1.

Cc yu t bn ngoi
a. nhn t c ch bnh bch cu (Leukemia inhibitory factor LIF)

Khi cc dng t bo ES chut (mES) thu nhn u tin vo nhng nm u thp nin 1980, chng c khuch i bng vic ng nui cy vi lp t bo feeder. Phng php ny c tha hng t quy trnh nui cy cc t bo EC. Chnh cc t bo feeder h tr cc EC thng qua vic tit mt tn hiu lm ngn cn s bit ha. Sau ny ngi ta tin hnh nui cy t bo ec vi mi trng c nui cy t bo feeder (mi trng iu kin: conditional media- CM), nhm tn dng nhng cht m t bo feeder tit vo mooit rng trong qu trnh chuyn ha. Nhiu nghin cu sau xc nh nhn t quan trng l LIF. LIF, c tng hp, sn xut b sung vo mi trng nui nh l mt phng php mi, thay th vo vic ng nui cy (co- culture) (Smith v cng s, 1988; Williams v cng s, 1998). LIF thuc h cytokine kiu interleukin 6 (IL- 6) (Rose- John, 2002). H ny kch thch t bo thng qua cc receptor gpl30; gpl30 lm vic dng herterodimer cng mt loi receptor chuyn bit ligand (nh LIF- R).gpl130 c biu hin trong tt c cc t bo ca c th, trong khi cc tiu phn chuyn bit ligand ch biu hin nhng t bo chuyn bit. Ngoi LIF, hai nhn t khc cn li l oncostain M (OSM) v ciliary neutrophic factor (CNF) (cng thuc h cytokine IL- 6) c th s dng trong CM. S hot ha nhn t gpl30 dn n s hot ha tyrosin kinase kt hp Janus (Janus associated tyrosin kinase- JAK), cc protein chuyn tn hiu (signal transducer protein) v cc psrotein hot ha phin m (activator of transcription protein- STAT), cng nh s chuyn v ca chng n nhn, gn vo DNA v sau hot ha phin m. Kh nng LIF ngn cn s bit ha ca cc mES ph thuc vo svo s hot ha STAT 3. ng thi , s hot ha ca STAT3 (ngay c khi LIF vng mt) cng c kh nng lm t bo tng sinh. (Matsuda v cng s, 1999).

Hn na ngoi vic hot ha STAT3, LIF cng cm ng cc tn hiu khc nh lm hot ha ERK (extracellular receptor kinase) (Burdon v cng s, 1999). Khi ERK hot ha s kch thch s bit ha, do , s ngn cn bng gia trng thi hot ha STAT3 v ERK s quyt nh s phn ca cc t bo ES, hoc phn chia bnh thng, hoc bit ha. R rng, cc tn hiu kim sot s hot ha ERRK c vai tr quan trng nhm duy tr trng thi khng bit ha. S c ch PI3K (phosphoinositide 3- kinase) dn n s bit ha ca cc t bo mES (Paling v cng s, 2004). Cong ng tn hiu PI3K cng c cm ng bi LIF v s bit ha nh l kt qu ca s gia tng cc ERK hot ha. Mt con ng khc c ngh: hot ha bi LIF trong mES. Cong ng ny lien quan ti s hot ha h Src cc tyrosin kinase khng receptor (nonreceptor tyrosin kinase) v thnh vin cYes c bit ca n (Anneren v cng s, 2004). S c ch h ny lm gim s pht trin v biu hin ca cc marker ES mES v hES. S hot ha ca cYes trong mES c iu ha m tnh (down- regulate) bi cc LIF v huyt thanh. Tuy nhin, dng nh cYes khng c chc nng trung tm in vitro v chut b t bin cYes vn sng v hu th (Stein v cng s, 1994). Tri vi vai t ca LIF trong in vitro, nhng nghin cu Knock out cho thy tn hiu LIF khng cn thit trong qu trnh pht trin phi bnh thng giai on sm. Chut t bin LIF vn pht trin bnh thng v hu th, mc d LIF cn thit cho s lm t ca phi (Ttewart v cng s, 1992); chut t bin LIF- R cht trong vng 24h sau khi sinh (Ware v cng s, 1995) v s chut b t bin gpl30 cht tng dn sau ngy 12,5 dpc (Yoshida v cng s, 1996). Nhng nghin cu tip sau ngh mc d LIF khng cn thit trong sut qu trnh pht trin sm bnh thng ca phi, nhng n cn thit trong sut qu trnh c gi l thi k ngh hot ng (diapauses) Nichols v cng s, 2001). y l thi k m s pht trin ca phi b nh tr (xy ra trong vi tun) trong giai on blastocyst mun trc khi lm t, nhm p ng li s tit sa. Trong thi giai ny t bo ICM gi trng thi khng bit ha. Cc phi t bin gpl30 khng th phc hi pht trin trong thi gian ny v chng mt tnh a nng.

C th vai tr ca LIF in vitro phn nh iu kin khc thng m s khuch i, tng sinh ngn ngi ca ICM c ko di nhn to trong nui cy, ging s ko di ca trng thi khuch i c quan st trong sut thi k ngh ca phi. Cc t bo gc phi ngi cng cn ng nui cy vi t bo feeder, chng hn MEF. Nhng khng th nui cy hES trong mi trng c b sung LIF (ngun gc ngi hay chut). LIF c ngun gc t chut khng th hot ng trn t bo ngi (Layton v cng s, 1994), v do , cc protein tit ra t feeder MEF (t bo feeder fibroblast chut) khng th duy tr tnh a nng ca t bo hES. Trong hES cng nh mES, ng nui cy vi t bo feeder c th thay th bng CM v ko di nui cy khng feeder c th c duy tr trong s hin din ca cht nn ngoi bo (nh matrigel hay laminin) cng vi CM (Xu v cng s, 2001). gii thch s khng p ng ca hES vi LIF, gi thit u tin a ra l do s biu hin yu hay vng mt ca cc LIF- R (Rose- John, 2002). Tuy nhin, khi kim tra gi thieeys ny li thy rng, c s biu hin khc nhau ca LIF- R trn cc dng t bo hES khc nhau (Ginis v cng s, 2004), vi mc thp n khng biu hin. Nguyn nhn do thiu p ng ca LIF ln t bo hES khng phi l do hES mt kh nng p ng vi LIF, m l do s hot ha ca STAT3 trong hES (c vai tr quan trng trong trnh t lm mi ca MESC) khng ngn cn s bit ha ca hES (Daheron v cng s, 2004; Humphrey v cng s, 2004). Thm vo , trong trng thi khng bit ha ca hES th con ng STAT3 khng c hot ha. Tri li trong trng thi khng bit ha ca t bo mES, th con ng ny dng hot ha. b. BMP4 BMP4 l mt thnh vin thuc siu h TGF beta ca nhm cc phn t truyn tn hiu polypeptide, chng lin quan n s ngn cn bit ha ca t bo mES(Ying v cng s, 2003)0. Mc d LIF hiu qu trong vic nng chn s bit ha ca mES trong mi trng c huyt thanh, nhng khi khng c huyt thanh, ngay khi c hin din LIF th s bit ha thnh t bo thn kinh vn xy ra. C l huyt thanh nhiu nhn t cha bit, dng nh c mt t nhn t ngn cn s bit ha. C th b sung BMP4 vo mi

trng nui cy khng huyt thanh nu c s biu hin ca LIF, bi v xy ra s bit ha thnh cc dng t bo (khng phi t bo thn kinh). Nu loi b c LIF v BMP4 th kt qu bit ha thnh t bo thn kinh. Do , LIF cn duy tr kh nng khng gy bit ha BMP4, m khng c LIF s lm t bo bit ha. V vy, c th kt lun dng nh BMP4 ngn cn bit ha ca mES thnh cc t bo thn kinh v LIF ngn cn bit ha thnh cc t bo khc (khng l t bo thn kinh). BMP4 gip cho s t lm mi ca mES thng qua s hot ha ca cc protein Smad. Chng s hot ha cc gen ld, l cc nhn t bHLH m (negative bHLH factor). Cc mES c chuyn ld c th pht trin trong mi trng khng huyt thanh v khng cso BMP4. Huyt thanh cng cho thy c cm ng s biu hin ca ld thng qua nhiu con ng v mES pht trin trong s hin din ca huyt thanh, khng c BMP4 b sung th biu hin cc gen ld (Ying v cng s, 2003) BMP4 c vai tr trong s t lm mi bng cch c ch ERK v protein kinase hot ha mitogen p38 (mitogen activated protein kinase MAPK) (Qi v cng s, 2004) Tuy nhin, trong hES, vic thm BMP4 vo mi trng khng kch thch s t lm mi ca t bo nh mES. Tht vy, BMP4 lm cho hES bit ha thnh cc t bo trophoblast (Xu v cng s, 2002). y l mt s khc bit, mES dng nh khng c kh nng ny, S khc bit trong cc kh nng to ra trophoblast gy s ch l hES v mES c th c thu nhn t cc giai on khc nhau trong s pht trin v do kh nng t lm mi ca chng c th chu tc ng bi cc nhn t khc nhau. c. bFGF bFGF cn thit cho nui cy thng thng cc hES trong mi trng thay (Amit v cng s, 2000). Trong mi trng khng huyt thanh v c b sung bFGF th t bo bit ha, trong khi nu b sung bFGF, t bo s c hnh dng nn c hn v c th khng bit ha trong thi gian di hn.

Trong khi vic them bFGF khng cn thit cho s tng sinh ca mES, th chng li quan trng i vi cc t bo khc nh t bo EG c ngi v chut. bFGF cn cho vic chuyn trng thi tng sinh c gii hn ca t bo mm sinh dc thnh qun th t bo tng sinh v hn (Resnick v cng s, 1992). Tuy nhin, i vi cc EG chut, mt khi dng t bo c thit lp th bFGF khng cn cn cho nui cy (Matsui v cng s, 1992). Nhng kho st kim tra s biu hin cc nhn t nhiu con ng tn hiu trong hES, cho thy s biu hin ca cc nhn t truyn tn hiu FGF, bao gm c bn receptor FGF v cc thnh phn ca con ng xui dng, c nhiu trong hES khng bit ha, so vi cc t bo bit ha, bFGF c biu hin bi hES, nhng c v mc thp khng ngn cn bit ha. Protein Chut t bin Vai tr trong mES Vai tr trong hES

Hu th, thit yu cho Thay th s cn thit Khng c vai tr r LIF s lm t ca phi ca 1992) 1998) t bo feeder rng trong t lm mi 2004) (Stewart v cng s, (Williams v cng s, (Daheron v cng s,

Khng tin n giai Thay th nhu cu ca Lm hES bit ha on BMP4 egg cylinder. huyt thanh (Ying v thnh l nui phi (trophectodern) (Xu v cng s, 2004) Tht bi thit lp phi cng s, 2003) v v trung phi b (Winnier v cng s, 1995) Sng, khim khuyt Khng cn thit cho s Cn thit cho s tng trong s pht trin v tng sinh bFGF chc nng thn kinh (Dono v cng s, 1998) sinh trong mi trng khng 2000) huyt thanh (Amit v cng s,

Bng: Cc cytokine cn thit cho s t lm mi ca ES

d. Cc nhn t khc Do LIF v BMP4 khng c vai tr quan trng trong s t lm mi ca t bo hES, cho nn s tm kim cc nhn t khc thay th Cm hES vn tip tc. mES c bng chng cho thy cc con ng t lm mi l c lp vi LIF hay s hot ha STAT3 (Dani v cng s, 1998), do vy LIF dng nh khng phi l nn tng ca s to ra tnh a nng ca c t bo gc c ngi v chut. Mt vi bo co cho rng tm ra nhn t thay th CM trong nui cy hES, hoc con ng Wnt c kh nng duy tr s t lm mi ca t bo hES trong mt thi gian ngn (Sato v cng s, 2004). Bo co khc ngh rng TGF1, trong s kt hp vi fibronectin v LIF1 s hiu qu cho nui cy khng CM v feeder (Amit v cng s, 2004).

2. Cc nhn t bn trong
a. Oct4

Oct4 l mt nhn t phin m thuc h POU (POU transcription factor family), cha mt trnh t nhn din octamer (8- bp) c thy trong cc promoter v trong cc anhancer ca nhiu gen chuyn bit v biu hin thng xuyn. S biu hin ca Oct4 dng nh ch c cc dng t bo vn nng (Yeom v cng s, 1996), mc d n cng c hot ng trong mt s trng hp ung th (Tai v cng s, 2004). Oct4 c biu hin trong cc phi chut cc giai on sm t 4- 8 t bo, n khi ngoi phi b bt u bit ha. Chng biu hin lu di trong EG. Phi chut t bin Oct4 s cht sau khi lm t bi thiu ICM (Nichols v cng s, 1998) v phi ny ch c duy nht mt loi t bo l trophoblast. Nhng mES b lm gim biu hin ca Oct4 s bit ha thnh cc t bo trophoblast (Niwa v cng s, 2000) v nu gia tng (mt t hay gp hai) s biu hin ca Oct4 trong mES c th lm cc t bo bit ha. C th cho rng, Oct4 s c ch s bit ha thnh trophoblast, n hot ng trong s kt hp vi cc nhn t phin m khc hay cc yu t ng u ha (co-regulator) v t l gia cc nng ca cc nhn t s

quyt nh s phn ca t bo. Vai tr ca Oct4 trong s duy tr tnh a nng ca t bo hES ging vi vai tr ca n trong t bo mES. Gen mc tiu cho Oct4 v nhng nhn t iu ha bt u c sng t, c bit mES. Nhng gen c xc nh bao gm Fgf4 (Abrosetti v cng s, 1997), ng nhn t phin m Utf 1 (transcriptional co factor Utf 1) (Nishimoto v cng s, 1999), protein ngn tay km Rex 1 (zin figer protein) (Ben Shushan v cng s, 1998) receptor nhn t tng trng thu nhn t bch cu (platelet- derived growth factor) (Kraft v cng s, 1996), osteopontin (ONP) (Botquyn v cng s, 1998). Fbx15 (Tokuzawa v cng s, 2003) Cch m s hot ha ca cc gen mc tiu Oct4 thit lp v duy tr tnh a nng vn cha c bit. Bng cch kt hp vi cc ng yu t khc, Oct4 c th hot ng va nh nhng nhn t hot ha phin m, va nh mt nhn t c ch phin m. Oct4 c mt vi co- factor c pit nh adeno virus E1A, nhn t Sox- 2 lin quan n Sry (Sry- related factor Sox- 2), Foxd3 v HMG- 1. Cc co- factor ca Oct4 biu hin khc nhau trong cc t bo a nng. Chng hn, Sox- 2 biu hin c ICM v ngoi b nguyn thy, trong khi ELA (hot ng ging E1A) ch biu hin trong ICM.
b. Sox2

Sox2 l thnh vin h gen Sox (box HMG lin qua n CRY), m ha nhn t phin m vi mt domain gn DNA HMG n (single HMG DNA- binding domain). Ging vi Oct4, Sox2 biu hin trong cc t bo a nng ca phi chut giai on sm, ICM, ngoi phi b v t bo mm sinh dc. Nhng khc vi Oct4, n cng biu hin trong nhiu t bo ca ngoi b ngoi phi v trong cc t bo tin thn thn kinh v quan trng cho s duy tr tnh ng nht ca chng. S biu hin gim ca Sox2 lin quan n qu trnh bit ha. Cc phi chut null Sox2 c v sng bnh thng cc giai on blastocyst, nhng cht nhanh sau khi lm t. Cc phi ny thiu cu trc egg cylinder v thiu cc t bo biu m. Khi nui cy in vitro thit lp dng ES, blastocyst null Sox2 pht trin bnh thng vo ngy u, nhng sau bit ha thnh t

bo trophectoderm v cc t bo ni m vch. Mc d vai tr in vitro ca Sox2 c chng bng knock out sau khi lm t, nhng n cn c thm vai tr duy tr qun th t bo a nng giai on sm ca phi. Cc phi sm biu hin mc cao cc protein Sox2 c ngun gc t m. Ngay khi chut null Sox2, cc protein m Sox2 vn dc duy tr cho n giai on blastocyst. Do nguyn nhn m cc phi t bin vn sng st cho n khi lm t c th l do mc biu hin hiu qu ca Sox2 c ngun gc t m n giai on . Do vy c th Sox2 khng cn thit c duy tr cho n giai on sm, nhng khng th c pht hin trong chut knock out bi v s hin din ca Sox2 c ngun gc ca m. Hn na Sox2 c vai tr trong s duy tr cc t bo trophoblast, vng mt Sox2 nhng t bo ny khng th to ra. Gen Chut t bin Vai tr trong mES S biu hin trong hES v vai tr hin C vai trong tr

Cht sau khi lm t Cn cho s ngn cn bit Biu v thiu ICM Oct4 hin qu mc lm bit hoas ES.

ha thnh trophoblast. Biu nhiu dng t bo thnh ngoi b v ni b trong s t lm mi ngoi phi (extraembryonic ging nh t bo endoderm and ectoderm) mES hin trong

Ch cha cc m Cn cho vic ngn cn s Biu Nanog chc v khng c thy, Biu hin qu mc ES ngoi phi b hay lm s pht trin khng ph ngoi b ngoi phi Sox2 thuc vo LIF

ngoi phi mt t bit ha thnh ni b nguyn nhiu dng t bo

Sng st khng lu mES t cc chut null Biu trin ICM bnh chng pht trin bnh ES

hin

trong

sau khi lm t. Pht khng th thit lp. Ban u nhiu dng t bo

thng, nhng sau thng, nhng sau ch thiu cu trc egg to ra trophectoderm v cc cylinder v tht bi t bo ni m vch (parietal duy tr ngoi phi b endoderm cell) ca chng Cht khng lu sau mES t chut null khng Ch biu hin trong khi lm t. Kch th thit lp, mc d ban mt s dng t bo thc ngoi phi b u s pht trin ca chng ES v do c v Foxd3 ca chng b gim c v bnh thng. C s khng quan trng v rnh nguyn thy ni rng ca ngoi b ngoi (primitive khng tn ti Bng: nhng nhn t chnh lin quan n s t lm mi ca t bo ES
c. Foxd3

streak) phi.

Foxd3 thuc cc gen h u ch (forkhead family gen). N khng biu hin trong cc trng cha th tinh hay phi trong giai on 1 t bo, nhng s phin m ca n c pht hin trong phi blastocyst. Cc phi chut null Foxd3 s cht trong khong thi gian xung quanh s phi v ha, vi s mt ngoi phi b v s ni rng ca lp ni b v ngoi b ngoi phi. Tuy nhin, giai oan blastocyst th ICM. Khi nui cy in vitro, cc phi chut blastocyst null Foxd3 c v bnh thng, nhng sau ICM ca chng c th ni rng. Nhiu th nghim cho thy t bo null Foxd3 c th bit ha thnh nhiu kiu t bo khc nhau. Do dng nh Foxd3 cn thit cho s phi v ha. Vai tr ca Sox2 v Foxd3 khng c kim tra trn hES. Sox3 r rang l biu hin trn t bo hES khng bit ha. Tri li, trong khi mt s dng t bo ES ngi th Foxd3 biu hin, mt s khc th khng biu hin, do hnh nh n khng cn thit cho s t lm mi ca cc t bo hES.
d. Nanog

Mt gen khc va c pht hin lin quan ti s t lm mi ES l Nanog (Chambers v cng s, 2003; Mitsui v cng s, 2003), mt nhn t phin m homebox m khng thuc bt k nhm no ca gen homebox. N xut hin trong ICM chut phi giai on morula nn cht hay blastocyst, EG sm, ES v cc t bo EC, nhng vng mt trong cc t bo bit ha. Nu c s biu hin qu mc ca Nanog th t bo khng ph thuc vo LIF. Tuy c s lm mi v gi c tnh a nng khi vng mt ca LIF, nhng kh nng t lm mi ca n gim. Do s biu hin qu mc ca Nanog khng hon ton gip t bo ht ph thuc LIF. Tc ng ca s biu hin qu mc ca Nanog khng thng qua s hot ha STAT3 v do vy, c l 2 con ng STAT3 v Nanog c lp vi nhau. Khi Nanog ca cc mES h hi lm cho t bo bit ha thnh cc dng t bo ni b ngoi phi. Phi chut knock out Nanog pht trin thnh giai on blastocyst, nhng khi nui cy trn gelatin th ICM ca chng bit ha hon ton thnh ging t bo ni m vch. Do , Nanog cn thit cho s duy tr tnh a nng ca t bo ICM. Nu Oct c ch bit ha cc ES thnh trophoblast, th Nanog lm c ch s bit ha thnh t bo ni b nguyn thy. Tuy nhin, khng ging Oct4 (ngn chn s bit ha), Nanog khng ch ngn chn bit ha m cn duy tr tnh a nng. Cc gen mc tiu m Nanog hot ha, hay c ch cng cha c bit. Tuy nhin trnh t DNA m n gn vo c xc nh v gen mc tiu c ngh da vo s hin din ca trnh t ny, ngc dng vi v tr khi u s phin m ca chng. Chng hn l gen GATGA6 v dng nh Nanog c th c ch s biu hin gen ny bi s biu hin mnh ca GATGA6 tc ng ch bit ha thnh ni b ngoi phi.Nanog cng ch hai domain c kh nng hot ha phin m v do ,c th iu ha dng tnh cc gen chuyn bit ES, c ch nhng gen ni b ngoi phi. Nanog ngi c biu hin trong hES, EC v EG t bo sinh dc v trong vi khi u. C th con ng Nanog ngi v chut c s tng ng v chc nng, nhng iu ny cha c kim tra.

e. miRNA

MicroRNA (miRNA) l nhng nhn t iu ha c ngh lien quan n s iu ha phin m. Hu ht chng c ch dch m, mt s trng hp b mRNA phn hy. Mt s nghin cu mES thy rng, cc miRNA mi biu hin chuyn bit trong cc t bo ES khng bit ha, cng nh mt vi miRNA c xc nh trc tn ti nhiu hn trong cc t bo bit ha. V l mt trong nhng yu t iu ha s pht trin nn miRNA c ngh l nhng phn t c vai tr trong s duy tr tnh a nng ca t bo ES. Mt nghin cu tng t trn t bo hES cho thy c n 17 miRNA mi tn ti trong cc t bo ES cha bit ha. 11 trong s chng c tng ng vi cc miRNA pht hin mES (Suh v cng s, 2004).