều kiện có oxy phân tử 2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí: Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất lượng : 106 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=106 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 105 tế bào/g(ml) sữa bị chua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;108 tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm có mùi hôi không chấp nhận được;109-1010tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi cấu trúc 3.Quy trình kiểm tra:

Trang 1

Thực tập vi sinh đại cương 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trung ̀ 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trung ̀

Nhóm 3_Lớp 071160C

Stomacher .10gr thực phâm ̉ + 90ml NaCl 0.85% (10-1)

10-2

10-3

Bước 1: đồng nhất mẫu Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H20 vô trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30” thu được nồng độ 10-1 Bước 2 : pha loãng mẫu Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng lấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm .Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10-2 .Làm tương tự với các nồng độ kế tiếp Lưu ý khi pha loãng mẫu:

Trang 2

Thực tập vi sinh đại cương

Nhóm 3_Lớp 071160C

-Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm nghiệm…. -Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện tượng sai số -Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2 đĩa/nồng độ Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 450C,đổ môi trường vào các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu .Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đều dịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môi trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A hoặc N.A Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặc Sabouraund Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-370C.Thời gian ủ men,mốc 72h/30-370C Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa) Kết quả thí nghiệm Nồng độ Số khuẩn lạ c
Trang 3

10-1 Đĩa 1 Đĩa 2 48 130

10-2 Đĩa 1 Đĩa 2 113 125

10-3 Đĩa 1 Đĩa 2 105 120

0g Nước cất vừa đủ :1000ml pH sau thanh trùng : 7.Môi trường sử dụng 4.0 ± 0.2.1.1.0g :14.0g :3.5g :1.2 Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút 4.0g :1000ml pH sau thanh trùng : 7.Môi trường Plate Count agar Peptone Meat extract D(+) glucose Agar :5.Môi trường Sabouraund Trang 4 .1n2)*d n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml)) c : tổng số khuẩn lạc đếm được n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm =>n= (113 + 125 + 105 + 120).0g :2.2) 4.0g :12.Môi trường Nutrient Agar Peptone Meat extract Agar Nước cất :5.100 =21045 ≈ 21000 cfu/g(ml) (2 + 0.0 ± 0.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Bước 5: tính kết quả theo công thức n = c/(n1+0.3.2 Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút 4.

̀ ̀ ̉ Trang 5 .Chỉ tiêu tổng coliform không thích ̣ ̣ ̣ ̣ hợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân. không bao tử . sinh hơi ở 37oC /24 – 48h. enterobater. Trong cac thanh viên nhom coliform phân thì E. Nhom coliform gôm những vi sinh vât hiêu khí và kị khí tuy y.. Coliform phân có nguôn gôc từ ruôt người và cac đông vât mau ̀ ́ ̣ ́ ̣ ̣ ́ nong bao gôm cac giông escherichia. không bao tử .Những kiến thức chung về COLIFORM Coliform là nhom trực khuân gram. nhom nay được chia thanh 2 ̉ ̀ ̣ ́ ̀ ̀ nhom nhỏ là coliform và coliform phân có nguôn gôc từ phân cac loai đông ́ ̀ ́ ́ ̀ ̣ vât.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Peptone Glucose Agar Nước :20g :40g :20g :1000ml Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút BAI 2: KIÊM TRA TÔNG SỐ COLIFORM ̀ ̉ ̉ 1. Tuy nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số vi sinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44oC. ̀ ́ Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhom vi sinh vât dung ́ ̣ ̀ để chỉ thị khả năng có sự hiên diên cua cac vi sinh vât gây bênh trong thực ̣ ̣ ̉ ́ ̣ ̣ phâm. coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lý nguồn nước. Do đó số lượng E.. hinh que. gram ̉ ́ ̀ ̣ ́ ̀ ́ .coli là loai được ́ ̀ ́ ̀ quan tâm nhiêu về vệ sinh an toan thực phâm. kebsiella. có khả năng lên men đường lactose. Trên thực tế kiêm nghiêm coliform phân được quan tâm nhiêu hơn ̣ ̉ ̣ ̀ coliform. Khi coliform ́ ̀ ́ ́ phân hiên diên ở môt số lượng lớn trong mâu thì mâu có khả năng chứa cac ̣ ̣ ̣ ̃ ̃ ́ vi sinh vât gây bênh hiên diên trong phân. lên men đường lactose và sinh hơi trong môi ̀ ̀ trường long. hiêu khí hoăc kị ́ ̉ ̀ ́ ̣ khí tuy y. dựa vao nhiêt dộ tăng trưởng.

Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Loai vi sinh vât nay phân bố ở moi nơi. ̣ ̣ ́ ́ *môt số hinh anh về coliform: ̣ ̀ ̉ Fecal Coliform 375 x 294 Chromocult® Coliform Agar ES 297 x 300 Trang 6 . có trong ruôt người và cac ̀ ̣ ̀ ̣ ̣ ́ đông vât mau nong.

5oC. ̃ • • • Lên men đường lactose trong môi trường E.Quy trình kiểm tra Phương phap MPN : ́ Nguyên tăc: ́ Mâu được pha loang thanh môt day thâp phân .C ở 44. Theo doi sự sinh hơi ̃ ̀ ̃ ̣ ̣ ́ ̃ trong từng ông nghiêm.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 2. Xac đinh ông dương tinh ở môi nông độ pha loang ́ ̣ ́ ̣ ́ ́ ̃ ̀ ̃ và dựa vao bang MPN để suy ra số lượng nhom vi sinh vât tương ứng hiên ̀ ̉ ́ ̣ ̣ diên trong 1g hoăc 1ml mâu ban đâu ̣ ̣ ̃ ̀ Sơ đồ quy trình kiểm tra : Trang 7 . Kêt quả sinh hoa nghiêm phap imvic là + + . Mâu được ủ trong môi trường thich hợp có ông ́ ̀ ̃ ́ ́ durham. Có khả năng sinh indol 24h/44. bao quan . nước được dung để chỉ thị cho khả năng hiên ̉ ́ ̉ ̀ ̣ diên cua cac vi sinh vât gây bênh khac. ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ́ Colifrorm chiu nhiêt( coliform phân): ̣ ̣ • • Là thanh phân trong hệ vi sinh vât đường ruôt ở người và cac ̀ ̀ ̣ ̣ ́ Được xem là vi sinh vât chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trinh ̣ ̀ đông vât mau nong. ̣ ̣ ́ ́ chế biên. Số lượng hiên diên ́ ̣ ̣ ̣ ̣ cua chung trong thực phâm.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu Coliform được xem là nhom vi sinh vât chỉ thi. 2 nông độ kế tiêp ̃ ̃ ̀ ̣ ̃ ̣ ̀ ́ nhau khac nhau 10 lân.5oC.́ ́ ̣ ́ 3. Số lượng coliforms cao thì khả ̣ ̉ ́ ̣ ̣ ́ năng hiên diên cua vi sinh vât gây bênh khac cao. nước uông cung như chỉ ́ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̃ thị sự ô nhiêm phân trong môi trường. vân chuyên thực phâm. Môi nông độ pha loang được lăp lai 3 ông.

1 ̀ Bước 1: Trang 8 .85%( 10-1 ) hinh 1.Thực tập vi sinh đại cương 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trung ̀ Nhóm 3_Lớp 071160C 1ml(10-2)+ 9ml nước vô trung ̀ Stomacher 10gr thực phâm ̉ 10-2 10-3 + 90ml NaCl 0.

Không lắc những ống có ống durham Bước 4: Đoc kêt quả cac ông Laury Tryptose . 10-5….10-3) như sau : Môi nông độ lây 3 ông nghiêm. cho môi trường LT vao 9 ông nghiêm sao ̃ ́ ́ ̀ ́ ̣ cho ngâp ông durham. ̣ Bước 2: Pha loang mâu để giam số lượng vi sinh vât có trong mâu ban dâu.85% hoăc là nước vô trung. ̀ Bước 3: Nuôi cây dich mâu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ở 3 nông ́ ̣ ̃ ̀ độ liên tiêp(10-1.10-2. Ghi 3 nông độ liên tiêp bên ngoai ông nghiêm(môi ̣ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̣ ̃ nông độ 3 ông nghiêm).Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Laury Trytose. Sau đó lây 1ml mâu ở ̀ ́ ̣ ̀ ́ ̃ nông 10-2 cho vao ông nghiêm thứ hai + 9ml nước vô trung thu được ông ̀ ̀ ́ ̣ ̀ ́ nghiêm có nông độ 10-3 . ̃ ̃ ̉ ̣ ̃ ̀ Lây 1ml mâu ở nông độ 10-1 cho vao ông nghiêm thứ nhât. tương tự như trên ta thu được cac ông nghiêm có ̣ ̀ ́ ́ ̣ nông độ 10-4. ̉ ̣ ̀ stomacher thu được nông độ 10-1. .Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 10gr thực phâm + 90ml NaCl 0.1) ủ ở 37oC/24h ́ ́ ̣ ̀ ́ ̀ Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): -Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.. Tiêp đên cho 1ml dung dich mâu ở nông độ 10 -1 ̀ ́ ̣ ́ ́ ̣ ̃ ̀ vao 3 ông nghiêm có ghi nông độ 10-1(chứa môi trường LT). (hinh 1.tương tự cho ̀ ́ ̣ ̀ cac ông nghiêm ở những nông độ tiêp theo. sau đó cho 9ml ́ ̃ ̀ ̀ ́ ̣ ́ nước vô trung. Có 3 trường hợp xay ra: ̣ ́ ́ ́ ̉ Trang 9 . Ta được ông nghiêm có nông độ 10 -2. Cho vao ́ ̃ ̀ ́ ́ ̣ ̀ môi ông nghiệm 1 ông durham. muc đich đông nhât là để phân bố đêu vi ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̀ sinh vât. .

Lâp tỷ lệ cac ông BGBL dương ̣ ́ ́ ́ ̣ ́ ́ tinh ở 3 nông độ liên tiêp. ́ ́ ̣ ̉ Bước 6: Tinh kêt qua: ́ ́ ̉ Tông số coliform (cfu/g hoăc cfu/ml)= số MPN × 10n ̉ ̣ n là số nguyên dương cua nông độ pha loang đâu tiên được nuôi cây.: không có hiên tượng gì xay ra ́ ̣ ̉ Bước 5: Đoc kêt quả ông BGBL dương tinh. Ủ 37oC /24h. sau đó cây chuyên cac ông LT ̣ ́ ́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ dương tinh nay vao cac ông môi trường BGBL 2% băng cach lây que cây ́ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ́ ́ ́ vong nhung vao môi trường LT dương tinh ở trên. ̉ 4. Ghi nông độ trên san phâm. ́ Đoc kêt quả cac ông LT dương tinh.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C + ông durham không thay đôi ́ ̉ + ông durham nôi lên trên ́ ̉ + ông durham sinh hơi. + ông BGBL âm tinh: không có hiên tượng gì xay ra. ̉ ̀ ̃ ̀ ́ Bước 7: Từ kêt quả tinh được.rồi cho vao ông có môi ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ trường BGBL. Tra bang Mac Crady tim số MPN tương ứng ́ ̀ ́ ̉ ̀ + ông BGBL dương tinh: môi trường đuc và ông durham ( ông chuông) ́ ́ ̣ ́ ́ nôi hoăc có bot khí trong ông chuông( thể tich bot khí =1/10 thể tich ông ̉ ̣ ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ chuông). ́ Ông LT . ̀ ̉ ̉ Ông LT + : môi trường đuc và ông durham ( ông chuông) nôi hoăc có ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣ bot khí trong ông chuông (thể tich bot khí trong ông chuông =1/10 thể tich ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ ông chuông). Môi trường sử dụng: Trang 10 . so sanh với tiêu chuân về an toan vệ sinh thực ́ ́ ́ ̉ ̀ phâm.

micropipet. mâu là tương ớt.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Môi trường BGBL 2% : là môi trường dung để phat hiên và đêm ̀ ́ ̣ ́ coliforms. que cây vong. ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ̣ ̀ ́ ông durham .Các thiết bị .Kết quả thí nghiệm _ _ 10-1 _ + + Trang 11 _ . ông nghiêm . thực phâm. ́ 5.nôi autoclave.coli trong sữa. ́ ̃ 6.dụng cụ sử cho thí nghiệm Binh erlen. đen côn. ̉ Nguyên tăc: ́ Mât bò ( bile) và brilliant green ức chế hâu hêt cac vi khuân gram + và ̣ ̀ ́ ́ ̉ vi khuân gram ̉ – không phai coliform. coliforms phân. Tranh được ̀ ̉ ́ hiên tượng dương gia. nước. Brilliant green có nông độ đăc hiêu ̉ ̀ ̣ ̣ nhăm ngăn vi khuân kị khí lên men lactose sinh trưởng ở 440C . luc nay coliform phat triên lam đuc môi trường và ̣ ̉ ́ ̀ ́ ̉ ̀ ̣ sinh khí trong ông durham do lên men lactose. E. tủ sây.

phát triển được ở 44ºC. có khả năng gây bệnh tiêu chảy và sinh nội độc tố.P-) và không sử dụng citrate làm nguồn cacbon (phản ứng cit-). Các chủng E. . sinh indol (phản ứng ind+).Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân và chất lượng vệ sinh thực phẩm.coli có khả năng gây bệnh ở người : .Là trực khuẩn gram-. không sinh aceton (phản ứng V.2.Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai. Trang 12 .2N/g ̉ ∑ coliform = 6.0) ̉ ́ ̀ Tra bang Mac Crady ta được số MPN =6. sinh acid (phản ứng MR+).Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em.COLI Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân.2 × 101=62 (cfu/ml) BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 10-2 _ _ 10-3 _ Tỷ lệ cua BGBL dương tinh ở 3 nông độ (10 -1:10-2:10-3) = (0. - Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường xuyên có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột.

Bể điều nhiệt . Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu.Mẫu thực phẩm kiểm tra . nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt.coli trong mẫu thực phẩm.Các lọ phục vụ cho mực đích pha loãng.Các bình chứa mẫu vô khuẩn . hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C . 1. có nút đậy .Thiết bị và vật liệu: . Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Ở đây.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.Các chủng gây lây nhiễm đường ruột.Pipet tiệt trùng . Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống. 2.Dụng cụ và hóa chất: 3. 3.Ống durham Trang 13 .1.Máy lắc . Theo dõi sự sinh hơi trong từng ống nghiệm.Tủ ấm .Cân .

Lấy 10g tương ớt + 90ml NaCl 0. .Môi trường endo agar - Môi trường E. chứa mẫu phải vô khuẩn.A (nutrient agar) 4.M.Mẫu phải có nhãn ghi kí hiệu. .Lượng mẫu vừa phải. Khi lấy mẫu cần đảm bảo : . .2. ghi lại những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu.Môi trường Lauryl tryptose( LT) .85%.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 3.C broth . stomacher thu được nồng độ 10-1 Bước 2: Pha loãng mẫu Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu lỏng: 10ml 1ml 1ml Trang 14 1ml . . .B agar (eosin methylene – blue lactose sucrose agar).Môi trường E.Dụng cụ lấy mẫu.Tiến hành thí nghiệm: Bước 1: Lấy mẫu Tùy loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu với số lượng và khối lượng khác nhau cho phù hợp. đủ để phân tích các đặc tính lý hóa.sinh học.Môi trường N.Mẫu lấy xong phải phân tích ngay không để quá 24 giờ.Môi trường và hóa chất: .Mẫu phải có tính đại diện.

Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C   Mẫu 90ml NaCl vô trùng 10-1 (nước vô trùng) 10-2 9ml NaCl vô trùng 10-3 9ml NaCl vô trùng 10-4 9ml NaCl vô trùng Trang 15 .

Khi pha loãng mẫu nên dùng nước muối vô trùng nhằm tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật. nếu chỉ dùng nước cất vô Trang 16 .Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu rắn: 10ml                     1ml    1ml 1ml 10g mẫu Stomacher   90ml NaCl vô trùng 10-1 (nước vô trùng) 10-2 9ml NaCl vô trùng 10-3 9ml NaCl vô trùng 10-4 9ml NaCl vô trùng Tiến hành tương tự cho các mẫu pha loãng khác Những điều lưu ý khi pha loãng mẫu: .

• Người kiểm phẩm ( kinh nghiệm. 1ml dịch pha loãng/ ống LT.Tế bào ở các độ pha loãng khác nhau cần được lấy với các pipet khác nhau nhằm tránh các tế bào ở độ pha loãng trước lẫn với các tế bào ở độ pha loãng sau. .). .Khuấy trộn đều dung dịch mẫu trước khi pha loãng để vi sinh vật phân tán đều trong mẫu.). Các dụng cụ phải được vô trùng. . Bước 3 : Nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose ( LT) Tiến hành nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Trytose ở 3 nồng độ liên tiếp...Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.. 3 ống/ nồng độ. thao tác.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C trùng vi sinh vậy sẽ chết khi để lâu bên ngoài mà không có môi trường dinh dưỡng. quy trình chế biến. 10-2 10-3 10-4 Trang 17 ..Nồng độ pha loãng còn phụ thuộc: • Đặc điểm của thực phẩm(thời hạn sử dụng. điều kiện bảo quản.. . Ủ 37ºC/24h.

Ủ 44ºC/24h. Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): . .coli phát triển ở 44ºC.Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. đem đĩa ủ trong tủ ấm.Không lắc những ống có ống durham Bước 4 : Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính( +).Hơn nữa môi trường E.ở nhiệt độ này một số vi khuẩn khác đã bị hạn chế khả năng sinh trưởng .Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Môi trường Laury Trytose( LT) Rồi để yên cho thạch đông lại.Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Laury Trytose.C. cấy chuyền các ống LT(+) vào các ống môi trường E. tính kết quả. E. . Ủ ở 37oC trong 24h Sau khoảng thời gian trên lấy đĩa đã ủ ra và đếm khuẩn lạc.C muối mật ức chế cá vi khuẩn Gr + và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Trang 18 .

cấy truyền sang môi trường N.: không có hiên tượng gì xay ra ́ ̣ ̉ Từ các ống E.B agar Sau khoảng thời gian trên lấy ra đem nhận diện khuẩn lạc điển hình: .M. • Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trường endo agar và E.M.M. có tâm đen. cấy phân lập trên môi trường endo agar và E. bóng.C (+). Buớc 6 : làm nghiệm pháp imvic với vi khuẩn đã cấy ở bước 5 I : indol M :methyl red V : V. Ủ 37ºC/24h Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar và E.Môi trường E.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Ông LT + : môi trường đuc và ông durham ( ông chuông) nôi hoăc có ́ ̣ ́ ́ ̉ ̣ bot khí trong ông chuông (thể tich bot khí trong ông chuông =1/10 thể tich ̣ ́ ́ ̣ ́ ́ ông chuông). Ủ 37ºC/24h.B agar: • Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.B agar. bóng.A. Bước 5 : Từ các khuẩn lạc nghi ngờ. ́ Ông LT .P C : simon citrat Phản ứng sinh hóa kiểm tra sự có mặt của trực khuẩn đường ruột Gr– có khả năng sử dụng simon citrat Trang 19 . có ánh kim loại .M. có ánh kim.Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn.B agar: khuẩn lạc tròn.

Năm 1884. Bị lây nhiễm từ người chế biến. Đặc điểm và điều kiện sinh trưởng: Phát triển tốt ở các môi trường tổng hợp.: E.coli type I . đặc biệt phát triển tốt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh. Hình dạng tế bào: Là vk gram+. 1. lịch sử: Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có mủ.4.3. Đặc điểm của Stapylococcus aureus: 1. pHop=7.. khoang mũi. Phân bố: • Được phân bố rộng rãi.1. Trong vết thương và máu thường thấy hình dạng giống chùm nho 1. tế bào ở dạng cặn. Trên môi trường thạch . Nhiệt độ tối thích là 37oC . sữa… Ở người thường có trên da. hình cầu không bào tử. Trang 20 .2. Rosenbach tiếp tục nghiên cứu. có nhiều trong sản phẩm động vật như thịt.coli type II BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1. động vật bị nhiễm bệnh. tóc. hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý.khuẩn lạc có dạng tròn trơn bóng. Được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội(opportunist type) vì sự có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập.đục vun mờ.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Kết quả : + + .+ .. • • • 1. vòng nhẫn mờ trong ống nghiệm ở bề mặt môi trường . Ở môi trường lỏng.2.: E.

NH3-. saccharose. • • • • • 1. raffinose.6h (phụ thuộc vào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng Trang 21 . Bản chất của ngoại độc tố là protein nên chúng kém chịu nhiệt (trừ độc tố của Staphylococcus aureus) và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc hiệu(tính kháng nguyên mạnh) do vậy có thể phát hiện được bằng phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng indol-. ít có khả năng truyền nhiễm Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy có vsv gây bệnh. thuỷ phân gelantine. Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm. người ăn thực phẩm đó bị ngộ độc). đông huyết tương. Có khả năng chịu mặn cao Làm đông tụ sữa Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu. maltose. viêm ruột. Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sống trong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng.6. Khả năng gây bệnh: Gây ngộ độc thực phẩm: Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm. lactose.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1. Đặc điểm sinh hoá: • Lên men đường glucose. Triệu chứng bệnh: Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này. manitol Không lên men salicin. sau 30’. glycerol. Loại này thường có tính chất cục bộ.5. Độc tố gây viêm dạ dày. Type A và D gây ngộ độc thực phẩm cho người. người ăn thực phẩm đó và bị ngộ độc.inulin.

bủn rủn tay chân. nước súp (ít khi được sử lý ở nhiệt độ >40oC) và các loại thuỷ sản.5%/1h. Biện pháp phòng ngừa: • • • • • Kiểm tra sức khoẻ công nhân. formaldehyt 10%/ 10’. đau đầu toát mồ hôi. biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tố này. Một số hình ảnh về Staphylococcus aureus • Trang 22 . Là độc tố bền nhiệt. Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như Jambon. tiêu chảy. fenol 2%/15’. ngăn ngừa khả năng sinh độc tố. xử lý nhiễm vết thương trên da ở người và động vật do Staphylococcus gây ra dùng dung dịch gentiant violet 2%. Hoá chất: fenol 1%. kiệt sức ở mức nghiêm trọng. 137oC/9’độc tố này vẫn còn hoạt lực. Trử lạnh thực phẩm < 8oC. kem tổng hợp. nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h. Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp.5h. Hạ pH của thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển.000/5 – 10’. 100oC/30’. một số bị phân huỷ ở to= 80oC /0. Không lấy sữa từ động vật bị viêm vú.Sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72 h. toC = 60oC/ 0. Ít thấy vi khuẩn trong phân người bị ngộ độc. hgcl 0. quá trình chế biến. thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv này.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C đau thắt bụng. gentiant violet1:25. nạn nhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội.5h phá huỷ các tế bào.

bóng. vi khuẩn tròn. Quy trình kiểm tra: 3.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 2. Ủ 37oC/ 24h. Aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. đọc kết quả. có tâm đen. • Bước 5: Từ khuẩn lạc điển hình làm phản ứng pastorex. lồi. staphylatex. Ủ 37oC/24h. Bước 3: từ ống tăng sinh dương. 3. Quy trình kiểm tra định tính Bước 1: đồng nhất mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml nước vô trùng . bóng vun có vòng sáng quanh khuẩn lạc.stomacher. Ý nghĩa của việc kiểm tra vi khuẩn: Sự hiện diện với mật độ cao của Sta. Trong môi trường MSA : môi trường chuyển từ đỏ sang vàng. Aureus có đặc điểm tròn. Sau đó đọc kết quả: -Ống tăng sinh âm:có môi trường MSB vẫn giữ màu đỏ -Ống tăng sinh dương: Có môi trường MSB chuyển từ đỏ sang vàng. Bước 2: tăng sinh: hút 1ml ở dịch đồng nhất đưa vào môi trường MSB có màu đỏ. Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình.1. Trang 23 . • Trong môi trường Baird Parker: Sta. cấy phân lập lên môi trường baird parker agar (hoặc MSA).

Bước 6: tính kết quả Số lượng Staphylococci coagulase dương tính: cs=(f1*nt*ht)+(f2*na*ha) trong đó cs:số lượng Staphylococci coagulase dương tính.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Bước 6: Kết luận. Bước 3:nuôi cấy 0. Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình. Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình rồi cấy chúng từ môi trường BPA sang môi trường TSA. 3.1 ml dịch mẫu /đĩa.3 ml huyết tương thỏ.Ủ 37oC/ 24h. Nuôi cấy dịch mẫu trên môi trường baird parker.2 Quy trình kiểm tra định lượng. 3 đĩa/ nồng độ.24h. -Phản ứng dương tính :có khối đông hình thành.6. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau 1. tiến hành thao tác bằng que cấy trang. -Phản ứng âm tính: không có khối đông hình thành. dịch mẩu giống như ban đầu. Ủ 37oC. Bước 5: cấy chuyển VK sang ống nghiệm có chứa 0.3. Bước 1: đồng nhất mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml nước vô trùng . Ủ 37oC/ 48h. Bước 2:pha loãng mẫu tới các nồng độ thích hợp.stomacher. f: nồng độ pha loãng của mẫu nt:tổng số khuẩn lạc điển hình trên các đĩa na:tổng số khuẩn lạc không điển hình trên các đĩa ht=số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ số khuẩn lạc điển hình được thử nghiệm Trang 24 .

thịt .aureus.3 phản ứng sinh hoá Saulatex Dùng để định danh cả giống và loài Sta.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C ha=số khuẩn lạc không điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ khuẩn lạc điển hình được thử nghiệm Chú ý : nếu số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng 20 – 200. hải sản…cũng như các sinh phẩm khác. Mở Rộng : 4.lợn cợn những hạt nhỏ -phản ứng âm tính:màu trắng sữa như ban đầu 4.1 môi trường sử dụng: Môi trường Chapman agar(manitol salt agar): Là môi trường chọn lọc dùng để phát hiện. Bước 5: Đọc kết quả: . môi trường có khả Trang 25 .phản ứng dương tính:có màu trắng sữa. đếm số khuẩn lạc điển hình và không điển hình. trộn đều nhuyễn. 3.aureus vào giọt nước muối trên tiêu bản . Các thí nghiệm của koch cho thấy tụ cầu khuẩn có thể chịu được nồng độ muối cao 7. Quy trình: Bước 1:lấy dd muối vào tiêu bản Bước 2: lấy Sta. Bước 4: kéo 2 giọt nước lại trộn đều với nhau . Bước 3: lấy 1 giọt saulatex vào bên cạnh giọt nước muối . phân lập và định lượng tụ cầu khuẩn gây bệnh tronh thực phẩm như sữa. sau đó tính kết quả như công thức trên và ghi rõ trong biểu mẫu. đồng thời ghi nhận tụ cầu khuẩn nào gây đông tụ huyết tương thỏ sẽ hình thành khuẩn lạc vàng trên môi trường chapman agar.5%. Sau đó Chapman xác minh hiện tượng trên.

có thề lẫn các khuẩn lạc trong giống Bacillus nên cần xác định các khuẩn lạc này bằng cách quan sát dưới kính hiển vi. Công thức môi trường này do baird parker khai triển năm 1962 nhằm định lượng Staphylocoagulase. Xác định tất cả các loại khuẩn lạc có màu vàng hoặc màu trắng vói môi trường xung quanh có màu vàng. Môi trường Baird parker agar Là môi trường dùng để phân lậ p và định lượng vi khuẩn . Sau 48h nuôi cấy. Nồng độ muối cao ức chế sinh trưởng hầu hết các loài vi khuẩn trừ Staphylococcus.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C năng ức chế hầu hết vi khuẩn khác. Tardio và Baer quan sát trong 18 môi trường phân lập chọn lọc thử nghiệm thì môi trường B. Micrococcus và Serratia cũng có thể mọc trên môi trường này.P ít gây ức chế hơn các môi trường khác. Tuy nhiên.Staphylococcus trong thực phẩm. Smith và Baird Parker chứng minh rằng khi bổ sung sulfamerthzine vào môi trường sẽ ức chế sinh trưởng của vi khuẩn proteus. dược phẩm. Năm 1971. Tụ cầu khuẩn gây bệnh sẽ tạo khuẩn lạc có sắc tố vàng. Thành phần môi trường có lithium chloride và tellurite có tác dụng ức chế các quần thể vi khuẩn thường hiện diện cùng Staphylococci trong khi đó pyruvate và glycine kích thích sự phát triển của Staphylococci . Năm 1964. Vi khuẩn lên men đường manitol sinh axit làm đổi màu chỉ thị (fenol red)của môi trường từ đỏ sang vàng. tụ cầu khuẩn gây bệnh thường tạo khuẩn lạc nhỏ có màu đỏ và không làm thay đổi màu môi trường. Trang 26 . vài chuẩn cầu khuẩn đường ruột Baciilus. đồng thời môi trường xung quanh đổi từ đỏ sang vàng.

5%. màu nâu sậm đục. rất nhỏ.aureus được thực hiện trực tiếp với vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy đầu tiên. một loại lipase).đường kính từ 2 – 5 mm do sự thủy phân protein.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Khuẩn lạc Staphylococci có hai đặc điểm:Khuẩn lạc có màu đen do khử telurite thành telurium. mọc sau 48h. nấm men. Đây là một đặc tính thường thấy và có tính chuyên biệt ở các tụ cầu khuẩn gây bệnh. Đặc tính của Staphylococcus aureus sẽ được kiểm chứng qua phản ứng coagulase và tốt nhất bằng các thử nghiệm desoxyribonuclease và phosphatase. màu nâu tới đen. trắng. độ đặc hiệu 92. Sau đó có thể xuất hiện 1 vòng đục ở trong vòng trong (có tác động của lecithinase.VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS Trang 27 Micrococci Bacillus sp nấm men . Các loại vsv ngoại lệ khác có thể mọc trên môi trường này như: Staphylococcus epidermis. Pastorex: Là một thử nghiệm dùng để định danh S.5%. Bằng phản ứng ngưng kết latex trên kính (latex đã được mẫn cảm với huyết tương người). BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA. Bacillus. thử nghiệm cho phép phát hiện đồng thời 2 yếu tố: yếu tố cụm “clumping factor” (một chất có ở bề mặt tế bào vi khuẩn và có ái lực cao với fibrinogen) và protein A Kết quả nghiên cứu với pastorex với 228 chủng Staphylococci cho thấy:độ nhạy cảm 97. dạng lồi và tạo vòng trong xung quanh khuẩn lạc. Micrococci.

4.sữa.Chúng từng gây đại dịch do lây truyền qua tiếp xúc.parahaemolyticus là vi sinh vật biển.parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá .gây bệnh dịch tả cho một số vùng châu Á.Ai cập V.Ấn Độ và Đông Nam Á.3.hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy.parahaemolyticus .cholera tồn tại trong nước ngọt. nước .1.Đặc điểm hình thái Là vi khuẩn Gram -.vulnificus.cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan tới cả chân Mỹ.trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm : V.Lịch sử Vibrio cholera : năm 1883.còn tất cả các loại Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường xuyên được phân lập ở các vùng nước ven biển 1.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 1.V.hào… Người ta đã xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio.Đặc điểm phân bố V.thực phẩm và côn trùng V.Robert Kock với vai trò là trưởng nhóm nghiên cứu bệnh dịch tả đã phát hiện ra vi khuẩn này trong phân bệnh nhân ở vụ đại dich tả lần thứ 5 ở vùng Alexandria.không sinh bào tử.Đặc điểm sinh trưởng và phát triển Trang 28 .alginolyticus 1.cholera.tồn tại tự nhiên trong nước biển.di động nhờ 1 lông roi 1.2.thường gặp ở các loại hải sản loại nhuyễn thể và giáp sát trong nước biển Trừ V.V.V.Giới thiệu chung 1.

Các triệu chứng như tiêu chảy.sống kị khí tùy ý.hơi ớn lạnh. stomacher .mất nước. pHop=8.Và cũng chính vì khó phát hiện nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio sinh trưởng bằng cách tăng sinh trong môi trường pepton kiềm Bước 2 : Phân lập từ phần váng của dịch tăng sinh lên môi trường TCBS agar.đau đầu xuất hiện sau 12 h sau khi ăn một lượmg lớn vi sinh vật sống (105 tế bào/g).Biện pháp điều trị tốt nhất là bổ sung nước và chất điện giải thay thế Phần lớn các đợt dịch bệnh do V. có khả năng phát triển tốt trên môi trường kiềm.Cá triệu chứng trên tương tự như triệu chứng do Salmonella gây ra nhưng trầm trọng hơn.nôn mửa.cholera bị tiêu diệt ở nhiệt độ là t0=560C trong 30’. trong điều kiện khô hạn.Cấu trúc kháng nguyên và độc tố V.vì vậy ta sử dụng lượng mẫu lớn là 25g.parahaemolyticus tác dụng lên dạ dày người bệnh 2.parahaemolyticus gây ra thường vào mùa hè.gây tiêu chảy nặng . V. Ủ 370C/24h Rất khó phát hiện Vibrio trong mẫu.thậm chí gây tử vong với tỉ lệ lên tới 25-50%.5.Salmonella tác dụng lên vùng bụng trong khi V.Quy trình kiểm tra Bước 1: Tăng sinh 25 g thực phẩm ( mắm tôm) + 225ml peptone kiềm.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C T0op=370C .cholera sinh độc tố ruột và nội độc tố trong đường tiêu hóa.Ủ370C/24h Bước 3 : nhận diện khuẩn lạc điển hình Vi sinh vật Trang 29 Đặc điểm .choáng.kích thích nghiêm trọng màng nhày tạo ra dịch dạ dày.6 .ánh sáng và các chất diệt khuẩn 1.khi nước ở các thủy vực ấm lên.

tâm xanh lá cây đậm hơn màu môi trường.BIS 14 GNE gồm 14 phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn Gr .2-3mm Không màu.A.Trong đó MOB kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn MOBTrang 30 MOB+(mọc lan nhòe .trong suốt Bước 4: từ khuẩn lạc nghi ngờ.vulnificus Pseudomonas.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C Vibrio cholera Vibrio parahaemolyticus Vibrio alginolyticus Vibrio fluvialis.V.Aeromonas Các loại vk đường ruột khác Vàng.có 10 giếng (giếng 8 có 2 phản ứng là phản ứng sinh H2S và phản ứg Indol) và 3 phản ứng bên ngoài.A làm khánhg huyết thanh Vibrio .Trên vách tế bào bi khuẩn có chứa protein A và enzyme .đọc kết quả phản ứng ngưng kết hoặc làm BIS 14 GNE. ủ rồi đọc kêt quả -Huyết tương thỏ bị đông lại sau 30 phút khi cấy vi khuẩn vào.dẹp. Ủ 370 C / 24h Bước 5 : lấy vi khuẩn trên môi trường N.chuyển màu môi trường từ xanh sang vàng.3-4mm Khuẩn lạc vàng lớn Khuẩn lạc vàng lớn Khuẩn lạc xanh dương Khuẩn lạc nhỏ ..cấy chuyền sang môi trường N.

Klebsiella.hải sản Nồng độ cao các chất thiosulfate và sodium citrate cùng với tính kiềm sẽ ức chế tương đối sự phát triển của vi khuẩn đường ruột Mật bò và muối mật làm chậm sinh trưởng cầu khuẩn đường ruột và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram + Sự acid hóa môi trường do Vibrio lên men saccharose làm thay đổi màu của chỉ thị bromothymol blue sang vàng Hydrogen sulfide sinh ra do sư hiện diện của thiosulfate và ferric citrate.Quy trình kiểm tra Trang 31 1 1 1 .Môi trường sử dụng Môi trường TCBS agar là môi trường chọn lọc để phân lập Vibrio cholera và các loài Vibrio gây bệnh đường ruột khác ( đặc biệt là Vibrio parahaemolyticus) trong các mẫu bệnh phẩm hoạc trong các mẫu thực phẩm .Định nghĩa 2.Shingella…nhưng những khuẩn lạc này không có màu vàng MỤC LỤC Trang BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.coli .Salmonella typhy.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí 1 3.Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C trên đường cấy) 3.tất cả các loài Vibrio đều không sinh H2S Các vi khuẩn khác cũng có thể mọc trên TCBS agar như : E.

Nguyên tắc 3. Ý nghĩa của việc kiểm tra vi khuẩn 21 3. Mở Rộng 24 BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA.Giới thiệu chung 26 2.Mục đích thí nghiệm 2.dụng cụ sử cho thí nghiệm 6.Tiến hành thí nghiệm BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1 Đặc điểm của Stapylococcus aureus 18 2.COLI 1.Những kiến thức chung về COLIFORM 2.Môi trường sử dụng BAI 2: KIÊM TRA TÔNG SỐ COLIFORM ̀ ̉ ̉ 1. Quy trình kiểm tra 4.VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS 1.Quy trình kiểm tra 4. Môi trường sử dụng 5.Quy trình kiểm tra Trang 32 4 5 5 7 7 10 11 11 12 12 12 12 13 18 21 26 27 .Các thiết bị .Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 4.Kết quả thí nghiệm BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu 3.Dụng cụ và hóa chất 4.

Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C 3.Môi trường sử dụng 29 Trang 33 .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful