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Estudio de caso 1: Evaluacin de la inocuidad del maz genticamente modificado resistente a los insectos, evento MON 810

Indice

Parte 3: Estudios de casos ............................................Error! Bookmark not defined. Estudio de caso 1: Evaluacin de la inocuidad del maz genticamente modificado resistente a los insectos, evento MON 810................................................................... 3 Prefacio..................................................................................................................... 5 Nota .......................................................................................................................... 5 Descripcin de la planta de ADN recombinante......................................................... 5 Descripcin de la planta hospedadora y su uso como alimento .................................. 6 Descripcin del organismo u organismos donantes .................................................... 6 Descripcin de la modificacin gentica.................................................................... 7 Caracterizacin de la modificacin gentica .............................................................. 9 Introduccin .......................................................................................................... 9 Caracterizacin molecular ................................................................................... 11 Modificacin de la expresin de la planta ............................................................ 13 El gen cry1a(b) y el nuevo carcter...................................................................... 14 Equivalencia entre la protena bacteriana y la producida en la planta ................... 15 Expresin ............................................................................................................ 17 Compuestos resultantes de la protelisis y metabolismo ...................................... 18 Estabilidad del inserto ......................................................................................... 19 Evaluacin de la posible toxicidad........................................................................... 20 Introduccin ........................................................................................................ 20 Especificidad de la protena ................................................................................. 20 Comparacin con bases de datos de toxinas ......................................................... 20 Toxicidad por dosis nica administrada por va oral a ratones.............................. 20 Contaminantes txicos potenciales ...................................................................... 21 Degradacin metablica en jugos gstricos e intestinales simulados .................... 21 Evaluacin de la posible alergenicidad .................................................................... 22 Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional ....................................................................... 23 Introduccin ........................................................................................................ 23 Datos sobre la composicin ................................................................................. 23

Prefacio El Organismo de Productos Alimenticios y Farmacuticos de los Estados Unidos finaliz el estudio del maz genticamente modificado resistente a los insectos, MON 810 en 1996. En 1997, Health Canada notific a Monsanto que el maz MON 810 estaba aprobado como alimento. Ambas autoridades de reglamentacin tomaron las decisiones habiendo estudiado exhaustivamente el maz MON 810 segn los principios internacionalmente aceptados para determinar la inocuidad de los alimentos derivados de plantas genticamente modificadas. El expediente del Organismo de Productos Alimenticios y Farmacuticos de los Estados Unidos se encuentra en el Apndice 1 y en el Apndice 2 el de Health Canada. Monsanto Canada Inc. present la descripcin de la nueva variedad, del organismo u organismos donantes, los mtodos de modificacin gentica y la caracterizacin. La nueva protena se identific, se caracteriz y se compar con la protena bacteriana original, se incluy asimismo una evaluacin de la toxicidad potencial. Se presentaron tambin publicaciones cientficas y la informacin de los ensayos de campo controlados efectuados en Canad y en los Estados Unidos en 1995 y 1996. En esta publicacin se incluyen citas textuales del expediente presentado ante Health Canada que se encuentran entre comillas. Nota Monsanto Canada Inc. ha permitido que se utilice la informacin de la solicitud reglamentaria del maz MON 810 como herramienta de capacitacin. Sin embargo, es necesario recordar que, para utilizar el estudio de caso como herramienta de capacitacin, hemos hecho uso de ciertas licencias con respecto a la informacin proporcionada en las solicitudes originales. Ciertas partes se han condensado en resmenes y la informacin presentada es slo una parte de la solicitud original. El estudio de caso no constituye de ninguna manera una solicitud completa y tampoco debe considerrselo como una evaluacin de inocuidad exhaustiva. La utilizacin de la informacin aqu presentada como herramienta de capacitacin no refleja necesariamente su aprobacin ni tampoco la del producto. Tampoco implica juicio alguno sobre las solicitudes originales. Descripcin de la planta de ADN recombinante El maz MON 810 contiene una parte del gen cryIA(b) de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 que codifica una protena endotoxina delta activa que se expresa en el tejido del maz. La plaga objetivo es el taladro o barrenador del maz; Ostrinia nubilalis, una plaga importante que se alimenta de los tejidos de la planta dandolos. Los tejidos atacados varan segn el nmero de generaciones de Ostrinia nubilalis. Las larvas daan a) las hojas de las que se alimentan, b) los tallos en los que cavan tneles, c) la vaina foliar y el cuello de los que se alimentan y d) la mazorca o choclo. Ostrinia nubilalis altera la translocacin de nutrientes y de agua, provoca la aparicin de enfermedades infecciosas secundarias, causa el vuelco de los tallos, la cada de la mazorca o choclo y daos al grano. Las prdidas anuales de rendimiento del cultivo se estiman entre un 5 y un 10%. La variedad se obtuvo de la siguiente manera. Varias compaas de semillas recibieron semillas F1 de maz MON 810 con el genotipo transformado Hi-II cruzado con varias lneas endogmicas lite. El genotipo lite modificado se recuper cruzando la progenie obtenida con el progenitor endogmico recurrente. Las pruebas de hbridos se efectuaron con el

progenitor endogmico modificado obtenido luego de varios ciclos de autofecundacin. La cantidad de semillas progenitoras para producir semillas hbridas comerciales se aument por autofecundacin. La semilla hbrida de la variedad resistente a los insectos es heterocigtica para el gen cryIA(b) ya que alcanza con que un progenitor endogmico posea el gen para que el fenotipo resistente a los insectos se manifieste en la progenie hbrida. Si bien el maz MON 810 es una variedad forrajera que se destina principalmente a piensos, en algunos casos se utiliza como alimento para consumo humano aunque no es una variedad de maz dulce. El maz MON 810 puede utilizarse, por ejemplo, molido en seco o con un cierto contenido de humedad para elaborar productos a base de maz para consumo humano. Los usos previstos para el maz MON 810 son los mismos que los de otros hbridos forrajeros. Descripcin de la planta hospedadora y su uso como alimento La planta hospedadora es una lnea hbrida de Zea mays de la familia del Mo17X (Hill X B73) que se ha utilizado durante largo tiempo principalmente como pienso ya que no es una variedad de maz dulce sino forrajero. Zea mays L. se ha cultivado durante ms de 8000 aos en Mjico y Amrica Central. Durante el transcurso del ltimo siglo se han registrado aumentos del rendimiento y el rea geogrfica donde se planta esta especie verstil y con gran capacidad de adaptacin se ha expandido debido al desarrollo de hbridos, a los programas de mejoramiento y al uso de fertilizantes. Hoy en da el maz se planta en todos los continentes habitados. En la dcada de los aos treinta, antes de comenzar con los programas de hibridacin, el rendimiento era de 1,3 toneladas por hectrea (h.). En la actualidad, el rendimiento mximo registrado es de 123,5 toneladas/h (con un promedio de aproximadamente 3,73 toneladas por acre en los Estados Unidos). En el ao 2000 la produccin mundial de maz se estima en 648 millones de toneladas. El maz se utiliza para diversos fines y en muchos productos. En varias regiones del mundo es un alimento bsico. Tambin se utiliza en productos elaborados, por ejemplo fculas, alcohol, aceite, para piensos y para producir etanol, un combustible renovable. Descripcin del organismo u organismos donantes En el maz MON 810 se insert el gen cryIA(b) que codifica la protena CryIA(b), una endotoxina delta que confiere a la planta resistencia a plagas de insectos lepidpteros. Este gen se obtiene de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki (B.t.k.) cepa HD-1. Las especies de este gnero de bacterias gram positivas que esporulan, producen una protena cristalina que posee propiedades insecticidas. Estas especies tienen una larga trayectoria de uso comercial para el control de plagas. Cada cepa de Bacillus thuringiensis posee propiedades insecticidas especficas:

Bacillus thuringiensis israelensis para dpteros (familias Culicidae y Simuliidae) Bacillus thuringiensis sandiego y tenebrionis para colepteros (Leptinotarsa decemlineata, Pyrrhalta luteola, Tenebrio molitor)

Bacillus thuringiensis kurstaki, thuringiensis, sotto y aizawai para lepidpteros (Ostrinia nubilabis (Hb.), Phlegethontius quinquemaculatus, Porthetria dispar; Lymantria d., Trichoplusia ni, Heliothis virescens (F.), Heliothis armigera (Hb.)).

Los cristales de endotoxina delta se forman cuando la bacteria esporula. La protena es insoluble a pH neutro o cido, pero es soluble en el pH bsico del estmago de las larvas de los insectos donde se activa con las proteasas estomacales. La protena activada (sin el terminal carboxilo y aproximadamente a 28 aminocidos desde el extremo amino, de aproximadamente 600 aminocidos) penetra la membrana peritrfica por difusin hasta el epitelio del intestino medio cuya superficie contiene receptores especficos de alta afinidad a los que se acopla. Luego se inserta en la membrana y forma poros especficos para iones (los insectos de otras especies distintas a la especie objetivo, las aves, los mamferos y los peces no poseen este tipo de receptores). Estos poros permiten el pasaje del contenido intracelular al lumen del intestino y de agua a las clulas del epitelio intestinal provocando hinchazn y lisis. El intestino se paraliza causando trastornos en la digestin, el insecto deja de alimentarse y muere. En el expediente que present la empresa se prueba que la protena del maz MON 810 resistente a los insectos es idntica a la que produce Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1, que controla las plagas de insectos mediante cristales de una endotoxina delta. El Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki se ha utilizado como agente microbiano para control de plagas durante varios aos y se ha probado que las protenas de Bacillus thuringiensis naturales casi no presentan toxicidad para peces, aves, mamferos y otras especies distintas de la especie objetivo... no se espera que la comercializacin de estos maces cause efectos adversos en la fauna salvaje. Solo los insectos lepidpteros son susceptibles a las propiedades insecticidas de la protena CryIA(b). De los dieciocho insectos estudiados solo siete son sensibles a la protena ... y todos ellos son lepidpteros. La presencia de receptores en los insectos objetivo explica la especificidad de la protena. No se espera que la actividad selectiva de la endotoxina de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki altere las poblaciones de insectos que generan beneficios o de otros animales distintos al objetivo (por ejemplo, aves o peces). Segn los ensayos y estudios (citados en la literatura cientfica), la documentacin de registro y las evaluaciones de inocuidad de los registros, por ejemplo de DIPEL, los pesticidas microbianos disponibles comercialmente no son txicos para mamferos, aves, peces e insectos distintos del objetivo que generan beneficios, incluidos los predadores y parsitos de las plagas de insectos lepidpteros y de la abeja melfera. Descripcin de la modificacin gentica EL ADN del plsmido se introdujo en el tejido vegetal mediante bombardeo con microproyectiles (o transformacin biolstica). La tcnica consiste en precipitar el ADN sobre la superficie de partculas microscpicas de tungsteno u oro utilizando cloruro de calcio o espermidina. Luego se coloca una gota de las partculas recubiertas sobre un macroportador plstico que se acelera a alta velocidad mediante una explosin de plvora a travs de un barril. Una placa de plstico especialmente diseada detiene la trayectoria del macroportador y permite que las partculas recubiertas de ADN continen su trayectoria penetrando las clulas vegetales. Dentro de la clula, el ADN se deposita y se incorpora al cromosoma. Las clulas se incuban en un medio de cultivo con 2,4-D que promueve la formacin de callos. El

ADN de las clulas modificadas contiene genes que codifican la resistencia al glifosato. Estos genes permiten seleccionar las clulas modificadas cultivndolas en presencia de glifosato. En la transformacin biolstica se utilizaron dos plsmidos, PV-ZMBK07 (Figura 1) que contiene el gen cryIA(b) y PV-ZMGT10 (Figura 2) que contiene dos genes marcadores utilizados para la seleccin en medios con glifosato: el gen de la 5-enolpiruvil-siquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4 y el gen de la glifosato oxidoreductasa. En los Cuadros 1 y 2 se describe el ADN de los plsmidos. El maz MON 810 slo contiene una parte del vector plsmido PV-ZMBK07 y los genes marcadores no estn presentes en la construccin final del MON 810. En el Captulo 3 se detallan los mtodos utilizados para efectuar estas constataciones. "Se cree que los genes que permiten seleccionar las clulas cultivadas en presencia de glifosato se incorporan inicialmente al ADN del genoma de la planta pero luego se pierden en los retrocruzamientos porque en el cruzamiento se segregan los genes que se integran en loci distintos al del gen cryIA(b)." Si bien ambos plsmidos contienen el gen bacteriano que codifica la neomicina fosfotransferasa II controlado por su propio promotor bacteriano que se emple como marcador selectivo para crear el plsmido, se demostr que este gen no se encuentra presente en el maz MON 810. Cuadro 1. ADN del plsmido PV-ZMBK07 (ver Figura 1). Secuencia gentica E35S Intrn hsp 70 cryIA(b) NOS 3' lacZ Tamao (Kb) 0,61 0,80 3,46 0,26 0,24 Funcin Promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada. Intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz (hsp70) que aumenta el grado de transcripcin del gen. Gen que codifica la protena CryIA(b). Regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa que indica la finalizacin de la transcripcin y rige la poliadenilacin. Secuencia de codificacin parcial de lacI de E. coli, el promotor Plac y una secuencia de codificacin parcial de la -Dgalactosidasa o la protena lacZ del vector pUC119. Origen de replicacin de los plsmidos pUC que permite la replicacin del plsmido en E. coli. Gen que codifica la enzima neomicina fosfotranferasa tipo II que confiere resistencia a los antibiticos aminoglucsidos y por lo tanto permite seleccionar las bacterias que contienen el plsmido.

ori-pUC nptII

0,65 0,79

Cuadro 2. ADN del plsmido PV-ZMGT10 (ver Figura 2). Secuencia gentica Tamao (Kb) Funcin

Secuencia gentica E35S Intrn hsp 70 CTP2

Tamao (Kb) 0,61 0,80 0,31

Funcin Promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada. Intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz (hsp70) que aumenta el grado de transcripcin del gen. Pptido de trnsito al cloroplasto 2 aislado del gen de la 5enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de Arabidopsis thaliana cuya funcin es dirigir la protena 5-enolpiruvil-siquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4 al cloroplasto, donde se efecta la sntesis de aminocidos aromticos. Gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, aislado de Agrobacterium sp cepa CP4 que permite seleccionar las clulas modificadas cultivadas en presencia de glifosato. Pptido de trnsito al cloroplasto 1 aislado de una pequea subunidad del gen que codifica la ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa (SSU1A) de Arabidopsis thaliana cuya funcin es dirigir la protena de la glifosato oxidoreductasa al cloroplasto, donde se efecta la sntesis de aminocidos aromticos. Gen que codifica la glifosato oxidoreductasa, enzima que metaboliza el glifosato, aislado de Achromobacter sp. (nuevo gnero Ochrobactrum anthropi) cepa LBAA. Regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa que indica la finalizacin de la transcripcin y rige la poliadenilacin. Secuencia de codificacin parcial de lacI de E. coli, el promotor Plac y una secuencia de codificacin parcial de la -Dgalactosidasa o la protena lacZ del vector pUC119. Origen de replicacin de los plsmidos pUC que permite la replicacin del plsmido en E. coli. Gen que codifica la enzima neomicina fosfotranferasa tipo II que confiere resistencia a los antibiticos aminoglucsidos y por lo tanto permite seleccionar las bacterias que contienen el plsmido.

CP4 EPSPS

1,4

CTP1

0,26

gox

1,3

NOS 3' lacZ

0,26 0,24

ori-pUC nptII

0,65 0,79

Segn los resultados obtenidos en los experimentos de transformacin del maz, la frecuencia de obtencin de transformantes tolerantes al glifosato aumenta si se utilizan ambos marcadores de seleccin de origen vegetal. El plsmido PV-ZMBK07 tiene 7794 pares de bases y el PV-ZMGT10 tiene 9427 pares de bases.Caracterizacin de la modificacin gentica Introduccin Entre las tcnicas empleadas para efectuar la caracterizacin molecular del maz MON 810 se incluyen el Southern blot y el Western blot. Utilizando los mapas de los plsmidos se identificaron los nuevos genes posibles y los productos gnicos potenciales del maz MON 810 que se resumen en el Cuadro 3. Cuadro 3. Posibles genes nuevos y productos gnicos potenciales en el maz MON 810.

Gen nuevo PV-ZMBK07 cryIA(b)

Producto gnico nuevo

Secuencia reguladora

Otras secuencias de ADN

Gen Bt

El promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada (0,6Kb) controla la secuencia y un intrn de 0,8 KB del gen que codifica la protena de choque trmico del maz aumenta la transcripcin gnica. Una secuencia de terminacin de 0,24 Kb de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa que se encuentra adjunta al gen cry enva las seales de poliadenilacin del ARNm. La bacteria controla el promotor que est unido a la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa Seguido del origen de replicacin de los plsmidos pUC de 0,7 Kb que permite la replicacin de los plsmidos en E. coli.

lacZ-alpha

Betagalactosidasa. Un poliligador (regin con mltiples sitios de clonacin) que permite clonar los genes deseados en el vector plsmido.

nptII (marcador para la seleccin durante la creacin del plsmido derivado del transposn procariota Tn5).

Neomicina fosfotransferasa Resistencia a antibiticos aminoglucsidos (por ejemplo kanamicina y neomicina)

Cuenta con su propio promotor bacteriano.

PV-ZMGT10 Gen de la glifosato oxidoreductasa clonado de Achromobacter sp. cepa LBAA La glifosato oxidoreductasa es la enzima que metaboliza el glifosato. Degrada el glifosato convirtindolo en cido aminometilfosfonico y glioxilato. Unido al pptido de trnsito al cloroplasto 1 que dirige el gen al plasto. Derivado de una subunidad del gen que codifica la ribulosa 1,5 difosfato carboxilasa (SSU1A) de Arabidopsis thaliana. Controlado por las secuencias descritas del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz y el

Gen nuevo

Producto gnico nuevo

Secuencia reguladora terminador de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa.

Otras secuencias de ADN

Gen que codifica la 5-enolpiruvilsiquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4 aislado de Agrobacterium sp. cepa CP4 resistente al glifosato

5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintetasa

Unido al pptido de trnsito al cloroplasto 2. Aislado de la 5enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de Arabidopsis thaliana. El tamao del gen y del pptido de trnsito al cloroplasto 2 es de aproximadamente 1,7 Kb. Controlado por las secuencias del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz y el terminador de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa.

Tambin contiene los genes lacZalpha, el origen de replicacin de los plsmidos pUC que permite la replicacin del plsmido en E. coli. y el que codifica la enzima neomicina fosfotranferasa tipo II descritos.

Caracterizacin molecular La caracterizacin molecular del ADN integrado se efectu determinando:

la cantidad de insertos (nmero de sitios de integracin en el genoma del maz), el nmero de copias (de cada gen del ADN integrado) y la integridad del inserto.

Estos parmetros se determinaron con Southern blot.

El maz MON 810 se compar con un maz control no transgnico (homlogo), el MON 818, que tambin pertenece a la familia del Mo17 X (Hi-II X B73). El MON 818 no contiene los genes que codifican las protenas 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, la glifosato oxidoreductasa, ni la Cry1A(b) de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1. Cantidad de insertos El ADN extrado se digiri con NdeI, una enzima de restriccin, que no corta dentro de los plsmidos utilizados para crear el maz MON 810. En la Figura 3 se observa una nica banda a 5,5 Kb aproximadamente, por lo tanto el ADN del plsmido se encuentra en un solo sitio. Esta disposicin del ADN de los plsmidos se debe a que estos no tienen sitios de restriccin y la enzima corta fuera del ADN insertado, produciendo un fragmento que contiene el ADN insertado y algo de ADN genmico adyacente. Los insertos de ADN se ubican de forma aleatoria dentro de la secuencia del ADN de la planta y por lo tanto la distancia entre el ADN insertado y los sitios de restriccin de la enzima vara. Si hubiera ms de un sitio de insercin, al aadir una enzima de restriccin que slo corta fuera del inserto es probable que el tamao del fragmento que contiene el ADN insertado vare segn la distancia que hubiere hasta el sitio de restriccin de la NdeI. Por otra parte, si hubiera ms de un sitio de insercin, la transferencia Southern mostrara varias bandas. Composicin del inserto El maz MON 810 no contiene las secuencias que codifican la 5-enolpiruvil-siquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4, la glifosato oxidoreductasa y el origen de replicacin de los plsmidos pUC, segn se demostr con estudios efectuados usando varias sondas. Sin embargo, el fragmento de restriccin obtenido con NdeI de 5,5Kb contiene las secuencias que codifican la neomicina fosfotranferasa tipo II, el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz y la cryIA(b). cryIA(b) El ADN se digiri con una mezcla de NcoI y EcoRI. Entre los fragmentos resultantes se seleccion el que contiene el gen cryIA(b) que se analiz con la transferencia Southern. En los resultados se observa un fragmento de aproximadamente 3,1 Kb (Figura 4), que alcanza para codificar la protena CryIA(b) con propiedades insecticidas". Si bien en el control de hibridacin positiva (faja 1 Figura 4) se observa un fragmento de 3,46 Kb, que corresponde al tamao esperado del gen cryIA(b), en el ADN del maz control MON 818 (faja 2) no se observa ninguna banda. En el ADN del maz MON 810 se observa una banda de aproximadamente 3,1 Kb. El fragmento del gen cryIA(b) integrado al maz MON 810 codifica la protena resistente a la tripsina de 63 kDa (Figuras 5 y 6), segn se comprob con la transferencia Western. Estos resultados y la eficacia del maz MON 810 permiten afirmar que el gen cryIA(b) codifica una protena CryIA(b) con propiedades insecticidas que protege a la planta de maz contra los ataques de Ostrinia nubilalis eficazmente durante todo el ciclo. Gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 El ADN se digiri con una mezcla de NcoI y BamHI. Entre los fragmentos obtenidos se encuentra el del gen de de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. Segn la transferencia Southern (Figura 7), el maz MON 810 no contiene el fragmento de 3,1 Kb (el tamao esperado del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4) que se encontr en la preparacin de gel con concentraciones conocidas de los

dos plsmidos. La protena de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 no se encontr en los tejidos foliares, de la planta en general o del grano, segn los resultados del ensayo ELISA. La transferencia Western confirma la ausencia de la protena en los extractos foliares (Figura 8, faja 9). Gen que codifica la glifosato oxidoreductasa Si el gen que codifica la glifosato oxidoreductasa estuviera presente, la digestin del ADN con una mezcla de NcoI y BamHI (NcoI a NcoI) producira el fragmento correspondiente que tendra aproximadamente 3,1 Kb. La transferencia Southern del maz MON 810 (Figura 7) indica la ausencia del gen que codifica la glifosato oxidoreductasa. El gen tampoco se detect en tejidos foliares analizados con el ensayo ELISA y con la transferencia Western (Figura 9, faja 8). Esqueleto del plsmido El esqueleto del plsmido (secuencias que codifican la neomicina fosfotranferasa tipo II y el origen de replicacin de los plsmidos pUC) se analiz digiriendo el ADN del maz MON 810 y del plsmido PV-ZMBK07 con una mezcla de NcoI y EcoRI. La transferencia Southern utilizando una sonda del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II solo detect bandas en el ADN del plsmido a 2,5 Kb y 1,8 Kb, pero no se observ ninguna banda en el ADN del maz MON 810. Con el agregado de una sonda del gen que codifica el origen de replicacin de los plsmidos pUC, en la transferencia Southern se observ una banda 1,8 Kb en el ADN del plsmido (Figura 10) pero no se observ ninguna banda en el maz MON 810. De acuerdo con los resultados descritos, el ADN que se integr en el genoma del maz MON 810 contiene aproximadamente 4 Kb de ADN del plsmido PV-ZMBK07 compuesto de una porcin potenciada del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada (que se cree contiene uno de los dos elementos potenciadores adems del promotor), todo el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz y 2448 pares de bases del gen cryIA(b) que est compuesto de 3468 pares de bases (Figura 11). No se encontr ADN del esqueleto del vector bacteriano (por ejemplo, del origen de replicacin de los plsmidos pUC), ni de los genes que codifican la neomicina fosfotranferasa tipo II, la glifosato oxidoreductasa o de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. El expediente de la solicitud indica que el maz MON 810 contiene un fragmento de ADN integrado, que se encuentra en un fragmento de digestin con NdeI de 5,5Kb, dentro del cual se encuentra el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz, y el gen cryIA(b). Los resultados de la transferencia Western demuestran que el maz MON 810 produce la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 de 63 kDa resistente a la tripsina. Integridad y actividad del gen CryIA(b) En el proceso de aceleracin de partculas el ADN del plsmido puede romperse, rotura que ocasiona la integracin de genes parciales en el ADN genmico. Segn se comprob con el Southern blot y con la secuencia de clonacin genmica, de los 3468 pares de bases del gen cryIA(b) solo se integraron al maz MON 810 los primeros 2448 pares de bases. Modificacin de la expresin de la planta El anlisis molecular del maz MON 810 indica que solo contiene el gen cryIA(b) del plsmido PV-ZMBK07 y que no contiene los genes que codifican la 5-enolpiruvil-siquimato-

3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, la glifosato oxidoreductasa ni la neomicina fosfotranferasa tipo II y el origen de replicacin de los plsmidos pUC. No hay pruebas de que se hubiera insertado una parte del ADN del plsmido PV-ZMGT10. En el maz MON 810 se integr un fragmento de ADN ubicado en un fragmento de restriccin con NdeI de 5,5Kb, que contiene el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz, y el gen cryIA(b). El gen cry1a(b) y el nuevo carcter El gen que codifica la protena CryIA(b) se encuentra descrito en la literatura. Si bien los genes insertados en el maz MON 810 se han modificado con el fin de potenciar su expresin, la secuencia de aminocidos de la protena expresada es idntica a la protena natural de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki y tambin se ha comprobado que las propiedades insecticidas de uno y otro son equivalentes. El Cuadro 4 describe los productos gnicos del gen cryIA(b) insertado en el maz MON 810, tal como la empresa lo present en la solicitud. Cuadro 4. Productos gnicos en la planta modificada. Producto gnico Compuestos post desintegracin, subproductos y rutas metablicas Ingrediente activo: Pptido con tripsina Expresin Actividad del producto gnico en la planta Actividad del producto gnico en el medio ambiente Se degrada rpidamente en el suelo y con la digestin (excepto en lepidpteros)

Protena endotoxina delta CryIA(b)

Constitutiva

No afecta otras rutas metablicas

El Western blot se utiliz con el fin de:

evaluar los productos proteicos del gen parcial empleando anticuerpos especficos de las protenas de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki, compararlos con la protena normal que produce E. coli y con extractos de tejidos de otros maces resistentes a los insectos, buscar productos proteicos anmalos o inesperados (por ejemplo, los genes que codifican la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y la glifosato oxidoreductasa (Figuras 8, 9, y 12)) y determinar si la protena de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki expresada se poda convertir en el producto proteico del tamao esperado de 63 kDa resistente a la tripsina (Figuras 5 y 6).

El anlisis de las protenas de Bacillus thuringiensis del maz MON 810 y de los otros seis maces resistentes a los insectos (Figura 5, fajas 5 a 11) con la transferencia Western indican la presencia de varios productos proteicos, como ocurre habitualmente. En el maz MON

810, tal como se esperaba, no se encontr el gen completo porque en el genoma solo se incorpor una parte de la totalidad de los pares de bases que componen este gen ... En el maz MON 810 no se observaron diferencias aparentes en los rangos de tamao de los otros productos proteicos que no contenan todos los pares de bases . en comparacin con los otros seis maces resistentes a los insectos a los que se incorpor todo el gen cryIA(b). El peso molecular estimado de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 obtenida a partir de una parte del gen cryIA(b) es de 92 kDa pero esta no se detecta probablemente debido al bajo grado de expresin o debido a que durante la extraccin se degrada rpidamente al producto resistente a la tripsina. Los resultados de la digestin con tripsina de los extractos proteicos de los siete maces indican que el ncleo de la protena es de 63 kDa aproximadamente (Figura 6). Excepto por la protena de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 incompleta, todas las otras protenas y los otros productos inmunoreactivos del maz MON 810 son similares a los de otros maces resistentes a los insectos. No se detectaron otros productos inesperados. Los resultados obtenidos con tripsina prueban que el trozo de gen cryIA(b) insertado en el maz MON 810 codifica eficazmente la protena de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 resistente a la tripsina. Equivalencia entre la protena bacteriana y la producida en la planta La cantidad de protena CryIA(b) necesaria para efectuar las pruebas, por ejemplo los ensayos de alimentacin, se obtuvo a partir de Escherichia coli con el gen de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki. Es decir que la equivalencia entre la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 producida en el maz resistente a los insectos se compar con la producida por E. coli. El grado de expresin de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 en los maces resistentes a los insectos es extremadamente bajo. Por lo tanto, no es factible aislar a partir de plantas de maz la cantidad suficiente de esta protena para efectuar los mltiples estudios de inocuidad realizados para registrar el producto. En consecuencia se opt por aislar la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 activa funcionalmente a partir de un hospedador microbiano y verificar su equivalencia fsica y funcional en comparacin con la protena expresada en la planta. Se espera que una vez ingerida, la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 ntegra (~ 131 kDa) se convierta rpidamente en el ncleo de la protena resistente a la tripsina (~ 63 kDa) por lo cual se consider que esta ltima es un material de estudio adecuado para evaluar la primera. Se presentaron dos estudios. En uno de ellos, se compara la protena CryIA(b) de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 de DIPEL, un producto microbiano comercial, con las muestras de tejido foliar del maz 754-10-1. Los plsmidos de transformacin utilizados en el maz 754-10-1 y en MON 810 son los mismos, pero en el primero los grados de expresin de la protena son ms altos y por lo tanto se puede purificar mayor cantidad de protena para los estudios de equivalencia. El estudio prueba que el peso molecular y la reactividad inmunolgica del ncleo de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 resistente a la tripsina del maz y el de E. coli son equivalentes. DIPEL y el maz 754-10-1 contienen una banda de protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 ntegra de aproximadamente 134 kDa y el mismo ncleo resistente a la tripsina de aproximadamente 63 kDa. La transferencia Western demuestra que el ncleo de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 del maz 754-10-1 y del MON 810 son equivalentes y por lo tanto se concluy que la protena producida por E.coli es un sustituto adecuado de la protena del maz MON 810.

Los extractos vegetales, DIPEL, el producto microbiano comercial, y la preparacin que contiene la protena ntegra, utilizada en los estudios de toxicidad grave, contienen varios productos proteicos. En respuesta a una pregunta formulada a propsito de otros fragmentos presentes en la transferencia Western que reaccionan con las sondas de anticuerpos CryIA(b) y su significado se inform que no debera presentarse ningn problema ya que el estudio de toxicidad oral por una nica dosis debera haber incluido estos fragmentos. No se encontraron homologas de aminocidos entre las toxinas o alrgenos conocidos y los fragmentos que pudieran encontrarse en los tejidos de maz, excepto el del ncleo de la protena resistente a la tripsina de 28-610 aminocidos (1-28 y 611-11230). La comparacin de la secuencia completa de la protena CryIA(b) con la misma base de datos demuestra que no hay homologa con las toxinas o alrgenos conocidos. El proceso de digestin y sus consecuencias en la protena demuestran que esta se digiere rpidamente y DIPEL, el producto microbiano comercial, tambin contiene varios fragmentos. Los resultados de la transferencia Western en protenas tratadas con tripsina muestran la presencia de bandas equivalentes a la del ncleo de la protena de 63 kDa en ambas muestras. El tamao y la actividad del ncleo resistente a la tripsina del producto proteico en el maz MON 810 equivalen a los del ncleo resistente a la tripsina de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki del maz 754-10-1. En un estudio ms reciente que el efectuado con el maz 754-10-1, se estableci la equivalencia directa entre las protenas bacterianas y las producidas en el maz MON 810 con la transferencia Western. La tcnica, que se diseo especficamente para protenas Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki, fue de mayor sensibilidad y permiti comparar los pesos moleculares aparentes de protenas con reactivad inmunolgica cruzada en mezclas complejas". El ncleo de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 resistente a la tripsina se obtuvo de extractos foliares de varios maces resistentes a los insectos y de maces control que se digirieron con tripsina. Luego estos ncleos se compararon con el ncleo de la protena resistente a la tripsina de 63 kDa de E.coli y con la protena del maz de referencia MON 801. En el estudio se incluyeron los maces MON 810 y su homlogo el MON 818 La transferencia Western (Figura 6) muestra que tanto el maz MON 810 como el material de referencia bacteriano contienen una banda prominente en el mismo peso molecular para el. Tambin se constat la presencia de bandas ms pequeas que se presume pertenecen a otros fragmentos de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1. En todos los extractos (tanto de maces control como de los resistentes a los insectos) se observ una banda de 20 kDa que se cree que representa reactividad cruzada no especfica secundaria, sin relacin con la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1. Los resultados obtenidos indican claramente que la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 (es decir, el ncleo resistente a la tripsina) producida por E. coli es equivalente a la de los maces resistentes a los insectos la equivalencia determinada ... justifica la utilizacin de la informacin de inocuidad obtenida a partir de la protena producida por E. coli (lote #I92017) para probar la inocuidad de la expresada en los nuevos maces resistentes a los insectos."

Expresin El grado de expresin de las protenas CryIA(b), la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, la glifosato oxidoreductasa y la neomicina fosfotranferasa tipo II se determin en muestras de especmenes de maz resistente a los insectos (MON 810) y del control (MON 818) plantados en campos experimentales en los Estados Unidos. Los maces control (MON 818 y MON 819) no son maces genticamente modificados pero provienen de una familia gentica representativa de las sustancias en estudio. El maz MON 818 es el homlogo del MON 810. Las muestras de tejido foliar y del grano se recolectaron en seis campos experimentales distribuidos en la zona de los Estados Unidos donde se planta maz y constituyen una muestra representativa de las condiciones en las cuales los maces resistentes a los insectos se pudieran plantar comercialmente (dos en Illinois, dos en Iowa, uno en Indiana y uno en Nebraska). Las muestras de polen y de la planta entera se recolectaron una vez en un slo campo experimental (en Illinois). Las muestras de tejido foliar de todo el ciclo (recolectadas cada dos semanas) tambin se recolectaron del mismo campo experimental ubicado en Illinois. Los contenidos de las protenas Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD1, 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y glifosato oxidoreductasa de todas las muestras excepto las de polen, se midieron con ensayos ELISA validados especficos para cada protena. En las muestras de polen, los contenidos de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki se midieron con un ensayo ELISA, y los de 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y de glifosato oxidoreductasa con una transferencia Western. En los tejidos foliares, de la semilla, de polen y de toda la planta los grados de expresin del gen cryIA(b) son bajos (Cuadro 5). Las protenas 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, glifosato oxidoreductasa y neomicina fosfotranferasa tipo II no se detectaron. El promedio de la expresin de protenas de los seis sitios es 9,35 g/g (peso hmedo) en tejido foliar y 0,31 g/g (peso hmedo) en semillas. En un sitio la expresin de protenas es 4,15 g/g (peso hmedo) en toda la planta y de 0,09 g/g (peso hmedo) en polen, valores obtenidos de una nica muestra. Los rangos de expresin de protenas son entre 7,93 y 10,34 g/g (peso hmedo) en tejido foliar, entre 0,19 y 0,39 g/g (peso hmedo) en el grano y entre 3,65 y 4,65 g/g (peso hmedo) en toda la planta. Las mediciones de los contenidos de Cry1A(b) en el tejido foliar recolectado a lo largo de todo el ciclo muestran que a medida que la planta crece, la expresin de la protena disminuye. Segn sostiene la empresa, no se espera observar especificidad del tejido ya que el gen cryIA(b) est controlado por un promotor del virus del mosaico de la coliflor. Este promotor es constitutivo y no est restringido por tejidos ni por el desarrollo y por lo tanto no se prev que se exprese especficamente en ciertos tejidos en particular, aunque el promotor del virus del mosaico de la coliflor puede ser ms o menos activo segn el tipo celular, como se constata con la distribucin de las protenas CryIA(b) en los distintos tejidos. No se esperaba encontrar y no se encontr especificidad o inducibilidad segn el estadio de desarrollo, debido a que el promotor del virus del mosaico de la coliflor es un promotor constitutivo y no uno inducible. Cuadro 5. Grado de expresin de las protenas en tejidos del maz MON 8101. Tejido Media Desviacin estndar Rango

Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1

Tejido Hoja Tejido foliar de todo el ciclo2 Polen Toda la planta3 Grano

Media 9,35 9,78, 8,43, 4,91 0,09 4,15 0,31

Desviacin estndar 1,03

Rango 7,93-10,34

0,71 0,09

3,65-4,65 0,19-0,39

5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 Hoja, tejido foliar de todo el ciclo, toda la planta, grano Sin medir -

Glifosato oxidoreductasa Hoja, tejido foliar de Sin medir todo el ciclo, toda la planta, grano 1 Expresados en g/g (peso hmedo), salvo que se indique lo contrario. La media, la desviacin estndar y el rango se calcularon con los seis sitios del muestreo, salvo que se indique lo contrario. Consultar las otras notas para aquellas muestras que se recolectaron en un solo sitio. 2 Medias de las tres recolecciones de muestras independientes efectuadas con intervalos de dos semanas entre una y otra. 3 La media y la desviacin estndar se calcularon de un solo sitio. Los resultados del Western blot de muestras de polen (Figura 12) prueban que el gen que codifica la glifosato oxidoreductasa no se expresa en el maz MON 810 (faja 11). En la evaluacin de alimentos genticamente modificados, la expresin en la parte del vegetal que se consume, el grano en el caso del maz, es lo ms importante. El grado de expresin de la nueva protena en el grano de maz es entre 0,19 y 0,39 g/g peso hmedo. En el maz MON 801, uno de los maces empleados en esta prueba, se estudio el grado de expresin de la neomicina fosfotranferasa tipo II codificada por el gen correspondiente que est controlado por el promotor bacteriano especfico. El promotor no se encuentra activo y por lo tanto en la clula vegetal el gen no expresa la protena. Compuestos resultantes de la protelisis y metabolismo En los vegetales la protelisis de la CryIA(b) no produce compuestos especficos. El pH bsico del estmago del insecto solubiliza la protena y las proteasas la cortan. Uno de los productos resultantes de la accin de las proteasas es la endotoxina activa ... En las clulas vegetales que expresan el gen cryIA(b), la transferencia Western de las protenas de Bacillus thuringiensis generalmente revela la presencia de varios polipptidos. Estos son productos de la protelisis que se liberan como resultado de la accin de las proteasas tanto in planta como durante la extraccin."

Estabilidad del inserto La eficacia del maz MON 810 se mantiene durante varias generaciones incluso luego de haber efectuado cruzamientos con otros genotipos. La caracterizacin molecular del maz MON 810 se efectu luego de la tercera generacin de autofecundacin y por lo tanto el nico inserto est integrado de forma estable. El estudio de la segregacin (Cuadro 6) indica que hay un nico inserto activo del gen cryIA(b) regido por los principios mendelianos. Cuadro 6. Segregacin en la progenie del maz MON 810. Generacin Descripcin Real Esperada Chi cuadra do 0,044* 1,786*

BC0F11 BC1F12

Progenie de R0 x una lnea endogmica. Progenie de BC0F1 x la misma lnea endogmica utilizada en el cruzamiento de la R0.

44:47 10:4

45,5:45,5 7:7

Progenie Progenie de BC0F2 x un maz no 69:181:77 81,75:163,5:81,75 4,138# BC1F2 3 transgnico probado. 1 Expresado como el nmero de plantas que expresan la caracterstica: nmero de plantas que no expresan segn el ensayo de alimentacin de Ostrinia nubilalis. 1 Expresado como el nmero de plantas que expresan la caracterstica: nmero de plantas que no expresan segn el ensayo ELISA de CryIA(b). 3 Expresado como nmero de filas de la mazorca con nmero homocigtico de plantas que expresan la caracterstica: nmero de filas de la mazorca en plantas que segregan: nmero de filas de la mazorca en plantas que pueden ser homocigticas segn el ensayo de alimentacin con Ostrinia nubilalis. *Insignificante p=0,05 (2 = 3,94, 1 gl); # insignificante p=0,05 (2= 5,99, 2 gl). Se comprob que el gen cryIA(b) permanece estable durante siete generaciones de cruzamiento con un progenitor recurrente (B73) y durante seis generaciones de cruzamiento con un segundo progenitor endogmico sin relacin alguna (Mo17) (Cuadro 7.) Las distribuciones chi cuadrado de las retrocruzas con B73 y Mo17 obtenidas concuerdan con las esperadas. Cuadro 7. Estabilidad de la transferencia del gen segn la informacin de segregacin obtenida de derivados de retrocruzamiento entre MON 810 y dos lneas endogmicas sin relacin alguna (B73 y Mo17). Generacin1 BC6F1 (B73) Real 8:13 Esperada 10.5:10.5 2 0,762*

BC5F1 (Mo17) 11:11 11:11 0,045* 1 Expresado como el nmero de plantas que expresan la caracterstica: nmero de plantas que no la expresan segn el ensayo ELISA de CryIA(b). *Insignificante p=0,05 (2= 3,84, 1 gl).

Evaluacin de la posible toxicidad Introduccin La mayora de los estudios no se efectuaron con la protena producida por la planta sino con el ncleo resistente a la tripsina con propiedades insecticidas producido por E.coli. Las protenas producidas por E.coli que se probaron son idnticas del punto de vista qumico y funcional a las protenas producidas por la planta (ver apartado 4.1.1.). La caracterizacin de la protena CryIA(b) y los resultados de la degradacin metablica en jugos gstricos e intestinales simulados se utilizan para establecer algunos principios de inocuidad. Especificidad de la protena La protena CryIA(b) en su forma cristalina es insoluble en soluciones acuosas a pH neutro o cido. Sin embargo, se solubiliza en el medio bsico del estmago de las larvas donde las proteasas la activan. La protena activada penetra por difusin a travs de la membrana peritrfica del epitelio del intestino medio. Se une a receptores de superficie de alta afinidad causando cambios en los contenidos de electrolitos y en el pH que paralizan el estmago. El insecto deja de alimentarse y se muere. La superficie de las clulas intestinales de los mamferos no contiene receptores similares para las endotoxinas delta de las especies de Bacillus thuringiensis. Los mamferos, por lo tanto, no son susceptibles a estas protenas. Por otra parte, varios estudios de inocuidad de las protenas de Bacillus thuringiensis indican que no poseen efectos nocivos para el ser humano. Comparacin con bases de datos de toxinas La secuencia de aminocidos de la protena CryIA(b) se compar con la de las toxinas proteicas conocidas porque si hubiera alguna similitud se deben efectuar las pruebas toxicolgicas pertinentes a fin de estudiar el impacto potencial de la homologa. La secuencia de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 se compar con las secuencias de aminocidos de 2.632 toxinas que se encuentran almacenadas en bases de datos genticas pblicas (GenBank, EMBL, PIR y Swiss Prot). La protena es homloga a las protenas cristalinas con propiedades insecticidas de Bacillus thuringiensis, pero no se encontraron homologas de aminocidos con otras toxinas proteicas. La secuencia ms similar se encuentra en la Figura 14. Toxicidad por dosis nica administrada por va oral a ratas El estudio de toxicidad oral por dosis nica (de 7 das) se efectu con ratas de laboratorio a las que se administr la protena producida por E.coli (convertida al ncleo resistente a la tripsina) de pureza, potencia y estabilidad conocidas. La protena se administr con una sonda en dosis de 0, 400, 1.000 y 4.000 mg/kg. La dosis ms alta equivale al concepto de dosis mxima peligrosa segn las US Subdivision M Guidelines for biochemical pesticides (Guas para pesticidas bioqumicos de los Estados Unidos). Al grupo control se administr una dosis de 4.000 mg/kg de albmina srica bovina, un control proteico. No se observaron efectos nocivos relacionados con el tratamiento (Cuadro 8) y no se constataron diferencias estadsticas en peso corporal o en la ingesta de alimento. Tampoco se observaron patologas claras entre los distintos grupos. La concentracin letal media de la

protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 (truncada) en ratas es superior a 4.000 mg/kg con el nivel sin efectos (adversos) observados fijado en ese valor. Cuadro 8. Resultados del estudio de toxicidad por dosis nica de CryIA(b) administrada por va oral a ratas. Grupo Vehculo control (buffer) Control (albmina srica bovina 4.000*) 400 protena Bacillus thuringiensis 1.000 protena Bacillus thuringiensis 4.000 protena Bacillus thuringiensis [hembras] *mg/kg peso vivo Peso inicial (g) 31,1 [25,5] 31,1 [25,4] 31,1 [25,4] 31,0 [25,3] 31,0 [25,5] Peso final (g) 30,8 [25,1] 31,0 [24,7] 30,5 [25,2] 31,1 [25,0] 30,5 [25,5] Ingesta de alimento (media g/da) 5,3 [6,4] 6,2 [7,3] 5,3 [8,0] 5,3 [8,0] 5,5 [8,0/7,4]

Contaminantes txicos potenciales En respuesta a solicitudes de informacin sobre los posibles cambios en los contenidos de contaminantes provocados por la introduccin del gen cryIA(b), la empresa indica que no se detectaron aflatoxinas en el maz MON 810 del ensayo de campo de 1993 y por lo tanto el anlisis no se repiti. Las semillas de cereales no contienen 2,4-dihidroxi-7-metoxi-1,4-benzoxacin-3-ona, por lo tanto este compuesto no es un peligro para los consumidores de productos a base de cereales. Degradacin metablica en jugos gstricos e intestinales simulados En jugos digestivos simulados, la protena CryIA(b) purificada (Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 expresada en E. coli) se degrada rpidamente in vitro. La transferencia Western prueba que ms del 90% de la protena se degrada en dos minutos (Figura 15). Las fajas 6 a 11 son incubaciones de 0, 10, 20, 30, 60 y 120 segundos. La bioactividad de la protena se midi con un bionensayo en insectos. La protena se degrada rpidamente: entre el 74 y el 90% de la protena aadida se degrada en dos minutos (Cuadro 9), el menor intervalo de tiempo medido. En el estmago humano, aproximadamente el 50% de los slidos ingeridos pasan al intestino en dos horas y los lquidos en aproximadamente 25 minutos. En jugos intestinales simulados se comprob con el Western blot que luego de 19 horas y media la protena purificada Cry1A(b) no se degrada significativamente (Figura 16, las fajas 8 a 11: incubaciones de 0, 60 minutos, 4 horas y 19 horas y media). Los resultados obtenidos en el ensayo con insectos son similares (Cuadro 10). Estos resultados eran previsibles ya que el ncleo con tripsina de las protenas Bacillus thuringiensis con propiedades insecticidas es

relativamente resistente a las proteasas con serina como la tripsina, una de las proteasas clave del jugo intestinal. En los ensayos con insectos se emple Heliothis virescens (F.). Cuadro 9. Prdida de la actividad insecticida de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1en jugos gstricos simulados. Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 (G/nL) 0,75 7,5 75 Mortalidad de Heliothis virescens (F.) 0 2 minutos % de cambio

29 69 94

3 8 24

-90 -88 -74

Cuadro 10. Prdida de la actividad insecticida de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 en jugos intestinales simulados. Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 (G/nL) 0,75 7,5 75 Mortalidad de Heliothis virescens (F.) 0 19 horas y media % de cambio

26 76 100

25 61 90

-4 -20 -10

Evaluacin de la posible alergenicidad El ser humano consume diariamente grandes cantidades de protenas y las alergias son raras. Es necesario considerar si la fuente del gen que se introduce en la planta es alergnico. No se conocen alergias causadas por Bacillus thuringiensis. "En ms de 30 aos de utilizacin comercial del Bacillus thuringiensis no existen casos documentados de alergias y tampoco se conocen alergias asociadas a la elaboracin de productos elaborados a partir de l. Por otra parte, los alrgenos deben permanecer estables ante las condiciones cidas del sistema digestivo durante la digestin pptica y con tripsina, de lo contrario no pueden alcanzar y atravesar la mucosa intestinal y provocar una respuesta alrgica. Los estudios efectuados demuestran que la protena CryIA(b) no sobrevive a la digestin con jugos gstricos simulados. Otra caracterstica de las protenas alergnicas es que se presentan en altas concentraciones en los alimentos (por ejemplo los alrgenos en la leche, soja o cacahuetes). La concentracin de la protena CryIA(b) no es alta, el contenido en el grano de maz es entre 0,19 y 0,39 g/g peso fresco. La empresa sostiene que la comparacin de las secuencias de aminocidos con las de alrgenos y gliadinas conocidas sirve de primera aproximacin para evaluar la alergenicidad potencial o las posibles asociaciones con la enfermedad celaca. Se buscaron secuencias similares a las de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 en 219 secuencias de protenas asociadas con alergias y con la enfermedad celaca obtenidas de las

bases de datos genticas (GenBank, EMBL, PIR y Swiss Prot). La mayora . de los alrgenos alimentarios se han estudiado y se ha construido el mapa gentico de los eptopos de muchas protenas alrgenas que se unen a la IgE. El tamao ptimo para la unin de la cadena pptica es entre 8 y 12 aminocidos. Aparentemente los eptopos de las protenas alrgenas y los fragmentos pptidicos mediados por clulas T tienen por lo menos 8 aminocidos. Las secuencias de los eptopos se conservan con exactitud en alrgenos homlogos de especies muy dispares ... las secuencias importantes del punto de vista inmunolgico son, por definicin, de al menos 8 aminocidos contiguos idnticos. No se encontraron homologas significativas del punto de vista biolgico ni similitudes en las secuencias significativas del punto de vista inmunolgico. La Figura 17 contiene la secuencia ms similar encontrada. De acuerdo con los resultados obtenidos, la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 no contiene similitudes significativas con otras protenas alrgenas o gliadinas conocidas. En resumen, las bajas concentraciones de la protena en el maz, la labilidad digestiva y la falta de homologa con secuencias alergnicas conocidas, indican que la protena no posee propiedades alergnicas. Adems, se ha empleado como agente microbiano de control que no causa alergias durante varios aos. Por lo tanto no hay motivos para creer que la protena CryIA(b) pueda presentar riesgos de alergias significativos asociados al consumo de productos elaborados a partir de maz resistente a los insectos. Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional Introduccin La informacin nutricional es importante para determinar la exposicin diettica de los productos elaborados a base de maz. Si bien el ser humano consume poco maz en grano o maz elaborado directamente, consume alimentos elaborados a base de maz, por ejemplo, fcula o aceite de maz. Datos sobre la composicin La composicin se determin al mismo tiempo que el grado de expresin de la protena en el grano del maz, en muestras que se recolectaron el mismo da en los seis campos experimentales. A continuacin se enumeran los parmetros medidos en las muestras de granos de MON 810 y del control MON 818, los que se compararon con los valores citados en la literatura: Composicin aproximada (humedad, protenas, cenizas, grasas, fibra bruta)* Caloras Carbohidratos Almidn Perfil de cidos grasos*

Perfil de azcares Composicin de aminocidos* Tocoferoles* Acido ftico* Minerales (calcio, fsforo)* ver Cuadro 11.

Los parmetros marcados con un * se analizaron para la elaboracin de piensos, los otros parmetros (a menudo obtenidos a partir de clculos) habitualmente no se consideran. Los carbohidratos no se midieron sino que se dedujeron a partir de la siguiente frmula: % de carbohidratos = 100% - (% de protena + % de lpidos + % de cenizas + % de humedad). Las caloras tambin se calcularon utilizando la frmula aprobada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos: caloras (kcal/100g) = (4 * % de protenas) + (9 * % de lpidos) = (4 * % de carbohidratos). Cuadro 11. Composicin del grano del maz MON 810, del control (MON 818) y valores citados en la literatura. Componente MON 8101 Media (rango) 2 MON 818 Media (rango) 2 Valor citado en la literatura4 Media (rango) [rango MON 800/801]

Anlisis de la composicin aproximada Protenas3 Lpidos Cenizas3 Carbohidratos3 Caloras/100 g % de humedad 13,1 (12,7-13,6) 3,0 (2,6-3,3) 1,6 (1,5-1,7) 82,4 (81,8-82,9) 408,4 (407,0-410,1) 12,4 (11,0-14,4) 12,8 (11,7-13,6) 2,9 (2,6-3,2) 1,5 (1,5-1,6) 82,7 (81,7-83,8) 408,5 (406,0-410,1) 12,0 (10,6-14,2) 9,5 (6,0-12,0) 12,3 (9,7-16,1) [11,2-13,6] 4,3 (3,1-5,7), 4,6 (2,9-6,1) [3,8-4,2] 1,4 (1,1-3,9) [1,5-1,8] No se inform[80,8-83,0] No se inform[412,6-415,7] 16,0 (7-23) [13,0-15,8]

Composicin de aminocidos- esenciales del punto de vista de la nutricin5 Metionina Cistena Lisina Triptfano Treonina Isoleucina Histidina 1,7 (1,6-1,9) 2,0* (1,9-2,1) 2,8 (2,5-2,9) 0,6* (0,5-0,7) 3,9 (3,7-4,4) 3,7 (3,3-4,1) 3,1* (2,9-3,3) 1,7 (1,6-1,7) 1,9 (1,8-2,0) 2,8 (2,7-2,9) 0,6 (0,4-0,6) 3,8 (3,7-3,9) 3,8 (3,6-4,0) 2,9 (2,8-3,0) 1,0-2,1 [2,0-2,6] 1,2-1,6 [1,9-2,3] 2,0-3,8 [2,6-3,4] 0,5-1,2 [0,5-0,6] 2,9-3,9 [3,9-4,2] 2,6-4,0 [3,5-3,8] 2,0-2,8 [2,8-3,3]

Componente

MON 8101 Media (rango) 2 4,5 (4,1-4,9) 15,0 (14,1-16,7) 4,5 (4,2-4,7) 5,6* (5,2-5,6) 3,7 (3,4-4,0)
5

MON 818 Media (rango) 2 4,6 (4,3-4,8) 14,5 (13,8-15,0) 4,5 (4,2-4,7) 5,4 (5,2-5,6) 3,7 (3,5-3,8)

Valina Leucina Arginina Fenilalanina Glicina

Valor citado en la literatura4 Media (rango) [rango MON 800/801] 2,1-5,2 [4,2-4,8] 7,8-15,2 [13,6-14,5] 2,9-5,9 [4,1-5,0] 2,9-5,7 [5,2-5,6] 2,6-4,7 [3,4-4,2]

Aminocidos no esenciales Alanina Acido asprtico Acido glutmico Prolina Serina Tirosina Acidos grasos
6

8,2* (7,8-8,9) 7,1 (6,4-8,2) 21,9 (20,4-24,4) 9,9* (9,7-10,5) 5,5* (5,3-5,9) 4,4* (4,1-4,8)

7,8 (7,5-8,0) 6,6 (6,3-6,8) 21,1 (201,-21,6) 9,6 (9,4-9,8) 5,2 (5,1-5,4) 4,0 (3,9-4,1)

6,4-8,0 [7,8-8,2] 5,8-7,2 [6,7-7,3] 12,4-19,6 [19,9-21,4] 6,6-10,3 [9,0-9,4] 4,2-5,5 [5,5-6,1] 2,9-4,7 [3,8-4,3]

Palmtico (16:0) Esterico (18:0) Oleico (18:1) Linoleico (18:2) Linolenico (18:3)

10,5 (10,2-11,1) 1,9 (1,7-2,1) 23.2 (21,5-25,4) 62,6 (59,5-64,7) 0,8 (0,7-0,9)

10,5 (10,2-10,7) 1,8 (1,8-1,9) 22,8 (21,6-23,9) 63,0 (61,8-64,6) 0,9 (0,8-0,9)

7-19 [10,2-10,9] 1-3 [1,6-3,1] 20-46 [21,2-25,9] 35-70 [58,9-65,0] 0,8-2 [0,9-1,1]

Fibra y carbohidratos7 Almidn % % de fibra cruda Azcares - Fructosa - Glucosa - Sacarosa % de cido ftico Tocoferoles (mg/kg) alfa beta gama 10,4 (9,7-11,3) 8,5* (8,1-9,2) 20,2 (15,3-24,8) 10,9 (9,9-12,1) 7,5 (7,0-7,9) 21,6 (18,8-27,8) 3,0-12,1 [7,3-12,3] [7,9-10,7] [21,7-42,5]
8

67,6 (65,3-69,7) 2,6* (2,5-2,8) 0,32 (0,23-0,35) 0,44 (0,34-0,47)* 0,93 (0,79-1,12) 0,86 (0,81-0,91)

66,9 (64,6-69,0) 2,4 (2,3-2,5) 0,27 (0,22-0,40) 0,93 (0,79-1,12) 0,93 (0,68-1,11) 0,84 (0,79-0,91)

64-78,0 [63,7-71,5] 2,0-5,5 [1,98-2,61] [0,47-0,96] [0,47-1,03] [0,40-0,94] 0,7-1,0 [0,45-0,57]

Compuestos inorgnicos7 % de calcio % de fsforo 0,0036* (0,00330,0039) 0,358 (0,334-0,377) 0,0033 (0,00290,0037) 0,348 (0,327-0,363) 0,01-0,1 [0,003-0,004] 0,26-0,75 [0,311-0,368]

* estadsticamente diferentes a los valores de MON 818. Medias de las seis muestras tomadas en los seis sitios. Los rangos representan los valores mximos y mnimos de los sitios. 3 Porcentaje del peso seco de la muestra. 4 Cada valor indicado corresponde a una fuente publicada. 5 Porcentaje del total de protenas. 6 Porcentaje del total de lpidos. Los valores de otros cidos grasos son inferiores al lmite de deteccin del ensayo. 7 En base al peso seco. 8 Expresados en g/100g. Tambin se midieron los contenidos de lactosa, galactosa y maltosa pero los valores obtenidos eran inferiores al lmite de deteccin.
2

Las protenas, los lpidos, las cenizas, los carbohidratos, las caloras y la humedad del maz resistente a los insectos y del control no presentaron diferencias significativas y todos los valores se situaron en los rangos citados en las publicaciones cientficas. Los contenidos de los ocho aminocidos detectados en el maz MON 810 (cistina, triptfano, histidina, fenilalanina, alanina, prolina, serina y tirosina) son estadsticamente diferentes a los valores del control. Los valores promedio de seis de ellos (todos excepto cistina e histidina) se encuentran dentro de los rangos citados en la literatura. Los valores de cistina e histidina en ambos maces son estadsticamente superiores a los rangos citados en la literatura, pero dentro del rango de valores (1,9-2,3%) de dos maces similares (MON 800 y 801). El valor de histidina en el maz MON 810 (3,1%) se encuentra dentro del rango de valores de otro estudio realizado con anterioridad en el cual se compararon dos maces con gentica similar. Con referencia a los cidos grasos y carbohidratos medidos (almidn, fructosa, glucosa, sacarosa y cido ftico) no se observaron diferencias significativas entre los maces resistentes a los insectos y el control. El contenido de fibra bruta medido en el grano del maz MON 810 (2,6%) es estadsticamente diferente al de MON 818, pero ambos valores se sitan dentro del rango citado en la literatura (2,0-5,5%). El aceite de maz contiene naturalmente tocoferoles que tienen la potencia de la vitamina E. El tocoferol gama es diez veces menos activo que el alfa por lo cual no se lo considera un componente importante del grano de maz. Los contenidos de tocoferoles alfa y gama del maz 810 son estadsticamente similares a los del control. Sin embargo, el contenido de tocoferol beta es estadsticamente diferente al del maz control (Cuadro 11). El cuanto a los minerales, el contenido de calcio en el maz MON 810 es estadsticamente superior al del MON 818 pero dentro de los rangos obtenidos para MON 800 y 801. No se encontraron diferencias estadsticamente significativas en los valores de fsforo. En conclusin, segn los resultados obtenidos la composicin de los maces resistentes a los insectos es similar a la del control utilizado, MON 818." Por otra parte, la empresa resumi las conclusiones del anlisis nutricional de la siguiente manera: los valores de la composicin nutricional estn comprendidos en el rango de valores de cada nutriente de los maces no modificados. Por consiguiente, se puede concluir que no parece haber un efecto significativo sobre los contenidos de nutrientes de la planta de maz. Se efectuaron asimismo varias medidas de fenotipo pero no se observ que este fuera afectado. Con respecto a las vitaminas y minerales estudiados, no se observaron diferencias

en la prctica. En trminos de la composicin nutricional el maz MON 810 se puede considerar sustancialmente equivalente al maz comn."

Estudio de caso 2: Evaluacin de la inocuidad de la soja genticamente modificada de alto contenido en cido oleico

Indice

Estudio de caso 2: Evaluacin de la inocuidad de la soja genticamente modificada de alto contenido en cido olico 28 (en ingls) Error! Bookmark not defined. Prefacio 30 Nota 30 Descripcin de la planta de ADN recombinante 30 Descripcin de la planta hospedadora y su uso como alimento 31 Descripcin de la modificacin gentica 32 Mtodos empleados para introducir la modificacin gentica .............................. 32 Genes nuevos ...................................................................................................... 32 Construccin gnica ............................................................................................ 34 Caracterizacin de la modificacin gentica 36 Seleccin de las plantas ....................................................................................... 36 Caracterizacin molecular del ADN insertado en las sojas G94-1, G94-19 y G168 ............................................................................................................................ 39 Resmen del locus A ........................................................................................... 45 Estabilidad de las modificaciones genticas ......................................................... 46 Conclusin .......................................................................................................... 46 Genes de resistencia a los antibiticos ................................................................. 47 Caracterizacin de la nueva protena.................................................................... 48 Funcin bioqumica y fenotipo ........................................................................ 48 Anlisis de expresin de las protenas .............................................................. 49 Evaluacin de la posible toxicidad 52 Evaluacin de la posible alergenicidad 54 Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional55 Estudios de campo y datos................................................................................... 55 Nutrientes esenciales ........................................................................................... 56 Resmen del anlisis de la composicin .............................................................. 62 Protenas alergnicas endgenas .......................................................................... 63 Reactividad radioalergosorbente ...................................................................... 63 Conclusin ...................................................................................................... 64 Consecuencias en la nutricin.............................................................................. 64 Estudios de alimentacin en animales .............................................................. 65 Consecuencias en la nutricin del ser humano ..................................................... 67 Conclusiones 70 Referencias 73 Apndices: Documentos pertinentes del Codex Error! Bookmark not defined.

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Prefacio

En Australia y Nueva Zelandia la venta de alimentos obtenidos a partir de las sojas de alto contenido en cido oleico G94-1, G94-19 y G168 (Expediente A387) se aprob luego de evaluar exhaustivamente su inocuidad en noviembre del ao 2000. El cometido del Organismo de Normas Alimentarias de Australia y Nueva Zelandia (Food Standards Australia and New Zealand, FSANZ) es evaluar la inocuidad de este tipo de alimentos segn los principios internacionales aceptados para determinar la inocuidad de alimentos obtenidos a partir de plantas genticamente modificadas. Las conclusiones de la evaluacin de inocuidad efectuada por el Organismo de Normas Alimentarias de Australia y Nueva Zelandia se publicaron en el Informe Final de Riesgo, Expediente A387, Alimentos obtenidos a partir de sojas de alto contenido en cido oleico G94-1, G94-19 y G168 (Final Risk Analysis Report: Application A387 - Food derived from high oleic soybean lines G94-1, G94-19, and G168). Ciertas partes de la solicitud de aprobacin de las sojas de alto contenido en cido oleico que se present ante el Organismo de Normas Alimentarias de Australia y Nueva Zelandia se resumieron con el fin de utilizar el estudio de caso como herramienta de capacitacin.
Nota

A fin de facilitar la presentacin del estudio de caso como herramienta de capacitacin hemos hecho uso de ciertas licencias con respecto a la informacin proporcionada en las solicitudes originales. Ciertas partes se han condensado en resmenes y la informacin presentada es solo una parte de la solicitud original. El estudio de caso no constituye de ninguna manera una solicitud completa y tampoco debe considerrselo como una evaluacin de inocuidad exhaustiva. La utilizacin de la informacin presentada como herramienta de capacitacin no refleja necesariamente su aprobacin ni tampoco la del producto. Tampoco implica juicio alguno con respecto a las solicitudes originales.
Descripcin de la planta de ADN recombinante

El objetivo original de Optimum Quality Grains LLC (una empresa conjunta entre DuPont y Pioneer Hi-Bred International Inc.) fue introducir en la soja dos caractersticas: (a) aumentar el contenido de lisina en la harina y (b) aumentar el contenido de cido oleico, un cido graso monoinsaturado, en el aceite. Sin embargo, durante los estudios, la empresa resolvi no continuar investigando los procedimientos para aumentar la cantidad de lisina. La nueva soja ha sido modificada genticamente con el fin de aumentar el contenido de cido oleico y se denomina soja de alto contenido en cido oleico. El contenido de cido oleico se aument insertando en una variedad de soja comercial de alto rendimiento una segunda copia del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos (GmFad 2-1), que sintetiza el cido linoleico, el cido graso poliinsaturado ms
importante del aceite de soja. La presencia de la segunda copia de este gen causa el

30

"silenciamiento gnico", es decir que no se expresa ninguna de las dos copias del gen. En consecuencia, en el poroto de la soja en desarrollo no se sintetiza el cido linoleico y por lo tanto se acumula el cido oleico. A continuacin se describe la ruta de sntesis de los cidos grasos de cadena larga en los vegetales.

Palmitic acid (C16)


elongation

desaturation

elongation

Stearic acid (C18)


desaturation

Palmitoleic (C169)

Longer chain saturated fatty acids

Oleic acid (C189)


GmFad 2-1 gene

Linoleic acid (C189,12)


GmFad 3 gene

Linolenic acid (C189,12,15)

(adapted from Lehninger 1982)

El aceite de soja es poco estable del punto de vista de la oxidacin ya que contiene gran cantidad de cidos grasos poliinsaturados (por ejemplo, de cido linoleico). El aceite de soja de alto contenido en cido oleico se considera mejor que el aceite de soja convencional debido a que contiene menos cidos grasos poliinsaturados inestables del punto de vista de la oxidacin. El aceite de soja de alto contenido en cido oleico se puede usar para elaborar alimentos, incluso para frer, sin que sea necesario someterlo a hidrogenacin qumica o elaborarlo de otra manera. Tambin se cree que las propiedades nutritivas del aceite de soja de alto contenido en cido oleico son mejores que las del aceite de soja convencional o parcialmente hidrogenado debido al mayor contenido de cidos grasos monoinsaturados. La industria alimentaria y los servicios conexos utilizan el aceite de soja obtenido a partir de sojas de alto contenido de cido oleico principalmente para frer y rociar panes y otros productos horneados y este podra sustituir otros aceites y grasas termoestables, por ejemplo, las mezclas de aceites de palma y otros aceites vegetales o los aceites de colza y de soja hidrogenados.
Descripcin de la planta hospedadora y su uso como alimento

La soja (Glycine max) se planta comercialmente en ms de 35 pases del mundo y tiene una larga trayectoria de uso inocuo en alimentos para consumo humano y en piensos. Los principales pases productores de soja son los Estados Unidos, Argentina, Brasil y China, cuya produccin representa el 90% de la produccin mundial. Los tres productos ms importantes de la soja son la harina, el aceite y el poroto (la semilla). Su utilizacin en piensos es escasa, y la soja sin elaborar no se usa como 31

alimento debido a que contiene sustancias txicas y antinutrientes, por ejemplo, lectinas e inhibidores de la tripsina que la hacen inadecuada para el consumo humano. Estos compuestos se inactivan mediante tratamientos con calor adecuados. El poroto de soja entero se utiliza tostado u horneado o para producir brotes de soja. La cscara del poroto se elabora para obtener harina de soja sin desgrasar y productos tradicionales a base de soja, por ejemplo miso, cuajada (tofu), leche y salsa de soja. Los porotos de soja se clasifican, se limpian, se secan y se descascaran antes de elaborarlos. La cscara se puede elaborar para obtener aditivos de fibras para panes, copos o aperitivos y tambin para piensos. El poroto descascarado se lamina en copos sin desgrasar que se usan en piensos o pueden continuar elaborndose para obtener harina sin desgrasar. El aceite de soja crudo se extrae sumergiendo los copos en un disolvente. Se separa la lecitina cruda y el aceite se contina refinando para obtener aceite de cocina, margarina y grasas de repostera. Luego de extraer el aceite de los copos, se retira el disolvente y los copos se secan para utilizarlos en la produccin de harina, concentrados y protenas aisladas de soja. Los copos desgrasados tambin se utilizan en piensos. Las cervezas, los fideos, los panes, las harinas, las tripas comestibles, la pastelera, las galletas finas y crujientes, los dulces y los sucedneos de la leche y de carnes, entre otros son algunos de los productos terminados que contienen soja. El cultivar lite A2396 se utiliz como planta hospedadora. Esta es una soja temprana del grupo II de maduracin, de alto rendimiento, de Asgrow Seed Company, con 40% de protena y 22% de aceite en peso seco, al igual que otras sojas.
Descripcin de la modificacin gentica

Mtodos empleados para introducir la modificacin gentica El plsmido de ADN con los genes de inters se introdujo en el tejido meristemtico de la soja A2396 por transformacin biolstica o bombardeo con micropartculas. Las clulas con el ADN introducido se incubaron en un medio de cultivo que promueve la formacin de callos. La seleccin de las clulas que efectivamente incorporaron el ADN insertado se efectu con una protena marcadora fluorescente, codificada por un gen especfico (GUS) que se introdujo para tales fines. Genes nuevos Gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. En la soja hay dos genes que codifican insaturasas de los cidos grasos, en la semilla en desarrollo solo se expresa uno de ellos (GmFad 2-1) (Heppard et al., 1996), cuyo grado de expresin aumenta cuando el aceite comienza a depositarse, es decir, aproximadamente 19 das despus de la floracin. Su producto gnico regula la sntesis de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite. En la semilla, en la hoja, en los tallos y en la raz el grado de expresin del otro gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos (GmFad 2-2) es

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constante y su producto gnico regula la sntesis de los cidos grasos poliinsaturados que se encuentran en todas las membranas celulares. En la soja la presencia de una segunda copia del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo provoca un fenmeno que se conoce como silenciamiento gnico, es decir, no se expresa ninguna de las dos copias del gen (ni la copia original de la soja ni la copia que se transfiri). Como ninguna de las dos copias se expresa, en la semilla en desarrollo no se sintetiza el cido linoleico y se acumula el cido oleico. En los vegetales, el silenciamiento gnico puede ocurrir durante la transcripcin o luego de ella. Se cree que el mecanismo bsico del silenciamiento durante la transcripcin es la metilacin de las secuencias de los promotores. Si bien los mecanismos an no se conocen, se cree que la metilacin de los promotores interrumpe la interaccin con los factores de transcripcin o que altera la estructura de la cromatina del ADN impidiendo la transcripcin (Wang y Waterhouse, 2001). El silenciamiento post transcripcin se denomin en un principio co supresin porque en los experimentos de transformacin de petunias con un transgn que codifica la sintetasa en el sentido de las benzalacetofenonas, no se expres ni el transgn ni el gen endgeno correspondiente. En el silenciamiento post transcripcin no se acumula ARNm en el citoplasma y por lo tanto no se generan los productos de la expresin. En la actualidad se sabe que en los vegetales el ARN de cadena doble puede causar el silenciamiento post transcripcin mediante un proceso que degrada el ADN especfico de una secuencia (Voinnet, 2002). Gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico (Gen dapA) El gen codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico codifica la enzima que cataliza el primer paso de la ruta metablica de sntesis de la lisina, uno de los aminocidos esenciales (Brock et al., 1984). En los vegetales la lisina inhibe la sintetasa del cido dihidrodipicolnico. El gen que se transfiri a la soja proviene de Corynebacterium y codifica una forma de sintetasa del cido dihidrodipicolnico que no se inhibe con la lisina. Otros ensayos han demostrado que el gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico que no se inhibe con la lisina de Corynebacterium, provoca que se acumule 100 veces ms lisina libre en la semilla duplicando su contenido total de lisina (Falco et al., 1995). El gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo se insert en la soja con el fin de reducir el contenido de cidos grasos poliinsaturados en el aceite silenciando el gen correspondiente (antes descrito). El gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico de Corynebacterium que no se inhibe con la lisina se insert con el fin de aumentar el contenido de lisina en la harina. Gen que codifica el marcador visual (Gen uidA) Adems de los genes descritos, la soja tambin contiene un gen de Escherichia coli (Jefferson et al., 1985) que sirve de marcador visual. Este gen codifica una protena,

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la enzima -glucuronidasa, que se emplea para catalizar una reaccin colorimtrica que tie de azul los tejidos vegetales modificados. Construccin gnica La transformacin se efectu con dos plsmidos circulares pBS43 y pML102 que contienen los tres casetes de expresin gnicos, uno por cada gen de interes, uno con el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo, uno con el gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico, y otro con el gen que codifica el marcador visual. En ambos plsmidos tambin se insert el gen marcador de resistencia a los antibiticos (bla). Los dos plsmidos con los genes nuevos marcados en negro se esquematizaron de forma lineal en la Figura 1.
pBS43 (10303 base pairs):

GmFad 2-1 conglycinin promoter 3 phaseolin terminator

35S promoter uidA

3 NOS

bla

pML102 (6247 base pairs):

KTi3 promoter ssuCTP: dapA

KTi3 ter minator

bla

Cuadro 1: Descripcin de los casetes de expresin gnica en los plsmidos pBS43 y pML102. Casete
Casete de expresin del gen

Elemento gentico
Promotor de la conglicinina

Fuente
Subunidad 1 de la -conglicinina, protena de almacenamiento del poroto (Barker et al. 1988). Secuencia codificadora de la protena insaturasa -12 del cido graso de la soja (Okuley et al. 1994, Heppard et al. 1996).

Funcin
Promotor especfico de la semilla que permite un alto grado de expresin durante el desarrollo de esta. Enzima endgena que agrega un segundo doble enlace al cido oleico convirtindolo en cido linoleico.

que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo
(GmFad 2-1) (pBS43)

Regin de codificacin

Gm Fad 2-1
Terminador 3 de la faseolina

Regin terminadora 3 de la faseolina, protena de almacenamiento de Phaseolis vulgaris (Doyle et al. 1986).

Contiene las seales para finalizar la transcripcin y gobierna la poliadenilacin.

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Casete de expresin del gen

Promotor 35S

Promotor derivado del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al.


1985). Lder 5 no traducido del promotor de la protena que se une a la clorofila fotosinttica a/b 22L (Cab22L) de Petunia hybrida var. Mitchell (Harpster et al. 1988). Secuencia que codifica la protena de la enzima - glucuronidasa (gen uidA) de Escherichia coli (Jefferson et al. 1985).

que codifica la protena marcadora fluorescente


(GUS ) (pBS43)

Promotor del alto grado de expresin de genes constitutivos en tejidos vegetales.

Lder no traducido de Cab 22L

Secuencia lder no traducida que ayuda a estabilizar al ARNm y a mejorar la traduccin.

Regin de codificacin del gen que codifica el marcador visual (uidA)

Marcador colorimtrico que se utiliza para seleccionar las plantas transformadas.

NOS 3'

Regin 3 del terminador del gen de la nopalina sintetasa del plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al. 1982, Bevan et al. 1983). Promotor del gen que codifica el inhibidor de la tripsina 3 de Kunitz en la soja (Jofuki y Goldberg 1989).

Contiene las seales para finalizar la transcripcin y gobierna la poliadenilacin.

Casete de expresin del gen

Promotor Kti3

que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolni co (dapA)


(pML102) ssu CTP

Promotor especfico de la semilla que durante el desarrollo de esta permite un alto grado de expresin del gen.

Secuencia del terminal N del pptido de transito al cloroplasto de la subunidad rubisco de la soja (Berry-Lowe et al. 1982). Secuencia codificadora del gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico (dapA) de Corynebacterium que no se inhibe con la lisina (Bonnassie et al. 1990, Yeh et al. 1988).

Dirige la protena al cloroplasto, organelo donde se efecta la biosntesis de la lisina.

Regin de codificacin del gen de la

Expresin de la enzima sintetasa del cido dihidrodipicolnico de Corynebacterium que desregula la ruta de biosntesis de la lisina causando la acumulacin de lisina libre (Falco et al. 1995).

sintetasa del cido dihidrodipicolni co (dapA)


Terminador 3 del gen que codifica el inhibidor de la tripsina 3 de Kunitz en la soja (Kti3)

Regin terminadora 3 del gen que codifica el inhibidor de la tripsina 3 de Kunitz en la soja (Jofuki y Goldberg 1989).

Contiene las seales para finalizar la transcripcin y gobierna la poliadenilacin.

Otros elementos genticos Adems de los casetes descritos en el Cuadro 1, el plsmido de ADN contiene otros elementos, por ejemplo, un gen marcador de resistencia a los antibiticos.
Cuadro 2: Descripcin de otros elementos genticos transferidos a la soja de alto contenido en cido oleico. Cassette
lac

Elemento gentico

Fuente

Funcin
No se transfiri la secuencia completa de estos genes y en E.coli ya no se expresan.

Copia incompleta del opern lac que contiene un secuencia de codificacin parcial lacI, el promotor Plac, y una

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secuencia de codificacin parcial de la -Dgalactosidasa (lacZa). ori Origen de replicacin del gran nmero de copias del plsmido pUC19 de E. coli. Gen que codifica la enzima -lactamasa de E. coli. Bacterifago f1 origen de la replicacin. Permite la replicacin de los plsmidos en E. coli.

bla

Confiere a E. coli resistencia a la ampicilina.

f1 ori

Origen de replicacin reconocido por el bacterifago f1 para producir ADN de una hebra. Si el fago f1 no est presente, no se reconoce el origen f1.

La mayora de los vectores de clonacin de E. coli contienen estos elementos genticos, descritos en detalle por Sambrook et al., 1981, que se utilizan para ayudar a manipular las secuencias de ADN y para dirigir la expresin gnica en E. coli.
Caracterizacin de la modificacin gentica

Seleccin de las plantas El mtodo empleado en la transformacin no siempre result en la transferencia de ambos plsmidos a la soja. Por este motivo, fue necesario evaluar gran cantidad de plantas transformadas para identificar aquellas que posean ambas caractersticas. En primer trmino se estudio la poblacin de plantas transformadas en busca de la actividad del gen que codifica la protena marcadora fluorescente que est ligado al gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. Se seleccionaron las plantas que mostraron la protena marcadora fluorescente y en este grupo de plantas se detect la presencia del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo con el ensayo de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Con esta primera seleccin se identific una planta (260-05) y se seleccionaron sus semillas (la generacin R1, es decir la F1 en organismos con ADN recombinante). Se analiz la composicin de cidos grasos y se determin el contenido de lisina. La poblacin de semillas R1 estudiada se puede dividir en cuatro grupos con distintos contenidos de cidos grasos y de lisina: 1. Semillas con contenido de cido oleico 80% y contenidos de lisina normales (G168); 2. Semillas con aproximadamente 72% de cido oleico y mayor contenido de lisina (G94); 3. Semillas con aproximadamente 4% de cido oleico y mayor contenido de lisina (G175); y 4. Semillas con contenidos de cido oleico y de lisina similares a los de la planta sin transformar A2396 (G90).

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El ADN del genoma de las semillas de estos cuatro grupos se analiz usando hibridacin Southern blot, tcnica que se utiliza para detectar con precisin secuencias especficas dentro de un fragmento de ADN que se separan con electroforesis en gel (Southern, 1975), para determinar el nmero de insertos de ADNt y el nmero de sitios de insercin (es decir, el nmero de loci) en el genoma de la soja. Tambin permite determinar en cierta medida si la secuencia de ADNt insertada se copi total (copias intactas o ntegras) o parcialmente. El ADN del genoma de las muestras de semillas se extrajo y se digiri con la enzima de restriccin BamHI. Luego se aadi una sonda de la regin 3 del terminador de la faseolina para detectar el casete de expresin del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. La enzima BamHI corta el plsmido pBS43 una vez y se espera obtener una banda de hibridacin para cada copia del plsmido insertado en el genoma.

Figura 1 Mapa del plsmido pBS43. Ubicacin de las sondas de hibridacin y los sitios de la enzima de restriccin utilizados en el anlisis de Southern blot del ADN de la soja de alto contenido en cido oleico.

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Figura 2. Southern blot del ADN aislado del tejido foliar de la R1 de la soja 260-05. Las plantas se obtuvieron a partir de trocitos de semillas cuya composicin de cidos grasos era conocida. El ADN del genoma se digiri con BamHI y se utiliz la sonda 3 faseolina para detectar la integracin del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo (GmFad 2-1).

En la Figura 2 se observan tres patrones de bandas. En la soja G168 se observan dos bandas de 14,0 Kb y 4,5 Kb, que indican la presencia de dos genes que codifican la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. La soja G175 presenta una sola banda de 12,0 kb. En la soja G94 se observa la presencia de los tres fragmentos de hibridacin. El patrn de hibridacin del ADN de la Figura 2 se interpreta de la siguiente manera. En la primera transformacin (260-05) el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo se integr al genoma de la soja en dos loci diferentes. La soja G168 contiene uno de los loci (denominado locus A) con dos genes que codifican la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo ligados, tal como lo indican los dos fragmentos de hibridacin de 14,0 kb y 4,5 kb. La soja G175 contiene un segundo locus (locus B) que cuenta con un solo gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. La soja G94 posee ambos loci y por lo tanto se observan los tres fragmentos de hibridacin. Solo las sojas G168 y G94 se continuaron estudiando ya que solo estas expresaron el alto contenido en cido oleico (el fenotipo deseado). La soja G94 se analiz con Southern blot y se confirm la presencia del gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico que determina un mayor contenido de lisina.

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La soja G94 posee ambos locus, el A y el B. Por este motivo fue necesario efectuar una segunda seleccin en funcin de las plantas de la R2 que segregaban con el fin de aislar aquellas que contenan el locus A y no el locus B. Los resultados del Southern blot del ADN del tejido foliar de la R2 obtenido a partir de una semilla de soja G94 de R2, permiti identificar dos subgrupos la soja G94-1 y la soja G94-19 que posean el locus A (Figura 3) pero no el locus B que se haba eliminado por segregacin. No se continu con la caracterizacin del locus B.

Figura 3. Southern blot del ADN de tejido foliar de las R1 y R2 de una semilla de soja G94 de la R1. El ADN del genoma se digiri con BamHI y se utiliz la sonda 3faseolina para detectar la integracin del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. La semilla G94 tiene tres fragmentos de ADN de distinto tamao que se hibridan con la sonda. Las sojas G94-1 y G94-19 tienen solo dos de 14,0 Kb y 4,5 Kb.

El locus A del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo se identific en las sojas G94-1, G9419 y G168 que se seleccionaron por ser sojas de alto contenido en cido oleico para continuar estudindolas. Solo estas tres sojas se incluyeron en la solicitud para obtener la aprobacin de su uso como alimento y ninguna de las tres expresan la caracterstica de alto contenido de lisina. Caracterizacin molecular del ADN insertado en las sojas G94-1, G94-19 y G168 La caracterizacin del ADN insertado en las sojas G94-1, G94-19 y G168 se efectu por Southern blot con seis sondas de hibridacin basadas en los fragmentos genticos de los plsmidos pBS43 (Figura 1) y de pML102 (Figura 4). Las sondas utilizadas fueron el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo (GmFad 2-1), la 3faseolina, el gen que codifica la protena marcadora fluorescente, el promotor derivado del virus del 39

mosaico de la coliflor, Amp y el gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico. El ADN del genoma se aisl del tejido foliar de dos plantas de la R6 de cada una de las sojas G94, G94 -19 y G168 y de la soja control A2396. A fin de caracterizar las inserciones de ADN en profundidad se lo digiri con seis enzimas de restriccin diferentes. En las Figuras 5a y 5b se encuentran los resultados obtenidos con Southern blot. En el Cuadro 3 se indican los tamaos esperados de los fragmentos de ADN obtenidos con cada digestin, suponiendo que se insert una copia ntegra del plsmido pBS43 en el genoma. A fin de poder efectuar comparaciones, en el mismo cuadro se incluyen adems los tamaos de los fragmentos obtenidos con Southern blot. El mapa del ADN insertado en la soja se dedujo a partir de los resultados obtenidos con Southern blot (Figuras 6a y 6b). La caracterizacin de la generacin R6 indica que un gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico truncado se integr a otros locus del genoma de los dos grupos de sojas G94 y de la soja G168 (locus C). No se incluyen los resultados obtenidos con Southern blot de este gen truncado.

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Figura 4. Mapa del plsmido pML102. Se indica la ubicacin de las sondas de hibridacin y los sitios de la enzima de restriccin utilizados en el anlisis de la soja de alto contenido en cido oleico analizada con Southern blot.

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Figura 5a. Southern blot del ADN aislado del tejido foliar de plantas de la R6 de la soja G168 de alto contenido en cido oleico y de la soja control A2396. La digestin del ADN se efectu con las enzimas mencionadas y la hibridacin se efectu con la sonda del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. Los pesos moleculares subrayados indican los tamaos del transgn de hibridacin para cada producto de la digestin y los asteriscos las bandas de hibridacin endgenas del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo.

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Figura 5b. Southern blot del ADN aislado del tejido foliar de plantas de la R6 de la soja G94 -1 de alto contenido en cido oleico y de la soja control A2396. El ADN del genoma se hibrid con la sonda del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo (GmFad 2-1). Cuadro 3. Tamaos de los fragmentos (en kb) que se espera obtener si toda la secuencia del plsmido pBS43 se inserta en el genoma, calculados segn la secuencia del plsmido. Enzima de restriccin GmFad 2-1
3faseolina

Sonda de hibridacin gen que codifica la protena marcadora fluorescente


7.0 Resto 5,25 2,7 9,1 Resto

promotor derivado del virus del mosaico de la coliflor


7.0 Resto 5,25 2,5 9,1 Resto

amp

HindIII BamHI BspHI SstI XbaI XhoI

3.3 Resto 5,25 5,1 9,1 Resto

3.3 Resto 5,25 2,5 1,2 Resto

7.0 Resto 1,0 5,1 9,1 Resto

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Cuadro 4. Tamaos de los fragmentos obtenidos (kb)1: tamao de cada fragmento de ADN con Southern blot que se hibrid con cada una de las sondas durante la digestin del ADN del genoma de la soja de alto contenido en cido oleico con las enzimas de restriccin listadas. Enzima de restriccin Sonda de hibridacin
GmFad 2-1 3faseolina gen que codifica la protena marcadora fluorescente 6,5 promotor derivado del virus del mosaico de la coliflor 6,5 amp

HindIII

3,32

3,3

BamHI

14,0 4,5 5,25 5,0

14,0 4,5 5,25 5,0 2,5 1,5

6,5

6,5

BspHI SstI XbaI

14,0 5,0

5,25 5,0 2,7 1,7 6,7

5,25 5,0 2,5 6,7

6,5 4,2 3,3 14 6,5 2,8 1,4 1,0

XhoI 4,4 1 El sistema de gel presenta ciertas limitaciones cuando se trata de separar fragmentos de gran tamao. Por este motivo, los fragmentos de hibridacin de ms de 10 kb deben considerarse como tamaos aproximados. 2 Los tamaos en negritas y subrayados indican que la digestin con la enzima correspondiente produce dos copias del fragmento. Estos fragmentos pueden emitir seales de hibridacin ms poderosas.

En las Figuras 6a y 6b se presenta un diagrama esquemtico del inserto del locus A en la soja de alto contenido en cido oleico. La parte superior del diagrama contiene los elementos genticos insertados de los plsmidos y su orientacin. La parte inferior muestra los fragmentos de hibridacin para cada enzima de restriccin utilizada segn el Cuadro 4. El ADN insertado est representado a escala mientras que los restos de ADN del genoma de la soja no lo estn.

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Figura 6a (superior) 6b (inferior): Diagrama esquemtico del inserto del locus A de la soja de alto contenido en cido oleico. La parte superior del diagrama contiene los elementos genticos insertados de los plsmidos y su orientacin. La parte inferior muestra los fragmentos de hibridacin para cada enzima de restriccin utilizada segn el Cuadro 3.4. El ADN insertado est representado a escala mientras que los restos de ADN del genoma de la soja no.

Resumen del locus A El mapa del locus A muestra que una copia ntegra del plsmido pBS43, que se abri en el gen que codifica la enzima -lactamasa, se insert en el genoma. Una segunda copia del plsmido pBS43, que se abri en el gen que codifica el marcador visual, se insert como una repeticin invertida con respecto a la primera copia. En el extremo 5del locus A, comenzando en el extremo de la unin del ADN del genoma de la soja hacia la primera copia del plsmido pBS43, se insert un fragmento del plsmido

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pML102 que solo contiene el vector con el gen que codifica la enzima -lactamasa. Por lo tanto, en el locus A se insertaron dos copias ntegras del casete de expresin del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo, una copia ntegra del casete de expresin del gen que codifica el marcador visual ms una copia truncada del mismo gen y por lo menos dos copias ntegras del gen que codifica la enzima -lactamasa y al menos una copia truncada. La ausencia del gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico funcional en el locus B en las sojas G94-1, G94-19, y G168 se confirm con una serie de transferencias Northern (para detectar la expresin del ARN), de Western blot (para detectar la expresin de protenas) y de perfiles de aminocidos. Sin embargo, otros Southern blot (cuyos resultados no se muestran) con una sonda del gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico, indican que un casete de expresin del gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico truncado se integr a otro locus del genoma (locus C). Este locus segrega de forma independiente del locus A. Los anlisis de Northern, Southern blot y los perfiles de aminocidos indican que el gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico truncado no es funcional. Estabilidad de las modificaciones genticas La diferencia entre las sojas G94-1, G94-19 y G168 y la soja progenitora A2396 radica en el perfil de cidos grasos que se modific de forma de obtener aceite que contiene entre 82 y 85% aproximadamente de cido oleico y por lo tanto bajo contenido de cido linoleico (< 1%) y linolnico (< 2.5%). Las normas establecen que el aceite de soja comestible contiene entre 19 y 30% de cido oleico (Codex Alimentarius 1989). La estabilidad gentica y fenotpica de las sojas se evalu con la transferencia Southern del ADN del genoma de varias generaciones de sojas de alto contenido en cido oleico homocigtico para el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo del locus A. La empresa afirma que las sojas G94-1, G94-19 y G168 se mantuvieron separadas durante seis generaciones y los resultados de la transferencia Southern de todas ellas mostraron patrones de bandas idnticos durante el perodo estudiado. Tambin se analiz el contenido de cido oleico de ocho generaciones y se comprob que el fenotipo de cidos grasos permaneci estable durante el perodo estudiado con un contenido de cido oleico promedio superior al 80%. Por otra parte, la empresa afirma que la caracterstica de alto contenido en cido oleico permanece estable en varias condiciones ambientales en comparacin con el progenitor lite y con una soja de alto contenido en cido oleico obtenida por mtodos de seleccin convencionales. Conclusin Los genes que codifican la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo en las tres sojas de alto contenido en

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cido oleico estudiadas estn integrados de forma estable. Adems, el genotipo y el fenotipo permanecen estables durante varias generaciones y en diversos ambientes. Genes de resistencia a los antibiticos Algunas plantas transgnicas contienen genes que confieren resistencia a los antibiticos que se utilizan como marcadores para seleccionar las clulas modificadas. La presencia de estos genes en el ADN de los alimentos per se no presenta problemas de inocuidad (OMS 1993). Sin embargo, se han manifestado inquietudes respecto a la posible transferencia horizontal de estos genes de los alimentos ingeridos a los microorganismos que se encuentran en el tracto digestivo del ser humano, lo que podra presentar problemas en el uso teraputico de antibiticos. En esta parte del estudio caso se evala el impacto sobre la salud humana que pudiera tener la transferencia de genes que confieren resistencia a los antibiticos procedentes de la soja de alto contenido en cido oleico a los microorganismos del tracto digestivo del ser humano. Los dos plsmidos utilizados para transformar la soja A2396, pBS43 y pML102, contienen una copia del gen que codifica la enzima -lactamasa controlado por un promotor bacteriano. Este gen confiere resistencia a varios antibiticos -lactmicos, por ejemplo, la penicilina y la ampicilina. La caracterizacin molecular de las sojas de alto contenido en cido oleico confirma la presencia de dos copias intactas de este gen y de su promotor bacteriano. Sin embargo, en las sojas de alto contenido en cido oleico este gen no se expresa (ver apartado 6.7). El primer punto que es necesario considerar en lo que atae a la presencia de una copia ntegra del gen que codifica la enzima -lactamasa en las sojas de alto contenido en cido oleico, es la probabilidad que este gen se transfiera exitosamente y se exprese en los microorganismos del tracto digestivo del ser humano. Para que esto ocurra es necesario que:

los fragmentos de ADN que contienen el gen que codifica la enzima lactamasa y su promotor bacteriano se escindan, los fragmentos de ADN que contienen el gen sobrevivan en el tracto digestivo, las bacterias que colonizan el tracto digestivo se transformen naturalmente, el fragmento de ADN que contiene el gen sobreviva al sistema de restriccin bacteriano, el fragmento de ADN que contiene el gen se integre de forma estable en el cromosoma bacteriano o en el plsmido y

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la bacteria mantenga y exprese la caracterstica del gen.

La transferencia de un gen que codifica la enzima -lactamasa funcional a los microorganismos del tracto digestivo del ser humano es muy poco probable ya que implica un gran nmero de etapas complejas que deberan sucederse una tras otra. El segundo punto que es necesario considerar y que reviste mayor importancia, es el impacto que tendra en la salud humana si un gen que codifica la enzima -lactamasa funcional se transfiera exitosamente a un microorganismo del tracto digestivo del ser humano, aunque esto sea poco probable. Las consecuencias sobre la salud humana de la transferencia de un gen que codifica la enzima -lactamasa son despreciables ya que el tracto digestivo de seres humanos saludables y de los que padecen alguna enfermedad contiene comnmente bacterias resistentes a la ampicilina (Calva et al., 1996 y Neu 1992 respectivamente). Por lo tanto, el efecto aditivo de la transferencia y expresin de un gen que codifica la enzima -lactamasa proveniente de la soja de alto contenido en cido oleico en el microorganismo del tracto digestivo del ser humano, sera insignificante en comparacin con la poblacin de bacterias resistentes a la ampicilina presentes habitualmente en el tracto digestivo. Adems, la ampicilina ha sido reemplazada en gran medida por otros antibiticos -lactmicos ms potentes y solo se usa en combinacin con otros frmacos destinados a inactivar la -lactamasa (Walsh 2000). Conclusin Es muy poco probable que el gen que codifica la resistencia a la ampicilina se transfiera desde la soja de alto contenido en cido oleico a las bacterias del tracto digestivo del ser humano ya que dicha transferencia solo sera exitosa si el gran nmero de etapas complejas necesarias se sucedieran de forma consecutiva. En el supuesto caso que el gen que confiere la resistencia a la ampicilina se transfiriera exitosamente a las bacterias del tracto digestivo del ser humano, las consecuencias seran despreciables ya que habitualmente el intestino del ser humano y el medio ambiente contienen bacterias resistentes a la ampicilina y en la prctica clnica este antibitico se usa raramente. Caracterizacin de la nueva protena
Funcin bioqumica y fenotipo

-12 insaturasa La sntesis de cidos grasos poliinsaturados en las semillas oleosas en desarrollo est catalizada por dos insaturasas de la membrana que aaden de forma consecutiva un segundo y un tercer enlace doble al cido oleico (Kinney, 1994). En la introduccin se explica la ruta de sntesis de los cidos grasos de cadena larga en los vegetales. La -12 insaturasa, codificada por el gen de la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo, aade el segundo enlace doble en la posicin -12 (n-6) convirtiendo el cido oleico en linoleico (Okuley et al., 1994, Heppard et al., 1996). Una n-3 insaturasa, codificada por el

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tercer gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados GmFad 3, agrega un tercer enlace doble en la posicin n-3 (-15) (Yadav et al., 1993). El gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo empleado se obtuvo de la soja. Sintetasa del cido dihidrodipicolnico La sintetasa del cido dihidrodipicolnico cataliza la primera etapa de la ruta metablica de sntesis de la lisina, un aminocido esencial (Brock et al., 1984). Esta sintetasa cataliza la condensacin del aspartato semialdehdo con piruvato para formar 2,3-dihidrodipicolinato. Esta reaccin ocurre en el cloroplasto de las plantas superiores y en muchas bacterias. En las plantas, la lisina inhibe esta sintetasa que es la principal enzima reguladora de la sntesis de la lisina. Los animales no son capaces de sintetizar la lisina y por lo tanto deben ingerirla en la dieta. - glucuronidasa El gen que codifica el marcador visual de E.coli codifica la enzima -glucuronidasa (-D-glucuronosido glucuronosohidrolasa, EC 3.2.1.31), una hidrolasa que cataliza el corte de una amplia gama de -glucurnidos. Muchos sustratos glucurnidos se pueden utilizar en ensayos de espectrofotometra, fluoromtricos e histoqumicos. La fusin de este gen con los genes de la planta o con los promotores se utiliza como marcador visual de la transformacin del vegetal debido a que en los vegetales superiores la actividad de la -glucuronidasa es muy escasa o casi nula (Jefferson et al., 1986). En las plantas transformadas con este gen se utiliza el 5-bromo-4-cloro-3indolil -D-glucurnido como sustrato colorimtrico para indicar la actividad de la hidrolasa. - lactamasa El gen bacteriano que codifica la enzima -lactamasa confiere resistencia a algunos antibiticos -lactmicos, por ejemplo la penicilina y la ampicilina. El gen se utiliza como marcador para seleccionar las bacterias transformadas de las no transformadas durante la clonacin y recombinacin del ADN en el laboratorio antes de transformar la clula vegetal. En presencia del antibitico, slo crecen las bacterias que expresan la -lactamasa. Este gen est controlado por un promotor bacteriano y no se espera que se exprese en la clula vegetal transformada.
Anlisis de expresin de las protenas

-12 insaturasa El ADN aislado de semillas en desarrollo de la R4 de sojas de alto contenido en cido oleico cuando el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo endgeno debera expresarse se estudi con Northern blot usando el mismo gen como sonda (Figura 7). En esta etapa, el promotor de la -conglicinina ligado a la copia transferida del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo tambin est activo. Los resultados obtenidos demuestran que las 49

semillas que contienen este gen en el locus A (G94-1, G168) no poseen ARNm de este gen detectable, mientras que las semillas que contienen el gen en el locus B (G175) o las semillas que poseen el gen endgeno (G90) tienen cantidades significativas de ARNm; lo que demuestra que en las sojas de alto contenido en cido oleico ninguno de los genes que codifican la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo se transcribe.

Figura 7. Anlisis del ARN aislado de semillas de la R4 en desarrollo el da 20 post floracin con Northern blot utilizando el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo como sonda. La soja G90 solo posee el gen endgeno y se utilizo como control silvestre. Las sojas G94-1 y G168 poseen el gen en el locus A y la soja G175 en el locus B.

Sintetasa del cido dihidrodipicolnico El ARN aislado de tejido foliar de la R6 y de semillas inmaduras de la R4 de sojas de alto contenido en cido oleico se estudi con Northern blot y la sonda del gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico (Figura 8). En las sojas G94-1, G94-19 y G168 no se detect el ARNm del gen. Todas las protenas aisladas del tejido foliar y de las semillas de estas tres sojas se analiz con Western blot usando un anticuerpo policlonal anti sintetasa del cido dihidrodipicolnico de Corynebacterium. Los resultados prueban que la protena de la sintetasa del cido dihidrodipicolnico slo se encuentra presente en las semillas del control que posee alto contenido de lisina, pero no se detect en ninguna de las sojas de alto contenido en cido oleico estudiadas.

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Figura 8. Northern blot del ARN de sojas de alto contenido en cido oleico con una sonda de la regin codificadora del gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico. La soja G94 que posee este gen se utiliz como control positivo. Se utilizaron dos controles negativos, el tipo silvestre y la soja A2396. La parte superior del gel se muestra a la derecha y la parte inferior a la izquierda.

El anlisis de aminocidos de las tres rplicas de las sojas de alto contenido en cido oleico estudiadas demuestra que los contenidos de lisina de estas tres sojas son similares a los de la soja progenitora (A2396).
- glucuronidasa

Las sojas G94-1, G94-19 y G168 contienen un casete de expresin del gen que codifica el marcador visual ntegro. Sin embargo, los ensayos colorimtricos de las semillas y del tejido foliar de individuos de la R6 de estas tres sojas prueban que este gen no se expresa (Figura 9). La soja transformante original, 260-05, se seleccion segn la expresin del gen que codifica la protena marcadora fluorescente y como consecuencia se anul la expresin del gen que codifica el marcador visual en las generaciones subsiguientes. Si bien la inactivacin de los transgenes es relativamente comn en los vegetales, la empresa que solicit la aprobacin no ha investigado la razn por la cual el gen que codifica el marcador visual se desactiv (Kilby et al., 1992, Ingelbrecht et al., 1994, Brusslan y Tobin, 1995).

Figura 9. Ensayo colorimtrico con la enzima del gen que codifica la protena marcadora fluorescente efectuado en semillas de la R6 de las sojas G94-1, G94-19 y G168 de alto contenido en cido oleico y en semillas positivas y negativas de la soja control (A2396). El control positivo es

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una soja positiva para el gen que codifica la protena marcadora fluorescente bien caracterizada obtenida con otra transformacin. El color oscuro de la solucin dentro de los recipientes indica la actividad de la enzima del gen que codifica la protena marcadora fluorescente.
- lactamasa

Todas las sojas obtenidas a partir de la 260-05, que solo posee el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo en el locus A, tambin poseen dos copias intactas del gen que codifica la enzima -lactamasa. Estas dos copias estn controladas por un promotor bacteriano y por lo tanto no deberan expresarse en la clula vegetal. La ausencia de expresin se confirm midiendo la actividad de la -lactamasa en extractos de tejido foliar sin clulas de la soja G94 -1. La ausencia de actividad detectable de la -lactamasa en la soja G94 -1 demuestra que el gen que codifica la enzima -lactamasa no se expresa en las clulas vegetales (Figura 10).

1 = 50 g albmina srica bovina; 2 = 500g A2396; 3 = 500g G94-1; 4 = 2500 g G94-1; 5 = 50 g E.coli; 6 = 100 g E.coli

Figura 10. Actividad de la -lactamasa en sojas de alto contenido en cido oleico, en la soja lite A2396 control y en E.coli transformada con el plsmido pBS43.

Evaluacin de la posible toxicidad

La evaluacin de la toxicidad potencial de las protenas nuevas de un alimento genticamente modificado que solo difiere de su homologo tradicional en una o en unas pocas protenas nuevas puede hacerse de forma anloga a las pruebas de toxicidad tradicionales (OMS 2000). Es decir, se evala la toxicidad de la nueva protena en s misma y no la toxicidad del alimento como un todo. El primer paso en la evaluacin de la posible toxicidad de una nueva protena consiste en confirmar si est presente en el alimento tal como se consume y, por lo tanto, si puede haber exposicin 1. Si se comprueba que el ser humano puede estar expuesto a la nueva protena, se utilizan una serie de pruebas que en conjunto demuestran con un alto grado de certeza que dicha exposicin no causa peligro.

An si se puede demostrar que la porcin comestible no contiene una protena, nunca se debe introducir de forma deliberada una protena que se sabe es txica para el ser humano en otro organismo que se convertir en alimento debido al riesgo de transferencia accidental de dicha protena a la porcin comestible.

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La evaluacin de la posible toxicidad de una protena debe considerar:

si el ser humano ha consumido la nueva protena sin que esta haya causado peligro o si es lo suficientemente similar a otras protenas que se consumen habitualmente en los alimentos y que no presentan riesgos. si existen similitudes entre la secuencia de aminocidos de la nueva protena y la de otras protenas que se sabe que son toxinas o antinutrientes; si la nueva protena causa algn tipo de efecto nocivo en las pruebas de toxicidad por dosis nica, si la nueva protena es resistente a la temperatura o a la elaboracin, si la nueva protena es resistente a la degradacin en modelos de digestin simulados.

A diferencia de muchas otras sustancias que se aaden a los alimentos, es posible predecir la ruta metablica de las protenas en el sistema digestivo. Generalmente, las protenas se descomponen en los aminocidos que la constituyen los que luego se asimilan. En el caso de las nuevas protenas, es de suma importancia determinar si se comportarn como cualquier otra protena de la ingesta. El ensayo de digestibilidad in Vitro permite determinar si las caractersticas de una protena son similares a las de otras protenas que se ingieren habitualmente o no. Esta tcnica, por ejemplo, permite determinar si una protena es resistente a los jugos digestivos. Los estudios de toxicidad por dosis nica constituyen un componente importante de la evaluacin de inocuidad de las nuevas protenas y son especialmente tiles en aquellos casos en los que la protena en estudio no cuenta con una trayectoria de consumo inocuo. Este tipo de estudios debera ser suficiente ya que si se trata de una protena txica para el ser humano la administracin de una nica dosis desencadena ciertos mecanismos y se ha constatado que si se administra una nica dosis a animales de laboratorio se observan efectos txicos (Sjoblad et al., 1992). En estos estudios de toxicidad se administra una dosis muy alta de la protena purificada, generalmente en rdenes de magnitud superiores al grado de exposicin que el ser humano pudiera tener. En condiciones ideales, la protena en estudio debera ser aquella que se purific directamente del nuevo organismo. Si esto no fuera posible, generalmente debido a las dificultades que presenta la obtencin de cantidades suficientes de la protena purificada, es de suma importancia verificar que la protena en estudio es equivalente del punto de vista funcional y bioqumico a la protena que se encuentra en el organismo genticamente modificado. Si la secuencia de la nueva protena no posee similitudes significativas con otras toxinas protenicas conocidas, si no es termoestable o si no permanece estable durante la elaboracin y se digiere rpidamente en condiciones similares a las de los mamferos y si cuenta con una trayectoria de consumo inocuo en seres humanos o no

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causa efectos txicos en pruebas de toxicidad por dosis nica, se puede concluir con certeza que la protena no es txica para el ser humano y no es necesario continuar efectuando estudios toxicolgicos. Si la nueva protena no cumple con alguno de los requisitos enumerados puede ser necesario continuar investigndola. Por ejemplo, si se observan efectos nocivos en las pruebas de toxicidad por dosis nica es necesario efectuar otras pruebas de toxicidad a fin de determinar el grado de exposicin inocua para el ser humano. En la evaluacin de la toxicidad potencial de una nueva protena tambin es necesario determinar los posibles efectos secundarios de la actividad de la nueva toxina en el organismo, por ejemplo si causa la acumulacin de otras sustancias. Si, por ejemplo, en una planta se detecta la acumulacin de un metabolito debido a la detoxificacin de un herbicida, es importante evaluar la toxicidad potencial de esas otras sustancias.
Evaluacin de la posible alergenicidad

Prcticamente todos los alrgenos alimentarios son protenas, pero solo unas pocas de las muchas protenas que contienen los alimentos son alrgenas. Es decir que, si bien los alimentos pueden contener miles de protenas diferentes relativamente pocas son alrgenas. Las tcnicas de ADN recombinante pueden aumentar la diversidad de protenas en los alimentos y por lo tanto en la evaluacin de inocuidad es necesario incluir la alergenicidad potencial de toda nueva protena. Cabe mencionar que las tcnicas de mejoramiento convencionales tambin pueden causar un aumento de la diversidad de las protenas que se ingieren. Predecir el potencial alergnico de una nueva protena no es una tarea sencilla y no existen modelos animales validados para evaluar la alergenicidad. Por este motivo es necesario evaluar el potencial alergnico de una nueva protena con un enfoque integrado, paso a paso y caso por caso, utilizando varios criterios combinados ya que no existe un nico criterio capaz de predecir la alergenicidad o su ausencia. La evaluacin hace hincapi en la fuente de la nueva protena, en toda similitud significativa entre la secuencia de aminocidos de la nueva protena y la de alrgenos conocidos y en las propiedades estructurales de la nueva protena, incluso su susceptibilidad a la digestin. El uso sistemtico de estos criterios permite determinar de forma fiable el potencial alrgeno de una nueva protena (Lehrer y Reese 1998; Jones y Maryanski 1991). En la evaluacin de la alergenicidad es necesario tener en cuenta la fuente de la nueva protena y toda similitud que pudiera haber entre su secuencia de aminocidos y la de alrgenos conocidos. Si la nueva protena proviene de una fuente que se conoce como alergnica o si tiene una secuencia similar a la de un alrgeno conocido es necesario continuar realizando pruebas inmunolgicas con suero de individuos que padezcan una alergia clnica a la fuente de la protena para determinar si la nueva protena puede causar alergia en los individuos afectados. Incluso si el resultado es negativo

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puede que sea necesario continuar efectuando pruebas, por ejemplo pruebas dermatolgicas en los individuos susceptibles. Un factor que contribuye a determinar el potencial alergnico de una nueva protena es que muchos alrgenos alimentarios son resistentes a la digestin. La capacidad del alrgeno alimentario de alcanzar y atravesar la barrera mucosa del intestino conservando su forma inmunolgica intacta es un prerrequisito de la alergenicidad (Metcalfe et al., 1996). Generalmente la estabilidad de la protena en la digestin se estudia con modelos simulados de digestin gstrica e intestinal de los mamferos (Astwood et al., 1996). La exposicin a la nueva protena tambin constituye un factor importante para evaluar la alergenicidad, al igual que para evaluar la toxicidad potencial, y contribuye a determinar el potencial alergnico de la nueva protena. En este sentido, es necesario considerar la naturaleza del alimento que se destina al consumo a fin de determinar los procesos de elaboracin utilizados y sus consecuencias en la protena del producto terminado. El aceite refinado que generalmente no contiene protenas detectables constituye un ejemplo clsico de la importancia que reviste la elaboracin.
Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional

La estrategia ms adecuada para determinar la inocuidad y las propiedades nutritivas de los alimentos genticamente modificados consiste en identificar los posibles problemas que se pudieran presentar y luego comparar las similitudes y las diferencias que hubiera entre estos y sus homlogos convencionales (OMS 2000). Tambin es importante determinar la composicin de los alimentos derivados de un organismo genticamente modificado, es decir medir los contenidos de nutrientes, de sustancias txicas y de antinutrientes claves y luego compararla con la de su homologo convencional. Las sustancias txicas, los antinutrientes y los nutrientes esenciales son los componentes del alimento que pueden tener un impacto considerable en la dieta general. Estos pueden ser compuestos que se encuentran en alta concentracin (por ejemplo lpidos, protenas y carbohidratos), o compuestos que se encuentran en concentraciones pequeas (por ejemplo, minerales y vitaminas). Las sustancias txicas son aquellos compuestos importantes inherentes a la planta, por ejemplo aquellos compuestos cuya potencia y cuya concentracin pueden tener consecuencias en la salud (por ejemplo, el aumento de concentracin de solanina en Solanum tuberosum). En el caso de la soja, los componentes esenciales que se deben comparar incluyen protenas, lpidos, carbohidratos, aminocidos, cidos grasos, cido ftico, inhibidores de la tripsina, lectinas e isoflavonas (OCDE 2001). La composicin de la soja de alto contenido en cido oleico se compar con la de la soja lite progenitora (A2396). Estudios de campo y datos Se efectuaron dos ensayos de campo con sojas de alto contenido en cido oleico. En el primer ensayo de campo se plantaron las sojas G94-1 y G94-19 en dos campos experimentales en los Estados Unidos: uno en Slater, Iowa y otro en Isabella, Puerto Rico en el verano de 1995 y en el invierno de 1995 y 1996. Se recolectaron muestras

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de semillas de las generaciones R4 y R5 de cada campo experimental y se midieron los contenidos de rafinosa, estaquiosa, cido ftico e isoflavonas de cada muestra por duplicado. En el segundo ensayo de campo que se efectu en el verano de 1996 se plantaron las sojas G94-1, G94-19, G168 y la soja progenitora A2396 en cuatro campos experimentales en los Estados Unidos: Redwood Falls en Minnesota, Kalamazoo en Michigan y Prairie City y Cedar Rapids en Iowa. En las semillas de la generacin R6 se determin la composicin aproximada, la concentracin de los inhibidores de la tripsina y los contenidos de aminocidos, de cidos grasos, de vitaminas y minerales y de tocoferoles, por duplicado en cada una de las tres repeticiones de cada uno de los cuatro campos experimentales. Nutrientes esenciales Anlisis de la composicin aproximada La composicin aproximada mide los contenidos de lpidos y aceites crudos, protenas, fibras y cenizas con el fin de determinar si ha habido cambios en los constituyentes principales de la semilla de soja.
Cuadro 5. Composicin aproximada1 de las sojas control y de alto contenido en cido oleico.

Control progenitor
Humedad (g/100g de peso hmedo) Lpidos y aceites crudos Protenas Fibras Cenizas 1 Medias (rango)

Sojas de alto contenido en cido oleico

Rango citado en la literatura


7-11 13,2-22,5 36,9-46,4 4,7-6,8 4,61-5,37

(g/100 g peso seco, salvo si se indica lo contrario) 7,69 (7,00-8,20) 7,85 (7,20-8,40) 25,37 (21,62-28,29) 40,11 (38,41-41,68) 6,11 (5,44-7,14) 5,13 (4,53-5,85) 23,90 (19,74-29,28) 40,76 (38,85-42,97) 6,76 (5,00-7,26) 4,81 (4,13-5,54)

No existen diferencias significativas entre la composicin aproximada de la soja progenitora y la de las sojas de alto contenido en cido oleico y los valores obtenidos estn comprendidos en los rangos citados en la literatura referente a la soja. Composicin de aminocidos Se determin el contenido de 17 de los 20 aminocidos existentes. Los tres aminocidos cuyos contenidos no se midieron fueron prolina, asparagina y glutamina.
Cuadro 6. Composicin de aminocidos1 de las sojas control y de alto contenido en cido oleico. Aminocido Control progenitor
(g/100 g peso seco) 0,44 (0,41-0,46) 2,45 (2,27-2,63) 0,96 (0,90-1,05) 2,64 (2,42-2,91) 4,3 (3,98-4,58) 1,37 (1,24-1,50) 1,79 (1,61-1,95) 7,13 (6,58-7,81) 0,55 (0,51-0,60)

Sojas de alto contenido en cido oleico


0,47 (0,42-0,51) 2,38 (2,17-2,67) 0,93 (0,83-1,09) 2,64 (2,37-2,88) 4,45 (4,14-4,93) 1,52 (1,38-1,70) 1,84 (1,65-2,02) 7,03 (6,50-7,79) 0,58 (0,52-0,71)

Rango citado en la literatura


0,53-0,54 2,35-2,86 0,89-1,08 2,45-3,49 3,87-4,98 1,33-1,79 1,81-2,32 6,10-8,72 0,56-0,66

Triptfano Lisina Histidina Arginina Acido asprtico Treonina Serina Acido glutmico Cistena

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Glicina Alanina Valina Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina 1 Medias (rango)

1,57 (1,44-1,68) 1,54 (1,43-1,68) 1,73 (1,61-1,86) 0,47 (0,44-0,50) 1,72 (1,48-1,87) 2,86 (2,64-3,05) 1,45 (1,35-1,54) 1,82 (1,71-1,97)

1,71 (1,56-1,85) 1,67 (1,50-1,84) 1,84 (1,58-2,05) 0,54 (0,47-0,60) 1,76 (1,54-2,00) 2,91 (2,70-3,18) 1,51 (1,38-1,62) 1,86 (1,72-2,03)

1,88-2,02 1,49-1,87 1,52-2,24 0,49-0,66 1,46-2,12 2,71-3,20 1,12-1,62 1,70-2,08

Los contenidos de los 17 aminocidos estudiados en las sojas de alto contenido en cido oleico no presentan diferencias significativas con el progenitor y los valores obtenidos se encuentran dentro de los rangos citados en la literatura. Composicin de cidos grasos Se midieron los contenidos de cidos grasos de las sojas G94-1 y G94-19 y del control progenitor que se plantaron en el ensayo de campo de 1995 y 1996 y se compararon con los rangos especificados en el Codex Alimentarius para el aceite de soja.
Cuadro 7. Anlisis de la composicin de cidos grasos de las sojas control y de alto contenido en cido oleico del ensayo de campo de 1995 y 1996. Acido graso Control progenitor G94-1 G94-19 Rango especificado en el Codex

(g/100 g de cido graso, los valores son las medias, los rangos no se indican) C14:0 mirstico <0,1 <0,1 <0,1 <0,5 C16:0 palmtico 10,1 6,31 6,6 7,0-14,0 C16:1 palmitoleico 0,1 0,12 0,12 <0,5 C16:2 hexadienoico <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 C16:3 hexatrienoico C18:0 estearico 3,2 3,7 3,6 1,4-5,5 C18:1 oleico 14,7 84,6 84,9 19,0-30,0 C18:2 (9,12) linoleico 61,6 0,9 0,6 44,0-62,0 <0,1 0,8 0,7 C18:2 (9, 15) linoleico C18:3 linolnico 9,5 2,4 1,9 4,0-11,0 C20:0 araqudico 0,2 0,4 0,5 <0,1 0,2 0,4 0,4 <0,1 C20:1 eicosenoico C20:2 eicosadienoico No efectuado No efectuado No efectuado C22:0 docosanoico 0,3 0,4 0,5 <0,5 C22:1 erucico <0,1 <0,1 <0,1 C24:0 lignocerico 0,1 0,1 0,2 1 Anlisis completo de los cidos grasos de las sojas control y de alto contenido en cido oleico de los ensayos de campo de 1995 y 1996.

Tambin se efectu otro anlisis ms limitado de la composicin de cidos grasos de las tres sojas de alto contenido en cido oleico y del control de los ensayos de campo de 1996 .
Cuadro 8. Anlisis de la composicin de cidos grasos1 del aceite obtenido de las sojas control y de alto contenido en cido oleico del ensayo de campo de 1996. Acido graso Control progenitor Sojas de alto contenido en cido oleico
6,55 (6,22-6,96)

Rango citado en la literatura


7-12

C16:0 palmtico

(g/100 g de cido graso) 10,25 (9,94-10,59)

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C18:0 estearico C18:1 oleico C18:2 linoleico C18:2 ismero 9,15 linoleico C18:3 linolnico 1 Medias (rango)

3,95 (3,57-4,27) 23,09 (22,07-23,91) 55,36 (53,61-56,48) 0,00 7,35 (6,81-8,35)

3,43 (3,04-3,81) 83,84 (80,02-85,38) 2,23 (1,19-4,83) 0,48 (0,37-0,56) 3,47 (2,87-4,51)

2-5,5 20-50 35-60 2-13

Los resultados de los dos anlisis prueban que existen diferencias significativas en los contenidos de cidos oleico, linoleico, linolnico y palmtico del aceite obtenido a partir de las sojas de alto contenido en cido oleico y de la soja control. El contenido de cido oleico aumenta significativamente y los contenidos de cidos palmtico, linoleico y linolnico se reducen concomitantemente. Los contenidos de otros cidos grasos del aceite son similares en las sojas de alto contenido en cido oleico y en el control progenitor y son similares a los valores citados en el Codex Alimentarius para el aceite de soja. Otros aceites comestibles muy empleados (por ejemplo, el aceite de oliva, y los aceites de nabina y de girasol de alto contenido en cido oleico) tambin tienen alto contenido de cido oleico. El aumento del contenido de cido oleico no presenta problemas de inocuidad. Adems de los cambios esperados en la composicin de cidos grasos del aceite obtenido a partir de sojas de alto contenido en cido oleico, se detectaron trazas (menos del 1% del contenido de cidos grasos) del ismero 9,15 del cido linoleico (cido cis-9, cis-15 octadecadeinoico). Generalmente este ismero solo se encuentra en aceites de soja hidrogenados y en la materia grasa de la leche y no se encuentra en el aceite obtenido a partir de la soja progenitora A2396. La empresa que solicit la aprobacin considera que la presencia del ismero se debe a la actividad de la insaturasa -15 (n-3) (el tercer gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados GmFad3), que agrega un doble enlace -15 al cido 9,12 linoleico. El contenido de cido linoleico como porcentaje del total de cidos grasos se reduce de >50% a <2% en las plantas transgnicas. Se cree que la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados codificada por el tercer gen sintetiza una pequea cantidad del ismero agregando un doble enlace -15 al cido 9 oleico. La empresa document la hiptesis segn la cual las sojas de alto contenido en cido oleico se cruzaron con una soja que contena el tercer gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que no se expresaba. En la progenie resultante de ese cruzamiento, el contenido del ismero disminuye o es casi nulo. La empresa tambin suministr informacin sobre la ocurrencia del ismero 9,15 del cido linoleico en aceites y grasas que se emplean habitualmente en Europa para hornear y frer.
Cuadro 9. Ocurrencia del ismero 9,15 del cido linoleico en aceites y grasas que se emplean habitualmente par hornear y frer. Aceite o grasa
Aceite de palma parcialmente hidrogenado Aceite de soja parcialmente hidrogenado

Composicin de cidos grasos (g/100 g de cido graso) C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:2 (9,15)
20,8 10,8 4,0 5,8 48,3 44,8 22,4 21,4 1,3 3,4

C18:3
0,8 0,7

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Aceite de colza parcialmente hidrogenado Materia grasa de la leche

5,6 34,8

3,8 11,7

72,0 26,6

8,9 2,6

2,7 0,4

1,3 0,8

Otras fuentes comestibles de grasas, por ejemplo la materia grasa de la leche y los aceites vegetales parcialmente hidrogenados contienen entre 0,4 y 3,4% del ismero 9,15 del cido linoleico expresado como porcentaje del total de cidos grasos. En consecuencia, no se considera que 0,5% de este ismero en el total de cidos grasos (que representa aproximadamente el 25% de la fraccin del cido linoleico) en el aceite obtenido de las sojas de alto contenido en cido oleico presente problemas de inocuidad. Vitaminas y minerales Los contenidos de vitaminas y minerales, incluidos los tocoferoles se midieron en las sojas de alto contenido en cido oleico G94-1, G94-19 y G168 y en el control progenitor A2396. Los cuatro ismeros del tocoferol, -, -, -, y -tocoferol, tambin conocidos como vitamina E, no son equivalentes. Del punto de vista de la bioactividad el -tocoferol es el ms importante. La Ingestin diaria recomendada de vitamina E se expresa habitualmente en equivalentes de -tocoferol.
Cuadro 10. Contenido de vitaminas y minerales1 en las sojas progenitora y de alto contenido en cido oleico. Vitamina o mineral2 Control progenitor Sojas de alto contenido en cido oleico Rango citado en la literatura

(mg/100 g peso seco, salvo si se indica lo contrario) Minerales: Calcio 264 (245-302) 232 (212-251) 132,7-326,3 Cobre 0,64 (0,30-1,00) 0,67 (0,24-1,02) 0,9-5,1 5,6 (4,2-7,4) 5,8 (3,8-7,9) 3,2-7,9 Hierro Magnesio 247 (232-260) 236 (215-261) Manganeso 2,9 (1,9-4,0) 2,7 (2,2-3,6) 0,4-6,8 Fsforo 621 (516-742) 636 (501-771) 378-1836 Potasio 1755 (1468-1950) 1689 (1492-1896) 859-1784 3,1 (1,1-6,5) 4,3 (2,2-8,7) Sodio Zinc 4,0 (3,2-4,7) 4,3 (3,0-5,8) Vitaminas: Vitamina B6 0,115 (0,098-0,131) 0,125 (0,110-0,141) 8 (5-12) 10 (5-16) -caroteno (UI/100 g de peso seco) Vitamina B1 0,96 (0,74-1,17) 0,89 (0,63-1,24) Vitamina B2 0,29 (0,26-0,30) 0,30 (0,27-0,35) Vitamina E (UI/100 g de peso 1,2 (1,1-1,6) 1,1 (0,9-1,7) seco) Niacina 2,6 (2,28-2,88) 2,74 (2,38-3,15) Acido pantotnico 1,051 (0,936-1,132) 0,961 (0,794-1,063) 274 (184-379) 284 (186-384) Acido flico (g /100 g de peso seco) Tocoferoles: Total 20,11 (18,01-22,50) 18,57 (16,36-21,16) alfa 1,37 (1,11-1,62) 1,32 (1,06-1,62) 1,09-2,84 beta 0,17 (0,07-0,20) 0,22 (0,15-0,30) <0,5 gama 16,17 (14,03-18,81) 15,42 (13,12-17,58) 15,0-19,1 delta 1,72 (1,52-2,11) 1,88 (1,61-2,28) 2,46-7,25 1 Medias (rango) 2 Todas las muestras contienen menos de 0,1 g/100 g de vitamina B12, menos de 1,0 mg/100 g de vitamina C y menos de 5 UI/100 g de retinol.

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No se detectaron diferencias significativas en los contenidos de vitaminas y minerales, incluidos los tocoferoles, entre las sojas de alto contenido en cido oleico y la soja progenitora. Los contenidos de minerales de las sojas de alto contenido en cido oleico se encuentran dentro de los rangos citados en la literatura. No se suministraron los rangos citados en la literatura de los contenidos de vitaminas, excepto los de los tocoferoles. Tanto para la soja progenitora como para las sojas de alto contenido en cido oleico, el contenido de tocoferol delta fue menor al lmite inferior del rango citado en la literatura. Los contenidos de los otros tocoferoles en las sojas de alto contenido en cido oleico se encuentran dentro del rango citado en la literatura para la soja. Isoflavonas Naturalmente la soja contiene varias isoflavonas que poseen actividad bioqumica, por ejemplo efectos hipocolesterolemicos y estrognicos en mamferos. En una poca se crea que las isoflavonas (grupo que comprende los fitoestrgenos) eran antinutrientes, sin embargo se ha constatado que las isoflavonas tienen efecto anticarcinognico. Las isoflavonas ms importantes de la soja y de los productos elaborados a partir de la soja incluyen la daidcina, genistina y sus aglicones correspondientes, la daidceina y la genisteina. Se han detectado trazas de glicitina y gliciteina. Los contenidos de isoflavonas se midieron en las sojas de alto contenido en cido oleico G94-1, G94-19 y en la soja progenitora A2396.
Cuadro 11. Composicin de isoflavonas1 de la soja progenitora y de las de alto contenido en cido oleico. Isoflavonas Control progenitor
((g/g peso seco) 693 (623-762) 714 (574-854) 192 (188-196)

Sojas de alto contenido en cido oleico


612 (525-694) 724 (548-910) 273 (261-287)

Rango citado en la literatura

Daidceina total Genisteina total Gliciteina total 1 Medias (rango)

295-1527 416-2676 149-341

No se observaron diferencias significativas entre los contenidos totales de daidceina y de genisteina de la soja progenitora y los de las sojas de alto contenido en cido oleico G94-1 y G94-19. Los valores obtenidos se sitan dentro de los rangos citados en la literatura para la soja. Sin embargo, el contenido de gliciteina total de la soja de alto contenido en cido oleico es ligeramente superior al de la soja control. No obstante, el valor de gliciteina total se encuentra dentro del rango citado en la literatura y por lo tanto no se cree que presente problemas de inocuidad. Sustancias txicas Las nicas sustancias txicas presentes naturalmente en la soja son las lectinas. Las lectinas son protenas que se unen a molculas que contienen carbohidratos e inhiben el crecimiento y pueden causar la muerte de animales y se infiere que causan efectos similares en el ser humano. Sin embargo, las lectinas se degradan rpidamente con el calor y por lo tanto solo presentan riesgos si se consume la soja cruda pero el ser humano no ingiere alimentos que contengan soja cruda.

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Si bien el ser humano no consume alimentos que contengan soja cruda, la empresa que solicit la aprobacin analiz la composicin y determin el contenido de lectina en la semilla de las sojas de alto contenido en cido oleico. Las semillas de las muestras pertenecen a la generacin R6 de las sojas de alto contenido en cido oleico. Las sojas G94-1, G94-19, G168 y la soja progenitora A2396 se plantaron en cuatro campos experimentales de los Estados Unidos en el verano de 1996. Las muestras de las tres repeticiones de cada uno de los cuatro campos experimentales se analizaron por duplicado.
Cuadro 12. Contenido de lectina1 de la soja progenitora y de las de alto contenido en cido oleico. Lectina Control progenitor Sojas de alto contenido en cido oleico
7,83 (5,37-9,70) 3,67 (2,77-4,73) 1,32 (0,97-1,67)

Rango citado en la literatura


2,7-12,5 1,2-6,0 0,5-2,4

UH1/mg extracto de protena 6,36 (4,09-7,90) UH1/mg protena total 2,98 (2,30-3,90) UH/mg de la muestra (peso 1,03 (0,70-1,30) hmedo) 1 UH = unidad hemaglutinante. Medias (rango).

Las concentraciones de lectina de las sojas de alto contenido en cido oleico son ligeramente ms altas que las del control. Sin embargo, se encuentran dentro de los rangos citados en la literatura para la soja. Considerando que la lectina se descompone con la temperatura y que, si bien los contenidos de lectinas son ligeramente superiores a los del control, estos se encuentran dentro de los rangos citados en la literatura, no se considera que presenten problemas de inocuidad. Antinutrientes clave La soja contiene dos antinutrientes bien descritos en la literatura: los inhibidores de la tripsina y el cido ftico. Los primeros son antinutrientes lbiles al calor que interfieren con la digestin de las protenas y retrasan el crecimiento del animal. Sin embargo, el tratamiento trmico durante la elaboracin de los productos elaborados a partir de la soja los destruye. El cido ftico por su parte permanece estable a travs de la mayora de las etapas de elaboracin de la soja y se ha constatado que interfiere con la biodisponibilidad de minerales, por ejemplo calcio, magnesio y zinc. Las concentraciones de los inhibidores de la tripsina y del cido ftico se determinaron en semillas de la R6 de las sojas G94-1, G94-19 y G168.
Cuadro13. Contenido de antinutrientes1 de las sojas progenitora y de alto contenido en cido oleico. Antinutriente Control progenitor Sojas de alto contenido en cido oleico
30,20 (14,21-42,43) 1,42 (1,25-1,69)

Rango citado en la literatura


26,4-93,2 1,3-4,1

Inhibidor de la tripsina (UIT/mg de peso seco) Acido ftico (g/100g de peso seco) 1 Medias (rango)

31,67 (22,84-40,47) 1,42 (1,32-1,53)

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No se observaron diferencias significativas entre los contenidos de antinutrientes en la soja control y los de las sojas de alto contenido en cido oleico y los valores se encuentran dentro de los rangos citados en la literatura. Otros compuestos La soja contiene rafinosa y estaquiosa, galacto oligosacridos que fermentan, cuya ingestin puede causar efectos secundarios desagradables, por ejemplo flatulencia. La elaboracin de las harinas de soja para obtener concentrados y aislados elimina estos oligosacridos. Los contenidos de rafinosa y estaquiosa se analizaron en semillas de las R4 y R5 de las sojas G94-1 y G94-19.
Cuadro 14. Contenido de rafinosa y estaquiosa1 de las sojas progenitora y de alto contenido en cido oleico. Compuesto Control progenitor Sojas de alto contenido en cido oleico
68 (65-75) 15 (14-16)

Rango citado en la literatura


44,8-68,8 8,6-18,5

Estaquiosa Rafinosa 1 Medias (rango)

(moles/g peso seco) 63 (60-67) 14 (14-14)

No se observaron diferencias significativas entre los contenidos de estaquiosa y rafinosa de la soja control y los de las sojas de alto contenido en cido oleico y los valores estn comprendidos dentro de los rangos citados en la literatura. Resumen del anlisis de la composicin Las concentraciones de lectina en las sojas de alto contenido en cido oleico son ligeramente superiores a las del control. Sin embargo, los valores obtenidos estn comprendidos dentro de los rangos citados en la literatura para la soja. Considerando que las lectinas se degradan rpidamente con el calor y que el ser humano no consume la soja cruda como alimento, los valores ligeramente elevados no presentan riesgos. No se observaron diferencias en los contenidos de antinutrientes. El anlisis de varios macro y micronutrientes prueba que en las sojas de alto contenido en cido oleico el perfil de los cidos grasos cambi significativamente. La media de cido oleico aumento de 23,1% en la soja progenitora a 83,8% en las sojas de alto contenido en cido oleico y el contenido de cido linoleico promedio disminuy correlativamente de 55,4% a 2,2%. Tambin se constataron pequeas disminuciones de los contenidos de cidos palmtico y linolnico. Otros aceites comestibles importantes (por ejemplo, el aceite de oliva y los aceites de nabina y de girasol de alto contenido en cido oleico) tambin tienen altos contenidos de cido oleico. No se considera que el consumo de altos contenidos de cido oleico presente problemas de inocuidad. El anlisis de la composicin demuestra que las sojas de alto contenido en cido oleico contienen trazas (inferiores al 1%) no esperadas de un ismero del cido linoleico. La soja progenitora no contiene este ismero pero est presente en cantidades similares a las de otros alimentos de consumo habitual, por ejemplo, los

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aceites de soja hidrogenados y la materia grasa de la leche. No se considera que su presencia presente riesgos toxicolgicos o nutricionales. El resto de la composicin de las sojas de alto contenido de cido oleico es equivalente a la de la soja progenitora y a otras variedades de soja comerciales. Protenas alergnicas endgenas El estudio comparativo tambin incluye el anlisis de las protenas de la soja, muchas de las cuales son alergenos naturales. Si bien ninguna de las sojas de alto contenido en cido oleico expres nuevas protenas, el perfil de protenas de almacenamiento en la semilla es ligeramente distinto. Por este motivo se efectu un estudio con el fin de determinar si las modificaciones efectuadas al perfil de protenas de la soja haban alterado la alergenicidad en comparacin con la soja progenitora (A2396). Las globulinas 7S y 11S de la soja son dos protenas de almacenamiento que representan aproximadamente el 70% de la harina de protena. La fraccin 7S est compuesta de las subunidades , 1, y de la -conglicinina. La fraccin 11S est compuesta por subnidades cidas (A) y bsicas (B) de la glicinina. En la soja de alto contenido en cido oleico las concentraciones de las subunidades y 1de la conglicinina son inferiores a las de la soja progenitora A2396. Esta reduccin coincide con el aumento en las concentraciones de las subunidades A y B de la glicinina y con el aumento en la concentracin del precursor A2B1A de la glicinina. El perfil de las otras protenas de almacenamiento parece ser idntico al de la soja A2396. La empresa supone que la disminucin de la concentracin de las subunidades y 1 de la -conglicinina se debe a la cosupresin causada por una secuencia promotora 1 del vector del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo (pBS43). La cosupresin se ha observado en otros genes y en otras plantas y est descrito en la literatura (Brusslan y Tobin, 1995).
Reactividad radioalergosorbente

Los extractos de la soja progenitora A2396 y de la soja de alto contenido en cido oleico G94-1 se probaron con el suero de 31 individuos con historia clnica de alergias alimentarias o a la soja, con pruebas cutneas positivas o una respuesta positiva del anticuerpo IgE al extracto de soja, o ambas. El suero control se obtuvo de individuos tolerantes a la soja con pruebas cutneas negativas y una prueba radioalergosorbente al extracto de soja con contenidos totales de IgE similares a los del suero de individuos sensibles a la soja. Muchos sueros presentaron reactividad del anticuerpo IgE al extracto de soja. Los porcentajes de unin del anticuerpo IgE de 21 de los 31 sueros del estudio fueron igual o superiores al 4%. Los porcentajes de unin al anticuerpo IgE de 11 de las 21 muestras positivas fueron superiores al 20%. Los sueros que presentaron mayor reactividad radioalergosorbente se emplearon en las pruebas de inhibicin radioalergosorbente.

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Inhibicin radioalergosorbente Las curvas de inhibicin radioalergosorbente de los extractos de la soja progenitora y de la soja de alto contenido en cido oleico fueron casi idnticas a las curvas radioalergosorbentes de la soja progenitora. Anlisis de inmunodeteccin Las 21 muestras de suero de mayor potencia radioalergosorbente se seleccionaron para efectuar un anlisis de inmunodeteccin. Tal como se esperaba, varias protenas del extracto de soja se unen a los anticuerpos IgE de los sueros de individuos alrgicos a la soja. Algunos sueros fueron ms reactivos que otros y se seleccionaron seis de estos para efectuar un estudio de los alrgenos de las sojas progenitora y de alto contenido en cido oleico. Las bandas de protenas reactivas se detectaron con tcnicas colorimtricas y de quimioluminiscencia. El nmero de bandas de protenas con las que el suero reacciona es similar y la intensidad de la reactividad de la IgE tambin es similar
Conclusin

Las modificaciones introducidas en el perfil de protenas de las sojas de alto contenido en cido oleico no causan cambios significativos en el contenido de alrgenos en comparacin con la soja progenitora A2396. Estas modificaciones tampoco causan cambios significativos en el contenido total de protenas de las sojas de alto contenido en cido oleico. Consecuencias en la nutricin Un alimento genticamente modificado debe ser apropiado e inocuo y para comprobarlo es necesario determinar si es adecuado del punto de vista de la nutricin y si fomenta el crecimiento y el bienestar tpicos. En la mayora de los casos, esto se hace mediante la interpretacin de la modificacin gentica y de sus consecuencias y mediante el anlisis de la composicin del alimento. La composicin de todas las plantas genticamente modificadas en las que se introdujeron cambios en las caractersticas agronmicas (por ejemplo tolerancia a los herbicidas) que se han aprobado hasta la fecha es equivalente a la de su homologo convencional. Los estudios de alimentacin animal con piensos obtenidos a partir de plantas genticamente modificadas aprobadas han demostrado que sus propiedades nutritivas son equivalentes a las del pienso obtenido de organismos que no estn modificados genticamente. Los estudios efectuados indican que si se ha comprobado que la composicin de las variedades genticamente modificadas es equivalente a la de su homologo convencional, los estudios de alimentacin con especies de animales domsticos objetivo aadir poca informacin a la evaluacin de inocuidad y, en general, no se justifican. (OCDE 2003). Algunas plantas, sin embargo, se han modificado con el fin de alterar significativamente su composicin o la biodisponibilidad de nutrientes, y por lo tanto sus propiedades nutritivas. En estos casos, la comparacin de las propiedades nutritivas utilizando nicamente la composicin no siempre es posible ya que puede

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no haber un organismo adecuado con el cual comparar. Por eso en estos casos, los estudios de alimentacin con una o ms especies objetivo resultan tiles para demostrar la salubridad del alimento en los animales en estudio. En las sojas de alto contenido en cido oleico se han introducido deliberadamente cambios significativos en la composicin del alimento. La empresa que solicit la aprobacin efectu dos estudios de alimentacin en animales con el fin de comparar la salubridad de las sojas de alto contenido en cido oleico con la de las sojas control. Tambin efectu un estudio para estimar las consecuencias del punto de vista de la nutricin de la ingestin de sojas de alto contenido en cido oleico por parte del ser humano.
Estudios de alimentacin en animales

Estudio de alimentacin en cerdos El objetivo del estudio fue comparar las tasas de crecimiento de cerdos alimentados con harina de soja obtenida a partir de sojas de alto contenido en cido oleico y las de cerdos alimentados con harinas de sojas de variedades tradicionales. El estudio se efectu con 390 cerdos (divididos en 10 grupos de 39 cerdos cada uno) de hbridos Newsham con altas tasas de crecimiento y poca grasa. Las dietas se formularon con harina de soja elaborada a partir de sojas de alto contenido en cido oleico o a partir de una soja estndar. Las sojas empleadas en la elaboracin de las harinas se trataron con cuatro rangos distintos de temperaturas (80-85, 85-90, 90-95, 100-105 C) en condiciones que simulan la elaboracin comercial. Tambin se utilizaron dietas control positivo y negativo con harinas de soja comerciales (46,5% de protena cruda). La dieta del control positivo se formul con 1,3% de lisina, la de control negativo con 0,95% de lisina. Adems todas las dietas de prueba se formularon con 0,95% de lisina de forma tal que toda diferencia de crecimiento pudiera atribuirse rpidamente a la temperatura de elaboracin o a la disponibilidad de aminocidos. Todos los cerdos del estudio se alimentaron con la misma dieta en series de 3 etapas hasta que se comenz a alimentarlos con las dietas de prueba a los 21 das post destete. Todos los cerdos se alimentaron con mezclas de harina de maz y de soja hasta el da 38 post destete. El crecimiento se midi con el promedio de la ganancia de peso diaria (G) y con la relacin I/G, donde I es el promedio de ingesta de pienso diaria, es decir el promedio de la ingesta de pienso diaria dividido entre el promedio de la ganancia de peso diaria. Esta relacin indica cuanto pienso debe ingerir el cerdo (en libras) para ganar una libra de peso corporal.
Cuadro 15. Efecto de la harina de soja y de la temperatura de elaboracin en la relacin I/G. Da 0 - 7
Harina comercial: 1,3% de lisina 0,95% de lisina Harina de soja de alto contenido en cido oleico (0,95% de lisina): 80-85C 85-90C 1,44 1,71 2,38 1,72 1,84

Da 7 - 14
1,49 1,74 2,42 1,84 1,74

Da 14 - 17
1,69 1,92 3,56 1,96 1,83

Da 0 - 17
1,50 1,75 2,49 1,80 1,78

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90-95C 100-105C Harina de soja estndar (0,95% de lisina): 80-85C 85-90C 90-95C 100-105C

1,79

1,86

1,86

1,83

1,75 1,92 1,82 1,95

1,86 1,79 1,82 1,80

2,03 1,86 1,87 2,28

1,84 1,83 1,81 1,91

La relacin I/G y la ganancia de peso diaria del control positivo (harina de soja comercial que se formul con un 1,3% de lisina) aumentaron en mayor proporcin que las de todos los otros grupos de cerdos alimentados con las otras dietas. En consecuencia la ganancia de peso diaria mxima no se obtiene con dietas formuladas con un 0,95%. Las tasas de crecimiento de los cerdos con dietas que contienen harina de soja de alto contenido en cido oleico elaborada con temperaturas superiores a 80-85 C fueron similares a las de los cerdos alimentados con harina de soja comercial o con harina de soja estndar cuyas formulaciones contienen porcentajes de lisina similares. No se sabe exactamente por qu la tasa de crecimiento de los cerdos alimentados con harina de soja de alto contenido en cido oleico elaborada a 80-85 C es menor a la de los cerdos del control. La empresa que solicit la aprobacin supone que la diferencia se debe a las dificultades durante la elaboracin de las sojas en la planta elaboradora piloto. Estudio de alimentacin en pollos El objetivo del estudio fue determinar el efecto de cinco temperaturas de elaboracin diferentes en el valor nutritivo de la soja progenitora y de las sojas de alto contenido en cido oleico. El estudio se efectu con 616 pollitos de engorde (Peterson x Arbor Acre) de un da divididos aleatoriamente en 11 grupos de 56 pollitos cada uno. Diez de las dietas se formularon con harina de soja obtenida a partir de la soja estndar o de alto contenido en cido oleico, elaboradas con cinco rangos de temperatura diferentes (cruda, 80-85, 85-90, 90-95, y 100-105 C). Tambin se formul una dieta control positiva con harina de soja comercial de alto contenido de protenas. Las dietas con harina de soja elaborada con soja estndar o de alto contenido en cido oleico se formularon de forma de cumplir con todos los requisitos de nutricin excepto la concentracin de aminocidos. El control positivo contena 23% de protena cruda y 1,2% de lisina. Las dietas con harina de soja estndar o de alto contenido en cido oleico contenan 20% de protena cruda y 1,03% de lisina. Se midi la tasa de crecimiento utilizando la ganancia de peso diario promedio, la tasa de conversin del pienso (ingesta:ganancia) y el peso final.

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Cuadro 16: Efecto de la temperatura de elaboracin y de la crecimiento de los pollitos. Ganancia Ingesta Ingesta:gana diaria 0-18 das (g) ncia 0-18 das (g) 0-18 das (g)
Soja cruda: comercial De alto contenido en cido oleico Estndar 80-85 C De alto contenido en cido oleico Estndar 85-90 C De alto contenido en cido oleico Estndar 90-95 C De alto contenido en cido oleico Estndar 100-105 C De alto contenido en cido oleico Estndar 26,95 15,35 17,57 37,86 30,25 33,28 1,417 1,953 1,897

fuente de la harina de soja en el Peso corporal 0-7 das (g)


148,2 101,8 111,4

Peso corporal 0-18 das (g)


525,1 316,3 356,2

23,60 23,85

36,66 38,19

1,570 1,598

129,6 134,7

464,8 469,3

24,96 22,51

38,83 34,96

1,558 1,561

136,5 129,5

489,3 445,1

25,71 23,66

39,53 36,95

1,540 1,564

145,4 126,8

502,7 465,9

24,03 22,40

39,07 35,89

1,628 1,604

135,0 122,4

472,5 443,3

La ganancia de peso diario promedio, la tasa de conversin del pienso (ingesta:ganancia) y el peso final de los pollitos alimentados con dietas con 1,2% de lisina (harina de soja comercial) son superiores a los de los pollitos alimentados con las otras dietas. Es muy probable que esta diferencia se deba al bajo contenido de aminocidos de las otras dietas, aunque tambin puede ser una consecuencia de las distintas temperaturas de elaboracin. No se observaron diferencias significativas en la tasa de crecimiento, es decir la ganancia de peso diario promedio, la tasa de conversin del pienso (ingesta:ganancia) y el peso final, entre los pollitos alimentados con harinas de la soja progenitora y con harinas de soja de alto contenido en cido oleico. Conclusin Los estudios de alimentacin se disearon de forma de evaluar los efectos del tipo de soja y de otros parmetros (por ejemplo, contenido de lisina y temperatura de elaboracin) sobre el crecimiento lo que dificulta la interpretacin de los resultados. No obstante, los resultados de ambos estudios demuestran que las sojas de alto contenido en cido oleico fomentan el crecimiento normal y el bienestar de cerdos y pollos de forma equivalente a las sojas comerciales. Consecuencias en la nutricin del ser humano La empresa solicit la autorizacin para efectuar un estudio con el fin de evaluar las consecuencias de la ingestin de aceite de soja de alto contenido en cido oleico en la nutricin del ser humano. El efecto de este aceite en el balance de lpidos de la dieta

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del ser humano se analiz con datos de encuestas sobre nutricin y dieta realizadas en ciudadanos adultos del Reino Unido. La composicin de cidos grasos del aceite de soja de alto contenido en cido oleico se compar con la de los aceites para frer y las grasas de repostera provenientes de Europa y de los Estados Unidos. Los hallazgos ms importantes de las comparaciones son:

El contenido de cidos grasos en el aceite de soja de alto contenido en cido oleico es similar al de los aceites sin hidrogenar o ligeramente hidrogenados y es bastante menor al de la mayora de las grasas de repostera europeas, el aceite de soja de alto contenido en cido oleico contiene ms cidos grasos n-6 poliinsaturados (especialmente cido linoleico) que los aceites para frer con contenidos similares de cidos grasos monoinsaturados, el aceite de soja de alto contenido en cido oleico contiene cantidades similares de cidos grasos n-3 poliinsaturados (especialmente cido linolnico) que los otros aceites para frer, El aceite de soja de alto contenido en cido oleico no contiene ninguno de los ismeros trans de los cidos grasos insaturados de muchas grasas de repostera comerciales.

El anlisis de la dieta se efectu en dos modelos suponiendo que el aceite de soja de alto contenido en cido oleico sustituye a todos los aceites de los aperitivos aromatizados, patatas fritas y otros aperitivos en base a patatas u otros vegetales. Tambin se asumi que el aceite de frer corresponde al 17% del total de los lpidos en carnes, huevos y pescados fritos. La composicin de los lpidos endgenos en los alimentos de origen animal fritos es desconocida y se estim restando el contenido de cidos grasos de un aceite de frer de composicin conocida al contenido de cidos grasos total de cada uno de estos alimentos. El modelo I, el peor caso, parte de la base que todas las carnes, los huevos y los pescados se fren en un aceite de maz de alto contenido en cidos grasos poliinsaturados n-6 (52,8%). El segundo modelo, un tanto ms real, parte de la base que el aceite es una mezcla de palmoleina y colza (80:20) con 12,3% de cidos grasos poliinsaturados n-6. Se espera que el aceite de soja de alto contenido en cido oleico comercial contenga 2,2% de cidos grasos poliinsaturados n-6, pero el contenido de estos cidos puede variar segn las condiciones del cultivo y se han registrado partidas con contenidos de hasta 0,9% en ciertas condiciones de campo. En el modelo I se supuso que el aceite de soja de alto contenido en cido oleico contiene 0,9% de cidos grasos poliinsaturados n-6, en el modelo II 2,2%.

Cuadro 17: Efecto de la sustitucin de todos los aceites y grasas empleadas en los hogares y comercialmente para frer por aceite de soja de alto contenido en cido oleico (medias desviacin estndar).

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% de energa de:

Uso del aceite de soja de alto contenido en cido oleico Dieta actual1 Modelo I Modelo II
16,61 3,44 14,97 2,98 0,73 0,23 3,89 1,98 2,15 0,83 16,43 3,43 14,68 2,86 0,78 0,23 4,33 1,92 2,12 0,83

17,24 3,44 cidos grasos saturados 12,63 2,15 cidos grasos monoinsaturados 0,78 0,27 cidos grasos poliinsaturados n-3 5,51 2,15 cidos grasos poliinsaturados n-6 2,24 0,83 cidos grasos insaturados trans 1 No se emplea el aceite de soja de alto contenido en cido oleico.

El efecto de la utilizacin del aceite de soja de alto contenido en cido oleico en la ingestin de cidos grasos saturados es relativamente pequeo y equivale a un 5% de reduccin en el mejor de los casos, con poca diferencia entre los dos modelos propuestos. La ingesta de cidos grasos monoinsaturados aumentara un 19% en el mejor modelo, y casi no se observan diferencias entre los dos modelos. La ingesta de cidos grasos poliinsaturados n-6 se reduce un 29% en el modelo I y un 21% en el modelo II. Los resultados tambin demuestran que en ambos modelos la ingesta de cidos grasos poliinsaturados n-3 o de cidos grasos insaturados trans presenta pocos cambios o permanece constante. El uso del aceite de soja de alto contenido en cido oleico se puso en perspectiva efectuando el mismo anlisis pero sustituyendo todas las grasas y los aceites considerados por un aceite de oliva con poca cantidad de cidos grasos n-6 (79,3% de cidos grasos monoinsaturados, 0,7% de cidos grasos poliinsaturados n-3 y 6% de cidos grasos poliinsaturados n-6).
Cuadro 18. Comparacin del efecto de la sustitucin de todos las grasas y los aceites empleados para frer en la elaboracin de aperitivos aromatizados por un aceite de soja de alto contenido en cido oleico y un aceite de oliva (medias). Aceite
De alto contenido en cido oleico De oliva De alto contenido en cido oleico De oliva Dieta actual en el Reino Unido

Modelo
I I II II

Mono
15,7 15,6 15,1 15,0 12,6

% de energa de: Poli n-6 Poli n-3


3,2 3,3 4,2 4,3 5,5 0,8 0,7 0,8 0,8 0,8

saturados
16,6 16,7 16,1 16,2 17,2

El efecto de la sustitucin, en condiciones similares, de todas las grasas consideradas en el estudio por aceite de oliva con poca cantidad de n-6 es muy similar al del aceite de soja de alto contenido en cido oleico. El estudio concluy que si bien el uso del aceite de soja de alto contenido en cido oleico puede reducir en cierto grado la ingesta de cido linoleico (con un mximo absoluto del 29%), esta reduccin no es perjudicial para la salud pblica en lo que atae a las enfermedades cardiovasculares. Tambin se concluy que dicha reduccin se puede observar con muchos aceites para frer comerciales de bajo contenido en cidos poliinsaturados n-6, por ejemplo, el aceite de oliva.

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En referencia a las consecuencias en la nutricin, el estudio concluy de forma general que la sustitucin de grasas para frer por aceite de soja de alto contenido en cido oleico sea probablemente beneficiosa ya que este reduce la ingesta de cidos grasos saturados lo que probablemente reduzca los factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares. La conclusin general de este informe se extrapol al contexto australiano comparando los perfiles de cidos grasos en Australia y el Reino Unido segn encuestas nacionales sobre dieta, efectuadas recientemente. La extrapolacin indica que probablemente la magnitud de los cambios decrezca.
Cuadro 19. Comparacin del porcentaje promedio de energa obtenida de los cidos grasos en las dietas del Reino Unido y de Australia. Pas Media del % de energa segn el tipo de cido graso Mono saturados Poli
12,6 11,8 6,3 5,0 17,2 12,7

Reino Unido Australia

La reduccin en la ingesta de cidos poliinsaturados promedio en el Reino Unido supone una sustitucin del 100%. En la prctica, es poco probable que esto suceda y segn el informe las reducciones sucesivas del porcentaje de sustitucin provocan un aumento progresivo de la ingesta hasta alcanzar los valores originales. Si por ejemplo, se sustituye un 25% del aceite, el porcentaje de energa obtenido de cidos grasos poliinsaturados disminuye a 6%.

En el mercado australiano hay algunos aceites de alto contenido en cidos monoinsaturados disponibles o que lo estarn prximamente, obtenidos por mtodos de mejoramiento y tcnicas de seleccin tradicionales de girasoles y colzas. Estos aceites han reemplazado exitosamente una proporcin de las mezclas de aceite de palma que se utilizan en la elaboracin de alimentos y para frer en los hogares. El uso del aceite de oliva en los hogares tambin ha ganado popularidad.
Conclusiones

La informacin que se resumi en este estudio de caso se emple en la evaluacin de inocuidad en Australia y Nueva Zelandia. A continuacin se transcribe el resumen de la evaluacin de la soja de alto contenido en cido oleico efectuada por el Organismo de normas alimentarias de Australia y Nueva Zelandia. Las sojas G94-1, G94-19 y G168, tres sojas de una nueva variedad de alto contenido en cido oleico, un cido graso monoinsaturado, se obtuvieron transfiriendo una segunda copia del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados

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que componen el aceite en la semilla en desarrollo a una variedad de soja comercial de alto rendimiento (A2396). Esta insaturasa sintetiza el cido linoleico, el cido graso poliinsaturado ms importante del aceite de soja. La presencia de la segunda copia de este gen causa el "silenciamiento gnico" que anula la expresin de las dos copias del gen en cuestin. En el poroto de la soja el cido linoleico no se sintetiza y por lo tanto se acumula cido oleico. La soja se cultiva comercialmente en ms de 35 pases del mundo y se ha utilizado como alimento inocuo durante largo tiempo. El producto ms importante que se obtiene de la soja de alto contenido en cido oleico es el aceite que se utiliza principalmente para rociar panes y otros productos horneados y para frer. Este aceite tambin puede sustituir otras grasas y aceites termoestables , por ejemplo el aceite de soja o de colza hidrogenados o las mezclas de aceites de palmaoleina y otros aceites vegetales. Adems del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo se transfirieron otros dos genes. Uno de ellos codifica el marcador visual, un marcador colorimtrico, codifica la enzima glucuronidasa y se obtiene de la bacteria Escherichia coli. Este gen se emplea para seleccionar las plantas transformadas de las no transformadas. El otro gen que se transfiri codifica la enzima -lactamasa y confiere resistencia a algunos antibiticos -lactmicos, por ejemplo, la penicilina y la ampicilina. Este gen es un marcador que se emplea para seleccionar las bacterias transformadas de las que no lo estn durante las etapas de clonacin y recombinacin del ADN que se efectan en el laboratorio antes de transformar las clulas vegetales. No se cree que este gen que se usa como marcador selectivo presente problemas de inocuidad. Los genes transferidos se integraron de forma estable al genoma de las sojas de alto contenido en cido oleico y todas ellas permanecen incambiadas del punto de vista gentico y fenotpico durante muchas generaciones y en diversos ambientes. Los estudios exhaustivos efectuados con las sojas de alto contenido de cido oleico demuestran que ninguno de los genes transferidos codifica protenas, es decir que en estas sojas no se expresa ninguna protena nueva. La composicin de las sojas de alto contenido en cido oleico se compar con la de las sojas lite a partir de las cuales se obtuvieron. Se compararon los principales nutrientes, antinutrientes y sustancias txicas de las sojas as como tambin sus perfiles de protenas. La soja contiene lectina, una sustancia txica, y dos antinutrientes, un inhibidor de la tripsina y un fitato. Las concentraciones de lectina de las sojas de alto contenido en cido oleico si bien estn dentro de los rangos citados en la literatura, son ligeramente superiores a las de la soja control. Considerando que las lectinas se degradan rpidamente con el calor y que el ser humano no consume alimentos con soja cruda, los valores ligeramente elevados no son peligrosos. No se observaron diferencias en los contenidos de antinutrientes.

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Los contenidos de macro y micronutrientes y los valores aproximados (protenas y lpidos crudos, fibras y cenizas), los aminocidos, los cidos grasos, y las vitaminas y minerales e isoflavonas tambin se compararon. Los resultados confirman que el perfil de cidos grasos cambi significativamente en las sojas de alto contenido en cido oleico. La media de cido oleico aumento de 23,1% en la soja progenitora a 83,8% en las sojas de alto contenido de cido oleico y el contenido de cido linoleico promedio disminuy correlativamente de 55,4% a 2,2%. Tambin se constataron pequeas disminuciones de los contenidos de cidos palmtico y linolnico. Otros aceites comestibles importantes (por ejemplo el aceite de oliva, los aceites de girasol y de nabina de alto contenido en cido oleico) tambin tienen altos contenidos de cido oleico. No se considera que el consumo de grandes cantidades de cido oleico presente problemas de inocuidad. El anlisis de la composicin muestra que las sojas de alto contenido en cido oleico contienen trazas (inferiores al 1%) de un ismero del cido linoleico no esperado. La soja progenitora no contiene este ismero pero est presente en otros alimentos de consumo habitual, por ejemplo los aceites de soja hidrogenados y la materia grasa de la leche. No se considera que su presencia presente riesgos toxicolgicos o nutricionales. Las protenas de almacenamiento del poroto de la soja, muchas de las cuales son alrgenos naturales tambin se compararon. Si bien ninguna de las sojas de alto contenido en cido oleico expresa protenas nuevas, el perfil de protenas de almacenamiento de la semilla presenta pequeos cambios. Sin embargo, las pruebas de alergenicidad confirman que los cambios en el perfil de protenas no causan diferencias significativas entre los contenidos de alrgenos de las sojas de alto contenido en cido oleico y los de la soja progenitora (A2396). Los cambios en el perfil de protenas tampoco causan cambios significativos en el total de protenas de las sojas de alto contenido en cido oleico. El resto de la composicin de las sojas de alto contenido de cido oleico es equivalente a la de la soja progenitora y a otras variedades de soja comerciales. La soja de alto contenido en cido oleico se prob en dos estudios de alimentacin en cerdos y pollos. Los estudios confirman que la capacidad para fomentar el crecimiento y el bienestar del animal tpicos de estas sojas equivale a la de las sojas comerciales. Las consecuencias de sustituir las grasas para frer por aceite de soja de alto contenido en cido oleico del punto de vista de la nutricin en el ser humano se evaluaron en otro estudio. El aceite de soja de alto contenido en cido oleico puede disminuir en cierta medida la ingesta de cido linoleico (un mximo absoluto de 29%), pero esta disminucin no presenta riesgos para la salud pblica en lo referente a las enfermedades cardiovasculares. El estudio concluy de forma general que probablemente del punto de vista de la nutricin el aceite de soja de alto contenido en cido oleico sea beneficioso ya que con las dietas que incorporan estos aceites se

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ingieren menos cidos grasos saturados y esto probablemente reduzca los factores de riesgo de las enfermedades cardiovasculares. En conclusin, el perfil de cidos grasos de las sojas de alto contenido de cido oleico ha cambiado significativamente pero en trminos de inocuidad y de adecuacin nutritiva estas sojas se pueden comparar con las sojas que no han sido modificadas genticamente. De acuerdo con los resultados de esta evaluacin de inocuidad, Australia y Nueva Zelandia aprobaron en noviembre de 2000 los alimentos elaborados u obtenidos a partir de las sojas de alto contenido en cido oleico G94-1, G94-19 y G168.
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Estudio de caso 3: Evaluacin de la inocuidad de la soja genticamente modificada tolerante a herbicidas

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In-dice

Estudio de caso 3: Evaluacin de la inocuidad de la soja genticamente modificada tolerante a herbicidas 76 Prefacio 79 Nota sobre la calidad de la documentacin 79 Nota 80 Descripcin de la planta de ADN recombinante 80 Descripcin de la planta base y de su utilizacin como alimento 83 Referencias.......................................................................................................... 85 Descripcin del organismo u organismos donantes 88 Los genes donantes.............................................................................................. 88 Patogenicidad potencial del organismo donante ................................................... 89 Referencias.......................................................................................................... 90 Descripcin de la modificacin gentica 91 Descripcin del mtodo de transformacin .......................................................... 91 El plsmido PV-GMGT04 ................................................................................... 91 Referencias.......................................................................................................... 94 Caracterizacin de la modificacin gentica 96 Caracterizacin del inserto primario .................................................................... 96 Caracterizacin del inserto secundario ................................................................104 Secuencia de los extremos 5y 3del inserto primario..........................................109 Resumen.............................................................................................................111 Referencias.........................................................................................................112 Estabilidad gentica de la caracterstica introducida........................................113 Transferencia Southern ...................................................................................113 Herencia .........................................................................................................114 Conclusin .........................................................................................................115 Referencias.........................................................................................................115 Expresin - efecto...............................................................................................116 Materiales y mtodos......................................................................................116 Resultados y discusin....................................................................................117 Referencias.........................................................................................................119 Evaluacin de la posible toxicidad 121 Estudio de toxicidad por administracin de una nica dosis por va oral de la protena 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 en ratones ..121 Digestin de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 en jugos gstricos e intestinales simulados........................................................................122 Ausencia de homologa entre la protena 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 y otras toxinas proteicas ...............................................123 Conclusin .........................................................................................................124 Referencias.........................................................................................................124 Evaluacin de la posible alergenicidad 124 Inmunoreactividad con suero de individuos sensibilizados..................................125 Propiedades fisicoqumicas de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 ............................................................................................................125 Estabilidad en la digestin in vitro ......................................................................125 Anlisis de la secuencia de aminocidos .............................................................126 Prevalencia en los alimentos ...............................................................................126 Conclusin .........................................................................................................126

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Referencias.........................................................................................................127 Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional129 Anlisis de la composicin aproximada ..............................................................129 Composicin de aminocidos .............................................................................131 Composicin de cidos grasos ............................................................................132 Protenas del poroto de soja ................................................................................134 Contenido de antinutrientes ................................................................................134 Inhibidores de la tripsina ....................................................................................134 Anlisis de lectinas.............................................................................................135 Anlisis de isoflavonas .......................................................................................136 Anlisis de estaquiosa, rafinosa y fitatos en la harina de soja ..............................137 Biodisponibilidad de nutrientes: confirmacin con estudios de alimentacin de animales .............................................................................................................138 Referencias.........................................................................................................141

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Prefacio

Este modulo ha sido elaborado con el fin de proveer a las autoridades reglamentarias con las herramientas prcticas necesarias para evaluar la inocuidad de los alimentos genticamente modificados. El enfoque utilizado es el del marco reglamentario canadiense para productos de la biotecnologa y las polticas de Health Canada. No obstante, los conceptos coinciden con los descritos en los documentos de consenso internacional elaborados por la Organizacin de Cooperacin y Desarrollo Econmicos (OCDE), la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) y la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO). Generalmente, la solicitud de aprobacin incluye documentacin que respalda la evaluacin de un alimento genticamente modificado. El estudio de caso de la soja (Glycine max) genticamente modificada GTS 40-3-2 y de su progenie se diseo de forma de ejemplificar la informacin que se incluye en el expediente con el fin de respaldar la solicitud de aprobacin del producto en cuestin. Se incluyen asimismo citas textuales de la solicitud de evaluacin de inocuidad del alimento que se present ante las autoridades reglamentarias del Canad, del Reino Unido y de los Estados Unidos.
Nota sobre la calidad de la documentacin

El estudio de una solicitud de evaluacin de un alimento genticamente modificado se puede comparar a la revisin de una publicacin que efectan los pares antes de publicarlo en una revista de divulgacin cientfica. Por consiguiente, es necesario que la calidad del texto y de la informacin que se presenta cumpla con los requisitos necesarios. Es necesario describir los procedimientos experimentales en detalle (o incluir las referencias correspondientes) de forma tal que se pueda reproducir la metodologa. Es necesario observar las reglas gramaticales y de uso evitando emplear la jerga del laboratorio. Asimismo, se recomienda adoptar los estndares internacionales de nomenclatura, por ejemplo, los de la Nomenclatura bioqumica y documentos conexos de la Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular [(1992) 2a ed. Portland Press, Inc., Chapel Hill, NC ], que incluye las reglas de nomenclatura de aminocidos, pptidos, cidos nucleicos, polinucletidos, vitaminas, coenzimas, quinonas, cido flico y compuestos relacionados, corrinoides, lpidos, enzimas, protenas, ciclitoles, esteroides, carbohidratos, carotenoides, hormonas peptdicas e inmunoglobulinas humanas, de la Unin Internacional de Bioqumica. Tambin es necesario incluir los nombres qumicos correctos, especificar las cepas de los organismos e identificar las marcas comerciales. Por ltimo, se recomienda utilizar siempre que sea posible los smbolos y unidades del Sistema Internacional. Por otra parte, las ilustraciones, los cuadros y las figuras deben ser claros y legibles. Se recomienda incluir tambin dibujos originales, fotografas de alta calidad o impresiones lser y evitar reproducciones de baja calidad que a menudo son consecuencia del fotocopiado. Las reproducciones de geles o de transferencias, en particular, deben permitir mostrar claramente los resultados descritos.

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Nota

Monsanto Camada Inc. ha permitido que se utilice la informacin de varias de las solicitudes reglamentarias de la soja GTS 40-3-2 como herramienta de capacitacin. Sin embargo, es necesario recordar que, con el fin de emplear el estudio de caso como herramienta de capacitacin, hemos hecho uso de ciertas licencias con respecto a la informacin proporcionada en las solicitudes originales. Ciertas partes se han condensado en resmenes y la informacin presentada en este estudio de caso es slo una parte de toda la informacin de la solicitud original. El estudio de caso no constituye de ninguna manera una solicitud completa y tampoco debe considerrselo una evaluacin de inocuidad exhaustiva. La utilizacin de la informacin aqu presentada como herramienta de capacitacin no refleja necesariamente su aprobacin ni tampoco la del producto. Tampoco refleja ninguna de las solicitudes originales.
Descripcin de la planta de ADN recombinante

La soja se planta comercialmente en ms de 80 pases y se cosechan 162 millones de toneladas mtricas. En el ao 2000 los productores ms importantes de soja eran los Estados Unidos, Brasil, China, Argentina, India, Canad y Paraguay. El producto principal de la soja es el poroto, su semilla, que se utiliza como alimento y en la industria y constituye una de las fuentes principales de aceite vegetal comestible y de protenas para piensos de animales. En los Estados Unidos y en Europa uno de los principales usos alimenticios de la soja es el aceite purificado que se emplea en margarinas, grasas de repostera y como aceite de cocinar y para ensaladas. Adems, la soja es uno de los ingredientes principales de algunos productos alimenticios, por ejemplo, la cuajada de soja (tofu), el tempeh, la salsa de soja, los sucedneos de la leche y de las carnes y es un ingrediente de menor importancia en muchos alimentos elaborados. La harina de soja se emplea como suplemento en raciones y piensos. Las malezas constituyen uno de los principales problemas productivos del cultivo de la soja. Generalmente, el manejo de las malezas se hace combinando mtodos qumicos y de cultivo (por ejemplo, la preparacin de la tierra, la utilizacin de semilla limpia, la seleccin de la variedad y la fecha de siembra). Segn el rea del cultivo y la especie de maleza predominante, se utilizan herbicidas pre siembra (por ejemplo pendimetalina, trifluralina, metribucina) post siembra pero pre emergencia (por ejemplo pendimetalina, linuron, imacethapyr), y post emergencia (por ejemplo bentazon, acifluorfen, fomesafen). En general, es necesario utilizar varios herbicidas para controlar eficazmente las malezas en las chacras de soja. La soja GTS 40-3-2 se desarroll de forma de permitir utilizar el glifosato, el ingrediente activo del herbicida Roundup, para controlar las malezas. La aplicacin de glifosato causa la muerte de la planta pero esta soja genticamente modificada contiene una forma de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa, una enzima que permite que la planta sobreviva a la aplicacin del herbicida. El gen que codifica esta enzima que se introdujo en la soja GTS 40-3-2 se aisl de una cepa de una bacteria

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comn en el suelo Agrobacterium tumefaciens, denominada CP4 que produce una forma de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa resistente al glifosato. La 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa cataliza una de las etapas de la ruta del siquimato, una importante ruta bioqumica de los vegetales responsable de la sntesis de aminocidos aromticos y de otros compuestos aromticos. La aplicacin de glifosato a las plantas sin modificar impide la sntesis de los aminocidos aromticos necesarios para su crecimiento y supervivencia. La 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa se encuentra presente en todos los vegetales, hongos y bacterias, pero no est presente en los animales ya que estos no sintetizan sus propios aminocidos aromticos. La toxicidad del glifosato para mamferos, aves o peces es leve o inexistente debido a que estos no sintetizan aminocidos aromticos. Generalmente, la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa se encuentra presente en los alimentos de origen vegetal o microbiano. La soja GTS 40-3-2 se obtuvo introduciendo a una variedad de soja comercial el gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 por aceleracin de partculas (biolstica). Luego se utilizaron los mtodos de mejoramiento convencionales para transferir la tolerancia a herbicidas de la soja GTS 40-3-2 a ms de mil variedades de soja comerciales. En 1991 comenzaron los ensayos de campo con la soja GTS 40-3-2 en los Estados Unidos, en Amrica Central, en Amrica del Sur y en el Canad. Los datos recabados en ms de 150 ensayos de campo efectuados en los tres aos previos a la comercializacin de esta soja en los Estados Unidos demuestran que la morfologa, el rendimiento (de semilla), las caractersticas agronmicas (por ejemplo la fecha de floracin y la insercin de la vaina o el vigor) y la tendencia al enmalezamiento de la soja GTS 40-3-2 no presentan diferencias significativas en comparacin con las sojas convencionales. No se observ que la soja GTS 40-3-2 tuviera consecuencias negativas sobre otros organismos benficos o distintos al objetivo y no se espera que tenga consecuencias para las especies amenazadas o en peligro de extincin. En el rea continental de los Estados Unidos y en el Canad no existen especies de malezas emparentadas con la soja que pudieran ser susceptibles de cruzamientos. La soja que se cultiva se puede cruzar naturalmente con la especie G. soja silvestre, sin embargo la G. soja cuyo hbitat es China, Corea, Japn, Taiwan y en la ex Unin Sovitica, no se ha naturalizado en Amrica del Norte. Por otra parte, la soja casi siempre se autopoliniza y en la soja GTS 40-3-2 no se modificaron las caractersticas reproductivas de la planta, por ejemplo la produccin de polen y su viabilidad. En conclusin, en ecosistemas gestionados por el hombre el potencial de transferencia de la caracterstica resistente al glifosato de una soja transgnica a otras sojas por flujo de genes (cruzamientos externos) es despreciable y en el Canad y en los Estados Unidos el potencial de transferencia a especies silvestres es nulo. La inocuidad de la soja GTS 40-3-2 en alimentos y piensos se determin evaluando: la similitud entre la estructura y la funcin de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y las de la enzima que se encuentra presente de forma natural

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en los alimentos y piensos; la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 es slo una pequea parte de la protena total de la soja GTS 40-3-2 y por lo tanto la exposicin a travs de la dieta es pequea; la ausencia de toxicidad y alergenicidad de las protenas 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de los vegetales, las bacterias y los hongos; y con ensayos de laboratorio efectuados directamente con la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. No se observaron diferencias significativas entre los contenidos de nutrientes esenciales, incluidos los valores aproximados (por ejemplo, protenas, lpidos, fibras, cenizas y carbohidratos) o de los antinutrientes de la soja GTS 40-3-2 y los de las sojas convencionales. Los estudios de alimentacin efectuados con ratas, pollos de asar, vacunos y peces confirman la inocuidad y la calidad nutritiva de la soja GTS 40-3-2 como alimento y pienso. En los Estados Unidos, la soja GTS 40-3-2 se aprob de forma reglamentaria por primera vez en 1994 (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos), desde entonces 17 pases y la Unin Europea aprobaron su liberacin al medio ambiente y su utilizacin en alimentos y piensos (Cuadro 1). En 1996 la superficie plantada con soja genticamente modificada tolerante al glifosato fue inferior al 5% de la superficie total que se dedica a la soja en los Estados Unidos. En el ao 2000, el 54% de la soja plantada, aproximadamente 40 de los 75,4 millones de acres de soja que se plantan en los Estados Unidos, fue soja genticamente modificada tolerante al glifosato. En el mismo ao en Argentina, pas en el cual se cree que el 95% de la soja es genticamente modificada tolerante al glifosato, se plantaron ms de 20 millones de acres. La soja genticamente modificada tolerante al glifosato representa el 58% de todos los cultivos transgnicos que se plantan en el mundo. Cuadro 1. glifosato. Pas Aprobacin reglamentaria de la soja GTS-40-3-2 tolerante al Medio ambiente (ao) 1996 1998 1995 Pienso alimento (ao) 1996 2000 1998 1996
2004 2001 1996 1998 1996 2000 1998 2003 1999 2001 1996 2002 1996 1994 1997

o Venta comercial (ao)

Argentina Australia Brasil Canad


China Repblica Checa Unin Europea Japn Corea Mjico Filipinas Rusia Sudfrica Suiza Taiwan Reino Unido Estados Unidos Uruguay

2001 1996

1999

2001

1994 1997

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Descripcin de la planta base y de su utilizacin como alimento

El gnero Glycine Willd. de la familia Leguminosae, subfamilia Papilionoideae, tribu Phaseoleae es originaria de Asia y Australia (Lackey, 1981). El gnero Glycine se divide en dos subgneros: Glycine y Soja (Moench) F. J. Herm. Doce especies perennes silvestres integran el subgnero Glycine (Hymowitz et al. 1991) con amplios patrones de distribucin: Australia, las Islas del Pacfico Sur, las Islas del Pacfico Central Occidental, China, Papua Nueva Guinea, las Filipinas y Taiwan (Hermann, 1962; Newell y Hymowitz, 1978; Hymotitz y Newell, 1981; Grant et al. 1984a, 1984b; Tindale 1984, 1986a, 1986b). El subgnero Soja incluye, entre otras, dos especies anuales: la soja cultivada, G. max (L.) Merrill, y su pariente silvestre ms cercano, G. soja Sieb. y Zucc., cuya distribucin incluye China, Taiwan, Japn, Corea y la ex Unin Sovitica. La soja es una especie cultivada de la familia de las leguminosas, erecta, arbustiva, con ciclos anuales, de entre 0,3 y 1,2 metros de altura y tallos pilosos con hojas trifoliadas. Las flores son generalmente blancas o moradas, pequeas y se distribuyen en racimos axilares. Los rganos florales masculinos y femeninos se encuentran rodeados por la corola. Las vainas contienen generalmente tres semillas esfricas u ovaladas que pesan entre 0,1 y 0,2 g. Hermann (1962) y Carlson y Lerston (1987) describen ms detalladamente la morfologa de la soja. Las especies del gnero Glycine son las nicas Phaseoleae diploides con 40 y 80 cromosomas pero no 20. Probablemente esta particularidad del nmero cromosmico de Glycine se deba a antepasados diploides con un nmero bsico de 11 cromosomas, que perdieron por aneuploida un cromosoma quedando con 10 cromosomas de base (Lackey 1988). Solo 10 de los 71 gneros de leguminosas se consideran completamente poliploides y Glycine es uno de estos diez (Senn, 1938). La soja debe considerarse un tetraploide estable con un genoma diploide (Gurley et al. 1979; Lee y Verrna 1984; Skorupska et al. 1989). La soja es oriunda de China. Se encuentran referencias a la soja en libros de la historia temprana de China escritos hace ms de 4500 aos (Hymowitz y Singh 1987). Se cree que la soja se domestic en la mitad oriental del norte de China en el siglo XI ac o quizs ms temprano (Hymowitz 1970) y su cultivo se expandi ms tarde al resto del sudeste asitico. La soja se introdujo en Europa Occidental aproximadamente en el siglo XVIII (Wolf 1983), a pesar de lo cual la produccin de soja hoy en da en Europa representa menos del 2% de la produccin mundial. (Oil World Annual 1992). La soja se introdujo en los Estados Unidos en 1765 (Hymowitz y Harlan 1983), como un cultivo forrajero dedicado especialmente a heno y silos. Entre 1900 y 1910 el cultivo exitoso de la soja para la produccin de aceite en Europa promovi el inters por su utilizacin en los Estados Unidos. Si bien el inters por el cultivo de la soja aument en las dcadas de 1920 y 1930, la mayora de la superficie cultivada se destinaba a forraje. En la dcada de 1940 se comercializaron los primeros cultivares estadounidenses seleccionados por polinizacin cruzada planificada. Los cultivares de las primeras poblaciones obtenidas por hibridacin se emplearon como progenitores de otras poblaciones para continuar la seleccin. Hasta hoy en da se seleccionan los individuos que presentan caractersticas sobresalientes

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de un ciclo de produccin para utilizarlos como progenitores de ciclos subsiguientes (Burton 1987). En los Estados Unidos el cultivo de la soja se expandi rpidamente en los ltimos cincuenta aos. La produccin de soja se concentra en la regin del centro oeste y en el valle del ro Mississippi (Hazera y Fryar 1981). Adems de los Estados Unidos (donde se cosecharon 59,8 millones de toneladas mtricas en la zafra 1992 y 93), hoy en da las principales regiones productoras de soja son Brasil (21,3 toneladas mtricas), Argentina (11,7 toneladas mtricas ), la Repblica Popular de China (9,7 toneladas mtricas) e India (Departamento de Agricultura de los Estados Unidos 1993). En Brasil, los estados de Ro Grande del Sur, Paran y el Mato Grosso son los mayores productores de soja, en Argentina las provincias de Sante Fe, Buenos Aires y Crdoba. En Europa Occidental, los principales productores de soja son Italia (entre 0,2 y 0,4 millones de hectreas) y Francia (entre 0,05 y 0,15 millones de hectreas). En Grecia y Espaa la soja se planta ocasionalmente. En Francia el cultivo de la soja se realiza principalmente en el sudoeste y en el valle del ro Loira. En Italia, en el valle del ro Po, especialmente en el delta y a lo largo de la costa de la regin de Veneto. Europa es uno de los principales importadores de soja del mundo. La soja contiene varios antinutrientes naturales (Rackis 1974; Orthoefer 1978). Si bien la elaboracin con la temperatura adecuada inactiva los inhibidores de la tripsina (proteasa) estos poseen propiedades antinutritivas segn se comprob en animales alimentados con soja sin elaborar (Rackis 1974; Rackis et al. 1986). Aunque no existen pruebas contundentes respecto al rol antinutritivo de la hemaglutinina de la soja (Rackis 1974), in vitro causa la aglutinacin de los glbulos rojos (Leiner, 1953). En mamferos, la genistena, la daidceina y el coumesterol, fitoestrgenos naturales de la soja son compuestos activos del punto de vista bioqumico, con incluso actividad estrognica e hipocolesterolmica (Wang et al. 1990; Murphy 1982). La estaquiosa y la rafinosa, carbohidratos de bajo peso molecular, causan flatulencia (Rackis 1974). El cido ftico (fitato) puede disminuir la disponibilidad de minerales ya que en la soja forma un complejo de calcio, magnesio y potasio insoluble y no disponible del punto de vista nutritivo (Orthoefer 1978; Mohamed et al. 1991). La soja causa alergias alimentarias en ciertos individuos (Burks et al. 1988). Si bien las protenas de la soja especficas que causan reacciones alrgicas no se han identificado o caracterizado especialmente, en general se las ha caracterizado por inmunotransferencia (Bush et al. 1988; Shibasaki et al. 1980). Con esta tcnica se han identificado bandas de protenas especficas que reaccionan con el anticuerpo IgE de una mezcla de sueros de un grupo de individuos sensibles a la soja. El nmero de protenas alrgenas vara segn el pas donde habitan los individuos de quienes se obtuvo el suero, variacin que probablemente refleje la cuota parte de los productos de soja en sus dietas. En los Estados Unidos un estudio con inmunotransferencia constat (Bush et al. 1988) la presencia de 9 protenas alrgenas diferentes, en Japn, con el mismo procedimiento (Shibasaki et al. 1980) se concluy que probablemente existan 15 protenas alrgenas diferentes.

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G. max L. cv. A5403 ( en adelante A5403), el cultivar que se modific genticamente insertndole la tolerancia al glifosato, es un cultivar del grupo de madurez V, que combina un potencial de alto rendimiento constante con la resistencia a los tipos 3 y 4 de Heterodera glycines. Esta planta tiene flores color morado, con pubescencia gris y vainas amarronadas. Las semillas son de color amarillo opaco con hila negra imperfecta. La soja A5403 tambin tiene buen porte, excelente emergencia y buena tolerancia a las enfermedades de la hoja y del tallo. Esta soja es uno de los primeros cultivares del grupo V resistente a Heterodera glycines que se distribuy a los agricultores y que recibi la proteccin de de United States Plant Variety Protection Act (la ley de proteccin de la variedad vegetal de los Estados Unidos). La estrategia de comercializacin de la soja GTS 40-3-2 consiste en transferir el locus del gen que confiere la tolerancia al glifosato de este cultivar a muchas otras variedades de sojas de otros grupos de madurez utilizando retrocruzas y tcnicas de mejoramiento convencionales. La soja se ha utilizado durante largo tiempo como alimento inocuo. La soja o los productos elaborados a partir de ella se utilizan en muchos alimentos y piensos y es una de las principales fuentes de aceite y protenas. En consecuencia, las caractersticas de la soja en general y ms especficamente del progenitor A5403, no justifican que se efecten pruebas analticas o toxicolgicas. Generalmente, el mejoramiento de la soja tiene por objetivo obtener nuevos cultivares con mayor valor comercial que se evalan especialmente segn el rendimiento, aunque tambin segn el contenido de aceite y de protena.
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Descripcin del organismo u organismos donantes
Los genes donantes

Las secuencias de ADN que se insertaron en la soja GTS 40-3-2 provienen de los siguientes organismos donantes: 1. Gen que codifica la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de Agrobacterium sp.: El terminal C de 1,36 kb del gen (Barry et al., 1992; Padgete et al., 1993). 2. Promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada (P-E35S): (Odell et al. 1985) (Kay et al., 1985). 3. Pptido de trnsito al cloroplasto de Petunia hybrida: El terminal N de 0,22 kb de la secuencia del pptido de trnsito al cloroplasto del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de P. hybrida (Shah et al., 1986). La secuencia del pptido de trnsito al cloroplasto se fusion con el terminal N del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 para llevar la protena al cloroplasto, organelo donde la sintetasa se activa y donde acta el glifosato. 4. Regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens (NOS 3): Esta secuencia que emite la seal de poliadenilacin para obtener una expresin estable, se aisl del plsmido Ti de A. tumefaciens (Fraley et al., 1983). Ninguna de las secuencias insertadas posee caractersticas patognicas o peligrosas. El plsmido PV-GMGT04 contiene las siguientes secuencias que no se integraron al genoma de la soja GTS 40-3-2: 1. Gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II (nptII): Este marcador bacteriano que permite efectuar la seleccin se aisl del transposn procariota

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Tn5 (Beck et al., 1982) y codifica la enzima neomicina fosfotransferasa. Esta enzima, que confiere resistencia a los antibiticos aminoglucsidos (por ejemplo, la kanamicina o la neomicina), se utiliza para seleccionar los plsmidos en Escherichia coli. El promotor de este gen solo se encuentra activo en las bacterias donantes. 2. lacZ: secuencia de codificacin parcial de lacI de E. coli, el promotor Plac y una secuencia de codificacin parcial de la -D-galactosidasa o la protena lacZ del vector pUC119 (Yanisch-Perron et al., 1985). 3. Regin promotora traducible 2 de la sintetasa de la manopina (P-MAS) de 0,42 kb (Velten et al. 1984). 4. Gen que codifica la protena marcadora fluorescente (GUS): regin de codificacin del gen de la beta-glucuronidasa de E. coli de 1,81 kb (Jefferson et al., 1986). En las plantas, la expresin de este gen se emplea como marcador de la transformacin que se puede medir. 5. Regin 3 sin traducir de la subunidad alfa de la protena de almacenamiento 7S (7s 3) del poroto de la soja de 0,43 kb (Schuler et al., 1982). 6. Promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV 35S) de 0,57 kb (Gowda et al., 1989).
Patogenicidad potencial del organismo donante

La soja A5403 solo contiene una nueva protena, la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa. El gen que codifica esta protena se aisl de la cepa CP4 de Agrobacterium sp., bacterias presentes naturalmente en el suelo. La bacteria donante no constituye una fuente de alimentos pero se encuentra asociada a microbios que estn presentes comnmente en el suelo y en la rizsfera de las plantas y todas las fuentes de alimentos vegetales, microbianas o micticas, contienen este tipo de protenas. Por lo tanto, ni la enzima ni su actividad constituyen una novedad en la cadena alimenticia. En varias muestras clnicas de seres humanos se ha detectado la presencia de Agrobacterium, pero se cree que en los pacientes estas ocurrencias aisladas de Agrobacterium son ocasionales o constituyen contaminantes introducidos durante la manipulacin de muestras (Kersters y De Ley, 1984). Las caractersticas de Agrobacterium, la especie donante, no justifican efectuar pruebas analticas o toxicolgicas ya que solo se transfiri a la soja la secuencia especfica que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa. No se considera pertinente suministrar informacin ms detallada respecto a la patogenicidad de otros organismos donantes para efectuar la evaluacin de riesgos de la soja GTS 40-3-2 ya que se constat que solo se transfiri el gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4.

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Referencias

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Descripcin de la modificacin gentica
Descripcin del mtodo de transformacin

El plsmido de ADN se introdujo en el genoma del cultivar A5403 de G. max mediante aceleracin de partculas (pistola de partculas) con la tcnica descrita por McCabe et al. (1988) y Christou et al. (1988). El ADN se precipit sobre partculas microscpicas de oro con una solucin de fosfato de calcio y luego se las sec con nitrgeno. Las partculas recubiertas se suspendieron en etanol y se extendieron sobre una lmina portadora de Mylar. La lmina de Mylar se aceler con fuerza de vaporizacin mientras se efectuaba una descarga de entre 10 y 15 kilovolts a travs de una gota de agua. La trayectoria de la lmina de Mylar se detuvo contra una pantalla de retencin en acero inoxidable permitiendo que las partculas recubiertas de ADN continen su trayectoria penetrando en las clulas vegetales objetivo. El ADN se deposit en las clulas y se incorpor al cromosoma. Las clulas transformadas se incubaron en un medio de cultivo de tejido vegetal con citoquinina y auxina para inducir la formacin de yemas. La enzima de la protena marcadora fluorescente convierte el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil beta-dglucurnido en un precipitado azul segn se constat con un mtodo de tincin. El ADN introducido contiene este gen que codifica la protena marcadora fluorescente cuya expresin se utiliza para seleccionar las clulas transformadas (Jefferson et al. 1986). La gran mayora de las yemas formadas a partir de clulas meristemticas del tallo no contenan genes adicionales y fue necesario identificar el tejido modificado genticamente con la protena marcadora fluorescente. Las yemas positivas se cultivaron y se seleccion su progenie segn la tolerancia al glifosato (determinada rocindola con el herbicida) y la expresin gnica.
El plsmido PV-GMGT04

El plsmido PV-GMGT04, que se emple para obtener la soja 40-3-2, contiene tres genes controlados por promotores vegetales: dos genes que codifican la 5-enolpiruvilsiquimato 3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 y un gen que codifica la betaglucuronidasa (la protena marcadora fluorescente) de E. coli. El plsmido PVGMGT04 es un vector pUC-Kan obtenido del plsmido pUC119 de mltiples copias de E. coli (Vieira & Messing 1987) que se construy fusionando el fragmento del

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plsmido pUC119 obtenido con una mezcla de las enzimas FspI y DraI de 1,3 kb con el origen de la replicacin, al fragmento obtenido con una mezcla de las enzimas SmaI y HindIII del pKC7 con Klenow de 1,3 kb (Rao y Rogers 1979), con el gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II. Este ltimo est controlado por un promotor bacteriano que impide su expresin en las clulas vegetales. Antes de combinar los genes que codifican la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y la protena marcadora fluorescente en un nico vector, se armaron con secuencias 3 y promotores en el orden que se describe a continuacin: La fusin del pptido de trnsito al cloroplasto 4 y la 5-enolpiruvil-siquimato 3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 con el promotor del virus del mosaico de la coliflor y con el terminador de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa (Fraley et al. 1983) y con el gen que codifica la protena marcadora fluorescente (fusionado con la regin promotora traducible 2 de la sintetasa de la manopina y con la regin 3 sin traducir de la subunidad alfa de la protena de almacenamiento 7S) en el vector pMON13615. El producto de la fusin del pptido de trnsito al cloroplasto 4 y la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 se combin con el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada y con el terminador de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa en el plsmido pMON13620 en el que el resultado de la fusin se rode de las secuencias de reconocimiento de HindIII para facilitar la clonacin subsiguiente. Luego estos tres elementos se combinaron en el plsmido pUC pMON13639 utilizando la subclonacin del resultado de la fusin del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada unido al pptido de trnsito al cloroplasto 4 con la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa del plsmido pMON13620. El fragmento de restriccin con NotI del plsmido pMON13639, que contiene la 5enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y la protena marcadora fluorescente, se transfiri al plsmido pMON10081, un derivado de pUC119 que contiene el origen de la replicacin de los plsmidos pUC y el gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II. El vector resultante se denomin PV-GMGT04 (Figura 1).

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Figura 1. Representacin esquemtica del plsmido PV-GMGT04 con los sitios de restriccin de las enzimas y la regin de la secuencia del plsmido que se insert en el genoma de la soja.

El anlisis exhaustivo de los sitios de restriccin del plsmido PV-GMGT04 y de los plsmidos progenitores demostr que todos los elementos genticos y los fragmentos de restriccin se armaron correctamente y produjeron fragmentos de ADN del tamao esperado (Eichholtz et al. 1993). El Cuadro 2 contiene un resumen de los elementos genticos empleados en el plsmido PV-GMGT04. La clonacin para construir el plsmido PV-GMGT04 se efectu en las cepas no patognicas LE392, JM101 y MM294 de E. coli.
Cuadro 2. Elementos genticos del plsmido PV-GMGT04.

Secuencia gentica
P-E35S CTP4

Tamao Kb
0,61 0,22

en

Funcin

Promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada.
Extremo N de 0,22 kb del pptido de trnsito al cloroplasto del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de Petunia hybrida. El extremo C de 1,36 kb del gen que codifica la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de una especie de Agrobacterium. Regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa de 0,26 kb. El Tn5 del gen que codifica la neomicina fosfotransferasa tipo II (nptII) del plsmido pKC7. El gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II confiere resistencia a la kanamicina.. Origen de la replicacin del plsmido pUC19 de E. coli de gran nmero de copias. Secuencia de codificacin parcial de lacI de E. coli, el promotor Plac y una secuencia de codificacin parcial de la -D-galactosidasa o la protena lacZ del vector pUC119. Regin promotora traducible 2 de la sintetasa de la manopina de 0,42 kb. Regin de codificacin del gen de la beta-glucuronidasa de E. coli de 1,81 kb. En las plantas, la expresin de este gen se emplea como marcador medible de la transformacin que se puede medir. Regin 3 sin traducir de la subunidad alfa de la protena de almacenamiento 7S del poroto de la soja de 0,43 kb. Promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia de 0,57 kb.

CP4 EPSPS NOS 3' KAN

1,36 0,26 1,32

ori-pUC LAC

0,65 0,24

P-MAS GUS

0,42 1,81

7S 3 CMoVb

0,43 0,57

La 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 es una protena de 47,6 kD que consiste en un solo polipptido de 455 aminocidos (Padgette et al. 1993), cuya secuencia se dedujo (ver Figura 2). La identificacin de los codones en las cuatro secuencias peptdicas de codificacin del gen que se obtuvieron directamente de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 purificada y activa como enzima demostraron sin lugar a dudas que el gen clonado es el gen que codifica esta protena de la cepa CP4 de Agrobacterium.

93

Figura. 2. Deduccin de la secuencia de aminocidos que codifica la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de Agrobacterium sp. del plsmido pMON17081.

Referencias

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Caracterizacin de la modificacin gentica
Caracterizacin del inserto primario

El nmero de sitios de insercin del ADN del plsmido PV-GMGT04 en la soja 40-32 se determin aislando ADN del genoma de la soja 40-3-2 y de la soja control A5403 (Dellaporta et al. 1983), se digirieron con SpeI y luego se hizo un Southern blot (Southern 1975) con una sonda PV-GMGT04 marcada con P32, sin sitios de restriccin de SpeI. En el ADN de la soja 40-3-2 se observa una nica banda de ADN de alto peso molecular que no se observa en la soja control (Figura 3, fajas 2 y 3). Esto indica que el ADN del genoma de la soja 40-3-2 contiene el ADN del plsmido PV-GMGT04 en un solo lugar. Adems se observan tres bandas adicionales de menor intensidad, tanto en la soja 40-3-2 como en la A5403, que representan secuencias naturales con hibridacin cruzada de la soja A5403.

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Figura 3. Southern blot del ADN del plsmido PV-GMGT04 digerido con BamHI (faja 1), el ADN del genoma de la soja control A5403 (faja 2) y el de la soja GTS 40-3-2 (faja 3) digeridos con SpeI. Cada faja representa aproximadamente 100 pg del ADN del plsmido o aproximadamente 5 ug del ADN del genoma. Se efectu una electoforesis de las digestiones con gel de agarosa al 0,8% y se transfirieron a una membrana de nylon a la que se agreg una sonda del ADN del plsmido PV-GMGT04 marcada con P32y se efectu una autorradiografa.

El nmero de sitios de insercin y el tamao aproximado de los insertos se determinaron con Southern blot con tres enzimas de restriccin especficas para el plsmido PV-GMGT04. Los ADN de los genomas de las sojas GTS 40-3-2 y A5403 se digirieron con BamHI, HindIII y EcoRI. A los fragmentos obtenidos de la digestin se les agreg una sonda de PV-GMGT04 marcada con P32. El Cuadro 3 contiene una lista de los fragmentos que se espera obtener de la digestin del plsmido PV-GMGT04 con BamHI, HindIII y EcoRI. Tambin incluye el tamao de las bandas observadas en la soja 40-3-2 (Figura 4, fajas 3, 5 y 7). El tamao del fragmento de la digestin del plsmido PV-GMGT04 con BamHI (Figura 4, faja 1), de 1,2 kb coincide con el tamao del fragmento del plsmido PV-GMGT04 esperado (Figura 4, faja 3). Las otras dos bandas de hibridacin (Figura 4, faja 3), cuyos tamaos no coinciden con ninguno de los fragmentos de la digestin del plsmido con BamHI, son restos formados por ADN del plsmido unido al ADN del genoma de la planta. La enzima HindIII corta el plsmido PV-GMGT04 en dos sitios, pero en la soja 40-3-2 solo se observa una banda de hibridacin (Figura 4, faja 5). Esto indica la ausencia de al menos uno, y de quizs los dos sitios de restriccin de la enzima HindIII en el inserto. La enzima EcoRI corta el fragmento de 1,2 kb de la 5 enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 del plsmido PV-GMGT04 digerido con BamHI en un sitio (ver Figura 1). La digestin del ADN de la soja 40-32 con EcoRI produce dos bandas (Figura 4, faja 7). Esto indica que la enzima EcoRI corta el gen que codifica la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 del inserto una vez y produce dos restos. La presencia de solo dos restos en la digestin del ADN de la soja 40-3-2 con BamHI, HindIII y EcoRI confirma que hay 97

un solo sitio de insercin. El tamao total de las bandas de hibridacin en las tres digestiones es inferior a 6 kb, es decir que el fragmento del plsmido PV-GMGT04 integrado al genoma de la planta tiene menos de 6 kb.
Cuadro 3. Digestin de la soja 40-3-2 y del plsmido PV-GMGT04.

Plsmido
3166 2375 1536 1188 1058

Tamao de los fragmentos (pares de bases)1 BamHI HindIII EcoRI 40-3-2 Plsmido 40-3-2 Plsmido 40-3-2
7959 2900 2552 1200 5800 2727 2503 3202 2900

1900 1646 350 403 1. Los tamaos de los fragmentos del plsmido PV-GMGT04 se calcularon (ver Figura 1). Los tamaos de los fragmentos de la soja 40-3-2 se estimaron comparando la migracin en gel con la de los marcadores de peso molecular. (Figura 4). No se incluyen las bandas experimentales y de control.

Figura 4. Southern blot del ADN del plsmido PV-GMGT04 digerido con BamHI (faja 1), de los de la soja control A5403 y de la soja 40-3-2 digeridos con BamHI (fajas 2 y 3, respectivamente), con HindIII (fajas 4 y 5, respectivamente) y con EcoRI (fajas 6 y 7, respectivamente). Cada banda representa 100 pg aproximadamente del ADN del plsmido o 5 ug aproximadamente del ADN del genoma. Se efectu una

electoforesis de los ADN con gel de agarosa al 0,8% y se transfirieron a una membrana de nylon a la que se agreg una sonda del ADN del plsmido PV-GMGT04 marcada con P32 y se efectu una autorradiografa.

El nico inserto de la soja 40-3-2 se caracteriz con la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y Southern blot. Origen de la replicacin de los plsmidos pUC

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La presencia del origen de la replicacin de los plsmidos pUC en los ADN de los genomas de las sojas 40-3-2, 61-137 y A5403 se determin con la reaccin en cadena de la polimerasa con oligonucletidos correspondientes a los extremos 5 y 3 del elemento gentico (Mullis y Faloona l987; McPherson et al. 1991). La soja 61-137 es una soja experimental tolerante al glifosato que se transform con el plsmido PVGMGT04 y se ha constatado que contiene las secuencias que corresponden al origen de la replicacin de los plsmidos pUC. Las bandas del ADN de la soja 61-137 y del plsmido PV-GMGT04 son de 671 pares de bases, el tamao esperado, (fajas 4 y 5). El ADN de la soja 40-3-2 y el de la soja control A5403 (fajas 2 y 3) no poseen bandas de este tamao. Por lo tanto, la soja 40-3-2 no contiene la secuencia ntegra del origen de la replicacin de los plsmidos pUC.

Figura 5. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar la presencia o ausencia de la secuencia del origen de replicacin de los plsmidos pUC en el ADN del genoma de la soja 40-3-2 y de la soja control A5403. Los controles positivos de ADN utilizados son el del plsmido PV-GMGT04 y el de la soja 61-137, una soja que contiene el origen de replicacin de los plsmidos pUC. Se crearon oligonucletidos 5 y 3 idnticos a los extremos 5 y 3del origen de la replicacin de los plsmidos pUC. Las reacciones se efectuaron con un volumen total de 100 ul que contena 100 pg de cada oligonucletido, 1 ug del patrn, dNTPs a 200 uM, 10 unidades de ADN Taq Polymerasa (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). El ciclo de amplificacin de la PCR consisti en 94C de desnaturalizacin durante 1 minuto y medio, templado a 55C durante 1 minuto y medio, y una extensin a 72C durante 3 minutos. El ciclo se repiti 24 veces. Los productos se separaron sobre un gel de agarosa al 1,25% y se visualizaron con tincin con bromuro de etidio. Las bandas que se observan en la parte inferior del gel corresponden a oligonucletidos no utilizados.

Gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II La presencia del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II en la soja 40-32 se detect con la PCR. Se emplearon cuatro oligonucletidos: los oligonucletidos 5 y 3 correspondientes a los extremos del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II, y los oligonucletidos 5 y 3 del interior del gen. Se analizaron los ADN de los genomas de las sojas 40-3-2, 61-137 y A5403 y el ADN del plsmido PV-GMGT04 se us como patrn. Los oligonucletidos se emplearon en cuatro combinaciones:: extremo 5 y extremo 3; extremo 5 y 3 interno; extremo 3 y 5 interno; y ambos cebadores internos. Los productos de la reaccin en cadena de la polimerasa del plsmido PV-GMGT04 (fajas 5 y 11) y de la soja 61-137 (fajas 6 99

y 12) poseen los tamaos correctos (ver Figura 6). Las sojas 40-3-2 (fajas 3 y 9) y A5403 (fajas 2 y 8) no poseen ninguno de los productos esperados con la reaccin en cadena de la polimerasa para determinar la presencia del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II. Por lo tanto, la soja 40-3-2 no posee una copia ntegra del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II.

Figura 6. PCR para determinar la presencia o la ausencia del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II del ADN del genoma de la soja 40-3-2. Los controles negativos empleados son las sojas A5403, 6167-1 y una soja experimental GTS que no contiene el gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II. Como controles positivos se emplearon los ADN del plsmido PV-GMGT04 y de la soja 61-137, una soja GTS que posee el gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II. Se emplearon cuatro oligonucletidos: se crearon dos oligonucletidos, uno 5 y uno 3 idnticos a los extremos del gen y dos oligonucletidos 5 y 3 idnticos a las secuencias internas del gen: extremo 5 del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II (nucletidos 10159 a 10140), extremo 5 interno del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II (nucletidos 10005 a 9988), extremo 3 del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II (nucletidos 9357 a 9370) y extremo 3 interno del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II (nucletidos 9511 a 9529). Los tamaos esperados de los productos son: A= extremo 5 + extremo 3, 802 pares de bases; B = extremo 5 + extremo 3 interno, 630 pares de bases; C = extremo 5 interno+ extremo 3 interno, 475 pares de bases y D = extremo 5 interno+ extremo 3, 631 pares de bases. Las reacciones se efectuaron con un volumen total de 100 ul que contena 100 pg de cada oligonucletido, 1 ug del patrn, dNTPs a 200 uM, 10 unidades de ADN Taq Polymerasa (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). El ciclo de amplificacin de la PCR consisti en desnaturalizacin a 94C durante 1 minuto y medio, templado a 63C durante 1 minuto y medio y una extensin a 72C durante 6 minutos. El ciclo se repiti 24 veces. Los productos se separaron sobre un gel de agarosa al 1,25% y se visualizaron con tincin con bromuro de etidio. Las bandas que se observan en la parte inferior del gel corresponden a oligonucletidos no utilizados.

Gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 Los ADN de los genomas de las sojas A5403 y 40-3-2 se digirieron con las enzimas HindIII y con una mezcla de BglII y EcoRI. La hibridacin se efectu con una sonda marcada con P32 especfica para la regin de codificacin del gen de la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. Una banda de 5,8 kb del ADN de la soja 40-3-2 digerido con HindIII se hibrid con el gen que codifica la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (Figura 7, lado A, faja 5), por lo tanto la soja 40-3-2 contiene el gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (o un fragmento de l). Esta banda de 5,8 kb tambin se observ en la

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Figura 4 (faja 5). Se esperaba que la sonda del gen que codifica la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 se hibridara con la banda de 2552 pares de bases del ADN del plsmido PV-GMGT04 cortado con HindIII (Figura 4.1). Sin embargo, no se observ ningn fragmento de este tamao en la soja 40-3-2. Por lo tanto, al menos uno de los sitios de restriccin de la enzima HindIII en el plsmido PV-GMGT04 no se transfiri a la soja 40-3-2. La digestin del ADN de la soja 40-32 con una mezcla de BglII y +EcoRI produjo una banda de 1,6 kb (Figura 7, lado A, faja 3) que se hibrid con la sonda del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4. Por lo tanto, la soja 40-3-2 contiene una copia ntegra del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4.

Figura 7. Transferencia Southern con el gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada como sondas. El ADN del plsmido PV-GMGT04 se digiri con la enzima BamHI (banda 1 de ambos lados). El ADN de la soja control A5403 se digiri con una mezcla de las enzimas BglII y EcoRI (lado A, faja 2), con HindIII (lado A, faja 4) y con BamHI (lado B, faja 2). El ADN de la soja GTS 40-3-2 se digiri con una mezcla de BglII y EcoRI (lado A, faja 3), con HindIII (lado A, faja 5) y con BamHI (lado B, faja 3). La soja GTS 61-67-1, control negativo para el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, se digiri con BamHI (lado B, faja 4). Cada faja representa aproximadamente 100 pg del ADN del plsmido o 5 ug aproximadamente del ADN del genoma. Se efectu una electroforesis de las digestiones con gel de agarosa al 0,8% y se transfirieron a una membrana de nylon y luego se agreg una sonda con ADN de la regin de codificacin del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (lado A), o del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada (lado B) marcadas con P32 y luego se efectu una autorradiografa. La marca ms pequea que se observa en la faja 1 del lado B es un punto en la transferencia, no una banda adicional.

Promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada Los ADN de las sojas A5403 y 40-3-2 digeridos con BamHI y con una sonda del ADN del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora

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duplicada marcada con P32 se estudiaron con Southern blot. La soja 40-3-2 contiene la secuencia del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada o una parte de ella (Figura 7, lado B, faja 3) y una nica banda de 2,9 kb que corresponde al resto que se observa en la Figura 4 (faja 3) mencionada. El promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada est ubicado en un fragmento de digestin del plsmido PV-GMGT04 con BamHI de 1536 pares de bases (Figura 1) pero no se encontr ningn fragmento de este tamao en la soja 40-3-2. Por lo tanto, esta soja no contiene el sitio de restriccin de BamHI en el nucletido 3160 (Figura 1).

Figura 8. Southern blot con la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa como sonda. El ADN del plsmido PG-GMGT04 se digiri con una mezcla de las enzimas HindIII y EcoRI (faja 1) y con una mezcla de BglII y EcoRI (faja 6). El ADN del genoma de la soja control A5403 se digiri con una mezcla de EcoRI y BglII (fajas 2 y 7), con una mezcla de HindIII y EcoRI (faja 4), y con HindIII (faja 9). La soja GTS 40-3-2 se digiri con una mezcla de BglII y EcoRI (fajas 3 y 8), con HindIII y con EcoRI (faja 5) y con HindIII (faja 10). La soja GTS 61-67-1, control positivo para la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa se digiri con HindIII (faja 11). Cada banda representa aproximadamente 100 pg del ADN del plsmido o 5 ug aproximadamente del ADN del genoma. Se efectu una electoforesis de las digestiones con gel de agarosa al 0,8% y se transfirieron a una membrana de nylon. En ambos lados se agreg la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa como sonda marcada con P32 y luego se efectu una autorradiografa.

Regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa Los ADN de las sojas A5403 y 40-3-2 digeridos con HindIII y con una sonda del terminador de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa marcada con P32 se analizaron con un Southern blot. Se constat que la soja 40-3-2 contiene al menos una parte de la secuencia de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa (Figura 8, faja 10) ya que se detect una nica banda de 5,8 kb que corresponde al resto que se observa en la Figura 5.2 (faja 5) mencionada. Luego los ADN de las sojas A5403 y 40-3-2 se digirieron con una mezcla de EcoRI y BglII y con una mezcla de EcoRI y HindIII. Un fragmento de 0,8 kb del ADN de la soja 40-3-2 digerido con una mezcla de EcoRIy HindIII se hibrid con la sonda de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa (faja 5) cuyo tamao

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esperado segn el mapa es de 0,3 kb. Un fragmento de 1,2 kb del ADN de la soja 403-2 digerido con una mezcla de EcoRI y BglII se hibrid con la sonda de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa (faja 3) cuyo tamao esperado es de 0,8 kb. Estos resultados indican que el inserto de la soja 40-3-2 no contiene el sitio de restriccin de la enzima HindIII en el nucletido 155 ni el de la enzima BglII en el nucletido 10187.

Figura 9. Southern blot con el virus del mosaico de la coliflor y el gen que codifica la protena marcadora fluorescente como sondas. El ADN del plsmido PV-GMGT04 se digiri con HindIII (lados A y B, fajas 1). El ADN de la soja control A5403 se digiri con HindIII (lados A y B, fajas 2). Los ADN de las sojas GTS 403-2 y GTS 61- 67-1 se digirieron con HindIII (lados A y B, fajas 3 y 4, respectivamente). Cada banda representa aproximadamente 100 pg del ADN del plsmido o 5 ug aproximadamente del ADN del genoma. Se efectu una electoforesis de las digestiones en gel de agarosa al 0,8% y se transfirieron a una membrana de nylon a la que se agreg una sonda del promotor del virus del mosaico de la coliflor (lado A) o de la regin de codificacin del gen que codifica la protena marcadora fluorescente (lado B) marcadas con P P32 y luego se efectu una autorradiografa.

Promotor del virus del mosaico de la coliflor Los ADN de las sojas A5403 y 40-3-2 digeridos con HindIII y con una sonda del promotor del virus del mosaico de la coliflor marcado con P32 se analizaron con Southern blot. En la soja 40-3-2 (Figura 9, lado A, faja 3), no se observ ninguna banda, por lo tanto esta soja no contiene el ADN del promotor del virus del mosaico de la coliflor. La soja GTS 61-67-1, que contiene este promotor se us como control positivo (lado A, faja 4). Gen que codifica la protena marcadora fluorescente Los ADN de las sojas A5403 y 40-3-2 digeridos con HindIII y con una sonda de la regin de codificacin del gen que codifica la protena marcadora fluorescente marcada con P32 se analizaron con Southern blot. La soja 40-3-2 (Figura 9, lado B, faja 3), no posee ninguna banda, por lo tanto no contiene el gen que codifica la protena marcadora fluorescente. La soja GTS 61-67-1, que contiene este gen se us como control positivo (lado B, faja 4).

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Figura 10. Prediccin del inserto de ADN en la soja 40-3-2 ubicado en un fragmento de 5,8 kb de la digestin con HindIII. *****************************************

Caracterizacin del inserto secundario

El ADN de la soja GTS 40-3-2 tambin se caracteriz con Southern blot de mayor precisin que la usada inicialmente. (Re et al. 1993; Kolacz y Padgette 1994; Padgette et al. 1996). Los ADN de la soja 40-3-2 y de la generacin R3 de la progenie (Resnick BC1F2) empleada para desarrollar las variedades comerciales se digirieron con la enzima de restriccin HindIII y luego se hibridaron con una sonda que contena la secuencia completa de codificacin del gen de la 5enolpiruvilsiquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4. El ADN de la soja control A5403 y el ADN de la soja control A5403 con ADN del plsmido PV-GMGT04 se cortaron con HindIII y se usaron como controles (ver Figura 11). Tal como se esperaba, en el ADN de la soja control (faja 2) no se observan bandas de hibridacin. En el ADN de la soja control A5403 con el ADN del plsmido PV-GMGT04 (faja 3) se observan dos bandas de ~2,5 kb y ~8,0 kb tal como se esperaba segn el mapa del plsmido (ver Figura 1). En el ADN de la soja Resnick BC1F2 (faja 4) y en el de la soja 40-3-2 (faja 5) se observan bandas del tamao esperado, de aproximadamente 5,8 kb, que corresponden al inserto primario funcional y una banda de aproximadamente 900 pares de bases. La diferencia de calidad del ADN de las dos muestras provoca una pequea diferencia en la migracin de la banda de ~ 900 kb.

Figura 11. Southern blot del ADN de la soja 40-3-2. La faja 1 se dej como blanco. Se utilizaron 10 microgramos del ADN del genoma de la soja control A5403 extrados del tejido foliar (faja 2), el ADN de la soja control A5403 con un agregado de ~15 pg de ADN del plsmido PV-GMGT04 (faja 3), el de la soja Resnick BC1F2 (faja 4), y el de la soja 40-3-2 (faja 5) digeridos con HindIII. Se agreg una sonda con la regin de codificacin ntegra de la 5 enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 marcada con

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32 P. Los tamaos marcados con una flecha son los obtenidos con marcadores de peso molecular en gel con tincin con Bromuro de etidio.

La regin de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 que se encuentra en el fragmento de restriccin obtenido con la enzima HindIII de ~900 pares de bases se defini con ms precisin. Los ADN de los genomas de las sojas 40-3-2 y de Resnick BC1F2 se extrajeron y se hibridaron con Southern blot empleando porciones secuenciales de la secuencia de codificacin de la 5-enolpiruvilsiquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 y del terminador de la transcripcin de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa (ver diagrama en la parte inferior de la Figura 12.). Adems, se incluy en todos los Southern blot el ADN de la soja control A5403, de la A5403 con ADN del plsmido PV-GMGT04, el de la Resnick BC1F2, y el de la soja 40-3-2 digeridos con HindIII. Los Southern blot en las muestras de ADN de Resnick BC1F2 y de la soja 40-3-2 con la sonda de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa y con tres sondas de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (Sonda-1, Sonda-2 y Sonda-4) solo produjeron la banda esperada de ~5,8 kb que representa el inserto primario funcional de la soja 40-3-2 (no incluida en la Figura). Las muestras de ADN de la soja Resnick BC1F2 y de la soja 40-3-2 con la Sonda-3 (ver el diagrama en la parte inferior de la Figura 12) son las nicas en las que se observa el fragmento de restriccin con HindIII de ~900 pares de bases (ver el lado A de la Figura 12). El fragmento de restriccin con la enzima HindIII de ~900 pares de bases se encuentra, una vez ms ligeramente desplazado entre las dos muestras de la soja 40-3-2 debido a que la transferencia de la Figura 11 se anul y luego se volvi a agregar la sonda para obtener este resultado. La Sonda-3, diseada para solapar los extremos 5 y 3, no se hibrida con el fragmento obtenido con HindIII de ~900 pares de bases (Figura 12, lados B y C). Estos resultados indican que el fragmento de restriccin con HindIII de ~900 pares de bases no contiene la secuencia de terminacin de la transcripcin de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa y que en este fragmento la porcin de la regin de codificacin de la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 tiene menos de 200 pares de bases.

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Figura 12. Southern blot con sondas solapadas de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. La faja 1 se dej como blanco. Se utilizaron 10 microgramos del ADN del genoma de la soja control A5403 extrados del tejido foliar (faja 2), el ADN de la soja control A5403 con un agregado de ~15 pg del ADN del plsmido PV-GMGT04 (faja 3), el de la soja Resnick BC1F2 (faja 4), y el de la soja 40-3-2 (faja 5) digeridos con HindIII. En el lado A se utiliz la Sonda-3, en el lado B la Sonda-5 y en el lado C la Sonda-6 todas ellas de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. El lado A se anul y se volvi a agregar la sonda de la hibridacin de la Figura 11. El diagrama en la parte inferior muestra las posiciones de las sondas con respecto a la secuencia de codificacin de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y de la regin 3 sin traducir del gen que codifica la nopalina sintetasa, las sondas utilizadas en los lados A, B, y C se encuentran en negritas. Los tamaos marcados con una flecha son los obtenidos con marcadores de peso molecular en gel con tincin con bromuro de etidio.

La secuencia de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 en el fragmento de restriccin con HindIII de ~900 pares de bases se caracteriz ms detalladamente digiriendo con HindIII un conjunto de ADN cosmido que contiene este fragmento, separndolo con electroforesis en gel de agarosa y transfirindolo a una membrana de nylon. El vector plsmido PV-GMGT04 se us como control de hibridacin positivo y se espera que produzca dos bandas de ~8,0 kb y ~2,5 kb segn el mapa del plsmido (Figura 1). Varias transferencias idnticas se hibridaron una por una utilizando sondas de oligonucletidos con el extremo 3 marcado con digoxigenina-11-dUTP (ver diagrama en la parte inferior de la Figura 13). Las sondas Oligo-1, Oligo-2, Oligo-3, Oligo-4, Oligo-8 y Oligo-9 no se hibridaron con el ADN cosmido, pero el plsmido PV-GMGT04 que se us como control positivo se hibrid. Esto indica que las condiciones del ensayo favorecen la hibridacin (informacin no incluida en la Figura). Sin embargo, el fragmento de restriccin con HindIII de ~900 pares de bases extrado del ADN cosmido se hibrid con las sondas Oligo-5 y Oligo-6 (informacin no incluida en la Figura). El conjunto de clones del cosmido se analiz con el fin de aislar las colonias que contenan el fragmento de restriccin con HindIII de ~900 pares de bases. El clon cosmido purificado 6A se digiri con HindIII, se separ con electroforesis en gel de agarosa y se transfiri a una membrana de nylon. Los controles empleados son los mismos que los del conjunto de ADN cosmido. Al igual que con la muestra de ADN del conjunto, las sondas Oligo-5 y Oligo-6 se hibridaron con el fragmento de restriccin de HindIII de ~900 pares de bases. Sin embargo, en el ADN cosmido preparado a partir del clon 6A la sonda Oligo-7,

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contigua al extremo 3 de la sonda Oligo-6, no se hibrid con el fragmento de restriccin de HindIII de ~900 pares de bases. En el ADN cosmido, la sonda Oligo-4, contigua al extremo 5 de la sonda Oligo-5, tampoco se hibrid con el fragmento de restriccin con HindIII de ~900 pares de bases (Figura 13). Las dos sondas que se hibridaron con el fragmento de restriccin de HindIII de ~900 pares de bases en el ADN del clon cosmido 6A, Oligo-5 y Oligo-6, estn ubicadas una a continuacin de la otra en la regin de codificacin de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y representan por lo menos 53 pares de bases del total de 200 pares de bases de la regin que se espera encontrar segn los resultados de otros experimentos con muchas sondas efectuados con el fin de identificar secuencias adyacentes a partir de una secuencia ya localizada (paseo con sondas) en el ADN del genoma de la soja 40-3-2 (Figura 12). En conclusin, la hibridacin de las sondas de oligonucletidos con los clones cosmidos permiti definir la secuencia de la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 que se encuentra en el fragmento de restriccin de HindIII de ~900 pares de bases como una secuencia de ~53 pares de bases que se hibrida con las sondas Oligo-5 y Oligo-6 (Figura 13).

Figura 13. Southern blot del ADN cosmido preparado del clon cosmido 6A aislado con distintos oligonucletidos como sonda. Las sondas tienen el extremo 3 marcado con digoxigenina-11-dUTP y se utilizaron en Southern blot individuales en ADN del clon cosmido purificado 6A digerido con HindIII (faja 4, 4 ng por faja excepto en el lado A donde se utilizaron 900 pg de una mezcla de los ADN cosmidos). En la faja 1 de cada lado se utiliz ADN marcador del peso molecular con el fin de estimar el tamao de las bandas observadas. En cada lado se utiliz el mismo marcador de peso molecular. El control positivo utilizado es el plsmido PV-GMGT04 digerido con HindIII (faja 2, 1 ng por faja). Las fajas 3 y 5 de cada lado se dejaron como blanco. El diagrama lineal en la parte inferior de la figura muestra las posiciones de las sondas de oligonucletidos con respecto a la secuencia de codificacin de la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4. En negritas las sondas empleadas en los lados A, B, C y D. La regin sombreada de ~200 pares de bases representa el mximo de la regin delineada que debe estar presente en el fragmento de restriccin con HindIII de ~900 pares de bases en el ADN de la soja 40-3-2 que se hibrida con la Sonda-3 de la 5 enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. Los tamaos marcados con una flecha son los obtenidos con marcadores de peso molecular en gel con tincin con bromuro de etidio.

Las sondas Oligo-5 y Oligo-6 (Figura 13) se utilizaron como cebadores tanto en la direccin 5 como en la 3 para generar secuencias de ADN directamente de los clones cosmidos purificados 6A y 4B (otro clon cosmido que contiene un inserto similar al del 6A). Luego se disearon varios cebadores de forma de obtener las secuencias adyacentes a los extremos 5 y 3 y se acoplaron a los cebadores Oligo-5 y Oligo-6. Se obtuvieron los productos de la reaccin en cadena de la polimerasa y luego se secuenciaron. La secuencia de ADN obtenida contiene 72 pares de bases de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (855 a 926, Figura 1), que estn ubicados en un fragmento de restriccin con HindIII de 937 pares de bases. En este fragmento de restriccin con HindIII no se identificaron otras secuencias

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provenientes del plsmido PV-GMGT04 (Figura 1) empleado en la transformacin de la soja 40-3-2. El diagrama del inserto adicional se encuentra en la Figura 14. En el fragmento de restriccin con HindIII de 937 pares de bases solo se encuentran 72 pares de bases de la secuencia del gen de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. Esto explica la poca intensidad de hibridacin de esta banda con la sonda de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 ntegra en comparacin con el fragmento de restriccin con HindIII de ~5,8 kb que contiene el inserto primario funcional (Figura 11, fajas 4 y 5). Esto tambin explica por qu el segmento de 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 adicional no se observa con los mtodos utilizados para caracterizar el inserto primario menos sensibles ya descritos.

Figura 14. Insertos de ADN esperados en la soja 40-3-2 segn Southern blot ms sensibles con varias sondas, clonacin del genoma, secuencia de nucletidos y reaccin en cadena de la polimerasa. Adems hay otro segmento de 250 pares de bases de la secuencia del gen de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 adyacente a la secuencia de terminacin de la transcripcin de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa en el inserto primario, y otro inserto adicional ubicado en un fragmento de restriccin con HindIII de 937 pares de bases, que contiene 72 pares de bases de la secuencia del gen de la 5enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. La regin sombreada en la secuencia del gen de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 del inserto primario funcional representa las 72 pares de bases que se encuentran en el segundo inserto.

Los ADN extrados de las sojas Resnick BC1F2 y de la 40-3-2 y de los clones cosmidos aislados 4B y 6A se sometieron a reacciones en cadena de la polimerasa con el fin de demostrar que las regiones del genoma adyacentes a los extremos 5 y 3 del segmento de 72 pares de bases del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 son idnticas en todas las muestras. Se efectuaron tres reacciones en cadena de la polimerasa distintas. En la primera se verificaron las secuencias del genoma adyacentes al extremo 5 con los Cebadores A y B. En la segunda se verificaron las secuencias del genoma adyacentes al extremo 3 con los Cebadores A y C. En la tercera, se amplificaron las secuencias del genoma adyacentes al extremo 5 hasta las adyacentes al extremo 3 con los Cebadores B y C. En la Figura 15 se detallan las posiciones de todos los cebadores y los resultados de todas las reacciones en cadena de la polimerasa. No se observaron productos de la reaccin en cadena de la polimerasa en las reacciones de control sin patrn (fajas 7, 13 y 19) ni en el ADN de la soja control negativa no transgnica A5403 (fajas 6, 12 y 18). Las muestras de ADN de la soja Resnick BC1F2 (fajas 2, 8 y14), de la 40-3-2 (fajas 3, 9 y 15), del clon cosmido 4B (fajas 5, 11 y 17) y del clon cosmido 6A (fajas 4, 10 y 16) produjeron los productos de la reaccin en cadena de la polimerasa de los tamaos esperados, es decir 532 pares de bases las secuencias adyacentes a 5, 599 pares de bases las adyacentes a 3 y 1103 pares de bases la secuencia entre los extremos 5 y 3 (ver diagrama en la parte inferior de la Figura 15). Se obtuvo la

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secuencia de ADN de los productos de las reacciones en cadena de la polimerasa similares. Los resultados obtenidos demuestran que la secuencia adyacente del genoma en los clones cosmidos 4B y 6A es idntica a la de las muestras de las sojas Resnick BC1F2 y 40-3-2. Asimismo estos resultados validan los clones cosmidos empleados y demuestran que el segundo inserto en la soja 40-3-2 consiste de 72 pares de bases del gen de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (los pares de bases 855 a 926 del plsmido PV-GMGT04, Figura 1) ubicados en un fragmento de restriccin con HindIII de 937 pares de bases sin otras secuencias del plsmido PV-GMGT04 empleadas en la transformacin de esta soja.

Figura 15. PCR del segundo inserto. Las reacciones en cadena de la polimerasa se efectuaron con los cebadores A y B con el fin de confirmar la secuencia adyacente al extremo 5, los cebadores A y C para la secuencia adyacente al extremo 3y los cebadores B y C para la reaccin en cadena de la polimerasa desde el extremo 5 al segmento adyacente a 3 en ADN extrado del tejido foliar de las sojas Resnick BC1F2 (fajas 2, 8 y 14) y de la 40-3-2 (fajas 3, 9 y 15), as como tambin en el ADN de los clones cosmidos 6A (fajas 4, 10 y 16) y 4B (fajas 5, 11 y 17). Las fajas 1 y 20 contienen hlices de ADN de 100 y 500 pares de bases de Gibco BRL, respectivamente. Las fajas 6, 12 y 18 contienen ADN de la soja A5403 no transgnica producto de las reacciones en cadena de la polimerasa y las fajas 7, 13 y 19 el patrn control de las reacciones en cadena de la polimerasa. En el gel se cargaron 10 microlitros de cada PCR. Los tamaos marcados con una flecha son los obtenidos con marcadores de peso molecular en gel con tincin con bromuro de etidio.

Secuencia de los extremos 5 y 3 del inserto primario

Los productos de la PCR con las secuencias de los extremos 5 y 3 del ADN insertado y el ADN adyacente a los extremos 5 y 3 del inserto primario de la soja 40-3-2 se generaron con GenomeWalker, que utiliza reacciones en cadena de la polimerasa (CLONTECH, Palo Alto, California). Los productos resultantes de la PCR se secuenciaron y se designaron varios cebadores que se alinearon con cebadores especficos del inserto ubicados en el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada con el fin de validar la secuencia del extremo 5 del ADN insertado y la secuencia del genoma adyacente al extremo 5. Otros cebadores se alinearon con los especficos del inserto ubicados en la regin de terminacin de la transcripcin de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa y se emplearon para validar la secuencia del extremo 3 del ADN insertado y la secuencia del ADN del genoma adyacente al extremo 3. Se obtuvieron los productos de la reaccin en cadena de la polimerasa y se secuenciaron (Figuras 5.14 y 17). La secuencia de ADN del extremo 5 no contiene los primeros 354 pares de

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bases del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada (Figura 16) y el inserto comienza con el par de bases 2347 del plsmido PV-GMGT04 (Figura 1). Esta delecin elimina una porcin de la regin potenciadora duplicada del virus del mosaico de la coliflor y no se cree que tenga consecuencias significativas del punto de vista de la funcionalidad del promotor ya que la regin necesaria para el comienzo de la transcripcin permanece intacta (Odell et al. 1985). Adems de la secuencia de 105 pares de bases del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, hay 186 pares de bases del ADN del genoma de la soja adyacentes al extremo 5 del ADN insertado (Figura 16). La secuencia de ADN en el extremo 3 contiene la secuencia de terminacin de la transcripcin ntegra, en lugar de la secuencia parcial de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa antes mencionada (Figura 17). La porcin de 250 pares de bases, adyacente al ADN insertado que finaliza en el par 160 del plsmido PV-GMGT04 (Figura 1), nunca se haba observado. Esta porcin contiene una parte del gen que codifica la 5enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y consiste en los pares de bases 195 al 444 en la Figura 17 y corresponde a los pares de bases 1490 al 1739 del plsmido PV-GMGT04 (Figura 1). En la Figura 17 tambin se observa la secuencia de 416 pares de bases adyacente en el ADN del genoma de la soja. El segmento del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (pares de bases 1490 al 1739 del plsmido PV-GMGT04 en la Figura 1) no contiene un promotor ni tampoco un extremo 3 que indique la finalizacin de la transcripcin. Por lo tanto es poco probable que esta regin se transcriba y se traduzca. Adems de la cadena completa de ARNm, el Northern blot no detect ningn otro ARNm. Por otra parte, en el supuesto caso que esta regin se transcribiera y se tradujera como una fusin con la secuencia completa de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, el Western blot con el antisuero correspondiente hubiera dado como resultado protenas de mayor peso molecular. No se observ ninguna protena adems de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (Rogan et al. 1999), hecho que refuerza la creencia que esta secuencia de ADN no se transcribe ni se traduce como una protena de fusin.

Figura 16. Secuencia adyacente al extremo 5 del inserto primario de la soja 40-3-2. Los pares de bases subrayados 1 a 105 (correspondientes a los pares de bases 2241 al 2347 del plsmido PV-GMGT04 en la Figura 1) constituyen una porcin del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada. Los pares de bases 106 a 291 constituyen el ADN adyacente del genoma de la soja

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Figura 17. Secuencia adyacente al extremo 3 del inserto primario de la soja 40-3-2. Los pares de bases subrayados 1 a 194 (correspondientes a los pares de pases 160 al 353 del plsmido PV-GMGT04, Fig. 4.1) son la extremo 3 de la secuencia de finalizacin de la transcripcin de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa del inserto funcional y los 16 pares de bases del plsmido PV-GMGT04 (en cursiva) inmediatamente adyacentes al gen de la nopalina sintetasa. Los pares de bases encerrados en un recuadro, del 195 al 444 (correspondientes a los pares de bases 1490 al 1739 del plsmido PV-GNGT04 en la Figura 1) delimitan la regin de codificacin de la 5-enolpiruvilsiquimato 3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de 250 pares de bases. Los pares de bases 445 al 860 constituyen el ADN del genoma de la soja adyacente con el sitio de corte de la enzima HindIII en negritas, que comienza en el par de bases 852.

Resumen

En conclusin, en la soja GTS 40-3-2 se insertaron dos segmentos de ADN, uno de ellos contiene la construccin funcional del gen que codifica la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada parcial, secuencia de sealizacin del pptido de trnsito al cloroplasto, la secuencia de codificacin de la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y el terminador de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa) y un segundo inserto ms pequeo que contiene 72 pares de bases de la secuencia gen de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. Por otra parte, la secuenciacin del ADN del genoma de la soja adyacente al inserto funcional que codifica de la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 confirma una delecin en la regin potenciadora del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada. No se efectuaron modificaciones en la regin clave para que la transcripcin comience correctamente. La secuenciacin del terminador de la transcripcin de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa y del ADN adyacente permiti determinar que esta secuencia permaneci intacta. Tambin se observ la presencia de un segmento de 250 pares de bases de la secuencia que codifica la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, adyacente al extremo 3 de la seal de terminacin de la transcripcin de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa. La ausencia de un promotor y de un terminador de la transcripcin en el extremos 3 en los dos pequeos segmentos de la secuencia que codifica la 5enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 apuntan a que es muy poco

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probable que estas regiones se transcriban. Ms an, los Northern blot y Western blot demuestran, tal como se esperaba, la presencia del transcrito de la secuencia que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 ntegro y de la protena, respectivamente. Estos datos permiten concluir que las secuencias de ADN que codifican la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 no se transcriben ni se traducen
Referencias

Dellaporta, S.L., Wood, J. y Hicks, J.B. (1983). A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol. Biol. Reporter 1, 19-21. Kolacz, K.H. y Padgette, S.R. (1994). Molecular characterization of the 5 and 3 ends of the inserted DNA and the stability of the insert in glyphosate-tolerant soybean line 40-3-2. Monsanto Study #93-01-30-43, Monsanto Technical Report MSL-13524, St. Louis, MO. McPherson et al. eds. (1991). PCR: A Practical Approach. Oxford University Press, Oxford, pp. 1-13. Mullis, K y Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155, 335-350. Odell, J. T., Nagy, F. y Chua, N.H. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313, 810-812. Padgette, S.R., Taylor, N.B., Nida, D.L., Bailey, M.R., MacDonald, J., Holden, L.R. y Fuchs, R.L. (1996). The composition of glyphosate-tolerant soybean seeds is equivalent to that of conventional soybeans. Journal of Nutrition 126, 702-716. Re, D.B., Padgette, S.R., Delannay, X., Kolacz, K.H., Nida, D.L., Peschke, V.M., Derting, C.W., Rogers, S.G., Edwards, J.W., Barry, G.F. y Biest, N.A. (1993). Petition of determination of nonregulated status: soybeans with a Roundup Ready gene. Submitted to USDA, St. Louis. Rogan, G.J., Dudin, Y.A., Lee, T.C., Magin, K.M., Astwood, J.D., Bhakta, N.S., Leach, J.N., Sanders, P.R. y Fuchs, R.L. (1999). Immunodiagnostic methods for detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in Roundup Ready soybeans. Food Control 10, 407-414. Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Molecular Biology 98, 503-517.

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Estabilidad gentica de la caracterstica introducida

La estabilidad de la integracin del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 en el genoma de la soja GTS 40-3-2 se comprob con anlisis moleculares (por ejemplo transferencia Southern, reaccin en cadena de la polimerasa y expresin de las protenas) y con la segregacin de las caractersticas fenotpicas.
Southern blot

Mtodos Los ADN de todo el genoma del tejido foliar de las generaciones R3 y R6 de la soja GTS 40-3-2 se aislaron con modificaciones mnimas segn la tcnica descrita por Dellaporta et al. (1983). Una o dos hojas de la primera hoja trifoliada de plantas de soja de invernadero se emplearon como material fuente. Se incubaron con ARNasa, se extrajeron con una mezcla de fenol y cloroformo y se precipitaron con etanol. Los ADN de los genomas se cuantificaron con espectrofotometra y se digirieron con HindIII. Las muestras digeridas de cada planta (5 g de ADN), el ADN de la soja progenitora A5403 digerido con HindIII y el ADN del plsmido PV-GMGT04 digerido con EcoRI (100 pg) que se us como control positivo, se separaron por electroforesis en gel de triacetato y agarosa al 0,8%. Los fragmentos separados se transfirieron a una membrana de nylon, se agreg el ADN del plsmido PV-GMGT01 como sonda marcada con P32 y se efectu una autoradiografa (Southern 1975; Sambrook et al. 1989). Resultados y discusin Las regiones adyacentes al ADN insertado se determinaron amplificando la reaccin en cadena de la polimerasa con los cebadores especficos de los extremos 5 y 3 y se comprob que ninguno de los sitios de restriccin de HindIII presentes originalmente en el plsmido PV-GMGT04 (en las posiciones 155 y 2707) se incorporaron al genoma hospedador. El Southern blot del ADN del genoma del transformante original digerido con HindIII demuestra la presencia de un fragmento de 5,8 Kb que indica que los dos sitios de restriccin de HindIII que limitan este fragmento deben estar ubicados en el genoma de la planta, uno a cada lado del ADN insertado (Figura 19). Este fragmento que contiene el ADN insertado y el adyacente se consider apropiado para verificar la estabilidad del ADN insertado en la soja GTS 40-3-2.

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Figura 18. Southern blot de las generaciones R3 y R6 de la soja GTS 40-3-2 con la sonda PV-GMGT04. Los ADN de los genomas de las generaciones R3 (faja C) y R6 (faja D) de la soja GTS 40-3-2, as como tambin el de la soja progenitora no transgnica A5403 (faja B), se digirieron con HindIII, se separaron por electroforesis y se transfirieron a una membrana de nylon a la que se agreg una sonda con el ADN del plsmido PV-GMGT04 marcada con P32. En la faja A se incluy la muestra control con ADN del plsmido PV-GMGT04 digerido con EcoRI.

Figura 19. Diagrama esquemtico del inserto de la soja GTS 40-3-2 con los sitios de restriccin de HindIII. Las reacciones en cadena de la polimerasa de las regiones de los extremos 5 y 3 del fragmento de ADN insertado demuestran que los dos sitios de restriccin de HindIII en las posiciones 155 y 2707 del plsmido PV-GMGT04 no se incorporaron al genoma de la planta. Los dos sitios de restriccin de HindIII que delimitan el fragmento de 5,8 Kb (Figura 18) se encuentran en el genoma de la planta.

La sonda del plsmido PV-GMGT04 marcada con P32 que se agreg a los ADN de los genomas de las generaciones R3 y R6 de la soja GTS 40-3-2 digeridos con HindIII slo detect un nico fragmento de 5,8 Kb (Figura 18). La presencia del mismo fragmento en las dos generaciones de la soja 40-3-2 indica que el inserto de ADN del plsmido y el ADN limtrofe se mantienen de forma estable durante toda la vida de las plantas y durante cuatro generaciones. Los Southern blot, tcnicas ms sensibles, demostraron la cosegregacin de un segundo fragmento de ADN insertado que contiene una secuencia de 72 pares de bases que corresponden a la regin de codificacin del gen de la 5-enolpiruvato-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. Estos datos indican que el inserto primario y este segundo inserto de menor tamao se comportan como un solo locus.
Herencia

El anlisis de las progenies F2 obtenidas por retrocruzas entre la soja GTS 40-3-2 y otras sojas no transgnicas confirma que la tolerancia al glifosato segrega segn un patrn definido (segregacin de Mendel).

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Los patrones de segregacin de las progenies de cruzas entre la soja 40-3-2 y 17 sojas no transgnicas se resumen en el Cuadro 3. En toda la progenie F2 se observa una relacin uniforme de 3 tolerantes a 1 intolerante por lo tanto la tolerancia al glifosato en la soja 40-3-2 est determinada por un nico gen dominante.
Cuadro 3. Segregacin de la tolerancia al glifosato en la progenie F2 de cruzas entre la soja GTS 40-3-2 y 17 sojas no transgnicas.

Familia

Tolerantes

Intolerantes

Chi2

1 17 4 0,40 2 10 2 0,44 3 12 4 0,00 4 16 4 0,27 5 16 5 0,02 6 14 3 0,49 7 18 5 0,13 8 10 4 0,10 9 17 7 0,22 10 6 3 0,33 11 15 4 0,16 12 17 1 3,63 13 10 1 1,48 14 16 5 0,02 15 3 1 0,00 16 18 3 1,29 17 19 5 0,22 234 61 2,94 Total Prueba de bondad de ajuste de Chi cuadrado no corregida para la hiptesis: segregacin 3:1. Ningn valor de chi cuadrado es significativo con un grado de confianza del 95% (chi2 0,05=3,84).

Conclusin

La soja GTS 40-3-2 que contiene el gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 es estable y toda conclusin respecto de la inocuidad de la soja GTS 40-3-2 tambin se aplica a su progenie y a otras sojas obtenidas a partir de ella con tcnicas de mejoramiento convencionales.
Referencias

Dellaporta, S.L., Wood, J. y Hicks, J.B. (1983). A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol. Biol. Reporter 1, 19-21. Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Molecular Biology 98, 503-517.

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Expresin - efecto Materiales y mtodos

Ensayos de campo El grado y la calidad de la expresin se analizaron en muestras vegetales recolectadas de un ensayo de campo en Puerto Rico en 1992, de nueve en los Estados Unidos durante el mismo ao y de cuatro efectuados en 1993 en el mismo pas. Las parcelas se organizaron con un diseo en bloques completamente aleatorios con cuatro genotipos: la soja control progenitora A5403, la soja GTS 40-3-2, y otras dos sojas GTS. El grado de expresin del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 se determin con ensayos de inmunoabsorcin enzimtica (ELISA) cuantitativos en muestras de tejido foliar y de porotos recolectadas en cada ensayo de campo. Ensayos ELISA Las muestras de tejido foliar de la soja control y de la GTS 40-3-2 se prepararon para el ELISA moliendo el tejido en nitrgeno lquido hasta obtener un polvo fino y luego se volvi a suspender un volumen medido en un buffer de extraccin (100 mM TrisHCl pH 7,8, 100 mM borato de sodio, 5 mM MgCl2, 0,05% v/v Tween 20 y 0,2% de ascorbato de sodio) con una relacin 1 parte de tejido por cada 100 partes de buffer (30 mg de tejido foliar/ 3 ml de buffer). La suspensin se homogeneiz (30 segundos; PT3000 Polytron) y se centrifug para eliminar todos los restos celulares. El sobrenadante se analiz inmediatamente o se conserv congelado a -80C. El ELISA sandwich de anticuerpo doble para la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, (el primer anticuerpo de cabra y el segundo de conejo) se detect con un conjugado de la fosfatasa alcalina de asno anti conejo seguido de un desarrollo con pnitrofenil fosfato. El ELISA sandwich de anticuerpos directos dobles del gen que codifica la protena marcadora fluorescente se efectu con un anticuerpo de conejo anti-gen que codifica la protena marcadora fluorescente disponible comercialmente (CLONTECH Laboratories) y su conjugado de fosfatasa alcalina y luego se desarroll con p-nitrofenil fosfato. La cuantificacin de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y del gen que codifica la protena marcadora fluorescente en las muestras vegetales se efectu extrapolando las curvas de la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 madura purificada (es decir, sin el pptido de trnsito) o con las curvas estndar del gen que codifica la protena marcadora fluorescente (ambos estndares se purificaron de cepas de E. coli con sobreexpresin). Western blot Las muestras de tejido de soja y de las fracciones elaboradas se trituraron con un mortero en nitrgeno lquido hasta obtener un polvo. Luego se volvieron a suspender en un buffer de extraccin (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM benzamidina-HCl, 5 mM ditiotreitol, 2,5 mM cido etildiamino tetraactico, 1,0 mM fluoruro de fenilmetil sulfonilo, 10 mM cido 3-((3-colamidopropil) dimetilamonio) 1- propanosulfnico, y 6M guanidina-HCl) con una relacin de 1 parte de tejido en 50 de buffer (volumen). Las muestras se homogeneizaron con un homogeneizador Omni-2000 manual (en posicin 4-5 durante 30 segundos) y se centrifugaron para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se conserv para efectuar los anlisis. Las protenas se

116

separaron con electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico con gradiente lineal de poliacrilamida 4-20% preformado con el sistema de buffer de Laemmli (1970). Las protenas separadas se transfirieron por electroforesis a una membrana de fluoruro de polivinilideno tratada con una solucin salina de Tris buffer con 5% de leche en polvo desgrasada y seca y 0,2% de Tween-20 para bloquear los sitios de unin no especficos de las protenas. A la protena de la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 que se uni a la membrana se le agreg una sonda empleando una dilucin 1 en 1000 de IgG anti 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 de cabra (1 o 2 horas a temperatura ambiente) y los anticuerpos que se unieron se detectaron con incubaciones secuenciales con un conjugado de peroxidasa y rbano picante y Protena G marcada con biotina NeutrAvidin. Luego se desarrollaron con quimioluminiscencia potenciada.

Ensayos enzimticos con la protena marcadora fluorescente y la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 La cantidad de 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 activa del punto de vista funcional se determin midiendo el C14 incorporado a la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa a partir del fosfoenol piruvato marcado con C14 separada por cromatografa de lquidos de alta presin y con un detector de radioactividad (Padgette et al. 1988; Padgette et al. 1987). Las reacciones se incubaron a 25C en un buffer compuesto por 50 mM cido (N-(2-hidroxietil) piperacina- N-2-etano sulfnico pH 7,0, 0,1 mM molibdato de amonio, 5 mM KF, 1 mM fosfoenol piruvato marcado con C14 y 2 mM siquimato-3-fosfato. Para analizar las muestras se agreg 100 mM Tris-HCl pH 7,8, 100 mM borato de sodio, 5 mM MgCL2, 0,2% ascorbato de sodio, se quit la sal con una columna desechable y luego se separaron con cromatografa de lquidos de alta presin. Por definicin una unidad (U) de actividad enzimtica es 1 micromol de 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa producido por minuto a 25C. El ensayo enzimtico de la protena marcadora fluorescente consiste en una modificacin del mtodo de Jefferson et al. (1986) segn la formacin de pnitrofenol catalizada por la protena marcadora fluorescente a partir del p-nitrofenolbeta-D-glucurnido. Las mezclas de reaccin (8 mM p-nitrofenil-beta-Dglucurnido, 49 mM fosfato sdico, 10 mM 2-mercaptoetanol, 10 mM cido etil diamino tetraactico, 0,1% sarcosilo y 0,1% Triton X-100, pH 7,4) se incubaron entre 1 y 5 minutos, se agreg 2,5 M 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol y luego se determin la produccin de p-nitrofenol por espectrofotometra midiendo la absorbancia a 406 nm. Por definicin una unidad (U) de actividad enzimtica es 1 micromol de pnitrofenol producido por minuto a 37C.
Resultados y discusin

El grado de expresin de la protena marcadora fluorescente y de la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 se midi con ensayos ELISA. En tejidos foliares y del poroto de la soja slo se detect la presencia de la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 (ver Cuadro 4). La expresin promedio de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 es 0,288 g/mg de tejido (peso hmedo) o 0,443 g/mg tejido, del poroto y foliar, respectivamente, en 117

muestras de los ensayos de campo efectuados en 1992. En las muestras de tejido de los cuatro ensayos de campo efectuados en 1993 el grado de expresin es similar, aunque ligeramente menor (ver Cuadro 4).
Cuadro 4. Resultados de los ensayos ELISA con la protena marcadora fluorescente y la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 en la soja GTS 40-3-2.

Muestra1
5-enolpiruvilsiquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP43 Tejido foliar4 1992 Tejido foliar4 1993 Semilla 1992 Semilla 1993

Nmero de sitios

Ug protena / mg tejido peso hmedo Media Rango2

8 3 9 4

0,443 0,415 0,288 0,201

0,251-0,789 0,299-0,601 0,186-0,395 0,127-0,277

protena marcadora fluorescente 3 Tejido foliar4 8 ND# -1992 Semilla 1992 9 ND# -1. Todas las muestras se congelaron inmediatamente despus de recolectadas, se enviaron y se almacenaron congeladas. Las medias son las medias de los sitios. Las muestras de soja recolectadas para los ensayos ELISA provienen de 9 lugares en 1992 y de 4 en 1993. 2. El lmite inferior del rango indica el ensayo individual con el menor valor en cada parcela, el lmite superior el de mayor valor. 3. En las muestras de tejido foliar y del poroto de la soja progenitora A5403 control (que se plantaron en los mismos lugares) no se detect ni la protena marcadora fluorescente ni la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4. 4. En cada parcela tratada se recolect la hojuela central de la tercera hoja trifoliada completamente abierta de 6 plantas escogidas al azar en filas distintas de varios lugares de la parcela y se combinaron. #ND. No detectado.

Los resultados de los ensayos ELISA se confirmaron con ensayos de actividad enzimtica en muestras de porotos de soja GTS 40-3-2 mezclados, recolectadas de los ensayos de campo efectuados en 1992. La actividad de la 5-enolpiruvil-siquimato 3fosfato sintetasa de la cepa CP4 tolerante al glifosato es 0,025 U/mg pero no se detect actividad enzimtica de la protena marcadora fluorescente. En los extractos del poroto de la soja progenitora A5403 no transgnica no se detect actividad ni de la protena marcadora fluorescente ni de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. La ausencia de la protena marcadora fluorescente o de actividad enzimtica detectables confirman los resultados obtenidos con el Southern blot y prueban que las secuencias de codificacin de la protena marcadora fluorescente no se incorporaron al genoma de la soja GTS 40-3-2. El Western blot de la soja GTS 40-3-2 slo detect la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de 47 kDa y confirma la ausencia de otras protenas 118

de este tipo inmunoreactivas (Figura 20). En el Western blot el antisuero anti 5 enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 utilizado casi no present reactividad cruzada con otras protenas 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa similares obtenidas de otras fuentes vegetales (Figura 21).

Figura 20. Deteccin de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 en muestras de soja GTS 40-3-2 (faja C) y en harina tostada elaborada a partir de porotos de soja GTS 40-3-2 (faja D) con la transferencia Western. La 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 purificada de un cultivo con sobreexpresin de E. coli se emple como control positivo (faja A) y en la faja B una muestra con un buffer control negativo.

Figura 21. Especificidad del mtodo analtico de Western blot para la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4. Todas las protenas 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa se expresaron en E. coli y se purificaron hasta la casi homogeneidad. Las cantidades de 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa del maz y de la petunia fueron diez veces superiores a la de la cepa CP4. Las muestras utilizadas son la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la petunia (50 ng; fajas 2 y 8), de la cepa CP4 (5 ng; fajas 3 y 9) y del maz (50 ng; fajas 4 y 10). Los marcadores de peso molecular utilizados son Promega de rango medio (fajas 1 y 7) y los colorimtricos de alto rango (fajas 5 y 6; Amersham). Las protenas separadas se sometieron a electrotransferencia con una membrana de fluoruro de polivinilideno, luego se analizaron normalmente (desarrollo estndar) o no se les agreg el anticuerpo primario y se analizaron con el procedimiento estndar (sin anticuerpo primario).

Referencias

Jefferson, R.A, Burgess, S.M. y Hirsch, D. (1986). b-glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8447-8451. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature 227, 680-685.

119

Padgette, S.R., Huynk, Q.K., Aykent, S., Sammons, R.D., Sikorski, J.A. y Kishore, G.M. (1988). Identification of the reactive cysteines of Escherichia coli 5enolpyruvlshikimate-3-phosphate synthase and their nonessentiality for enzymatic catalysis. J. Biological Chemistry 263, 1798-1802. Padgette, S.R., Huynh, Q.K., Borgmeyer, J., Shah, D.M., Brand, L.A., Re, D., Bishop, B.F., Rogers, S.G, Fraley, R.T. y Kishore, G.M. (1987). Bacterial expression and isolation of Petunia hybrida 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Arch. Biochem. Biophys. 258, 564-573.

120

Evaluacin de la posible toxicidad

Los estudios de digestibilidad de las protenas y de toxicidad por administracin de una nica dosis por va oral en ratones se efectuaron con la protena 5enolpiruvilsiquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 purificada de cultivos bacterianos en vez de la protena de la soja GTS 40-3-2, cuyo grado de expresin es relativamente bajo. Habitualmente, la evaluacin de la toxicidad potencial de las nuevas protenas introducidas se efecta mediante este procedimiento que requiere establecer la equivalencia funcional y fisicoqumica entre las protenas bacterianas y las expresadas en la planta. La equivalencia funcional entre la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 expresada en E. coli (sin el pptido de trnsito al cloroplasto) y la expresada en la planta se determin con el peso molecular, la reactividad inmunolgica cruzada, la ausencia de glucosilacin, la secuencia de aminocidos del extremo N y la actividad enzimtica (Cuadro 6).
Cuadro 6: Equivalencia entre las protenas 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de la soja GTS y de E. coli.

Mtodo analtico
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico Western blot

Criterio
Movilidad electrofortica similar. Movilidad electrofortica y respuesta inmunolgica similares. Deteccin de glucosilacin similar.

Resultado
Peso molecular aparente similar.

Peso molecular aparente y respuesta inmunolgica similares. No se detectaron porciones de carbohidratos especficas de la 5 enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4. Posiciones del extremo N a la posicin 15 idnticas (metionina del extremo N en la 5 enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de E. coli). GTS 3,9 U/mg E. coli 3,0 U/mg.

Glucosilacin

Secuencia de aminocidos

10 aminocidos en idntica posicin

Actividad enzimtica de la 5 enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 ELISA

Las actividades especficas difieren en un factor inferior a 2. Respuesta a dosis similar.

Curvas de respuesta a dosis similares.

Estudio de toxicidad por administracin de una nica dosis de 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 por va oral a ratones

Mtodos La evaluacin directa de la toxicidad potencial asociada a la protena 5enolpiruvilsiquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 se evalu directamente con un estudio de administracin oral de la protena madura de E. coli (sin el pptido de trnsito al cloroplasto) (Naylor 1993). La protena se administr en dosis de hasta 572 mg/kg de peso corporal por va oral. Los ratones se observaron en busca de signos de toxicidad dos veces por da y la ingesta de alimentos se registr a diario. Los alimentos y el agua se suministraron ad libitum. Todos los animales se sacrificaron 8 y 9 das luego de administrar la dosis y se efectu una necropsia ntegra. Se recolectaron aproximadamente 40 muestras de tejidos de cada animal del estudio y se almacenaron. Resultados y discusin

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La administracin de una dosis por va oral de 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de hasta 572 mg/kg a ratones no caus efectos adversos.. La dosis es aproximadamente 1300 veces superior al margen de inocuidad calculado con respecto al consumo mximo potencial del ser humano de la protena expresada en las plantas, suponiendo que no hay prdidas de protena debido a la elaboracin. No se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico en el peso corporal, en la acumulacin de peso corporal o en la ingesta de alimentos entre los grupos control con administracin de albmina srica bovina o del vehculo y los grupos tratados con 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4.
Digestin de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 en jugos gstricos e intestinales simulados

Mtodos La susceptibilidad de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de E. coli a la degradacin proteoltica se evalu con ensayos in vitro con jugos gstricos e intestinales de mamferos simulados que se prepararon segn el procedimiento descrito en la Farmacopea de los Estados Unidos (US Pharmacopeia 1990), referencia citada con frecuencia en los estudios de digestin in vitro. El destino digestivo in vitro de la protena se estudi con transferencias Western y midiendo la actividad enzimtica de alcuotas extradas en distintos momentos luego que comenz la digestin. Resultados y discusin La 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 se degrada rpidamente en jugos gstricos e intestinales simulados con una vida media menor a 15 segundos y 10 minutos, respectivamente. A fin de poner la rapidez de la degradacin in vitro de la protena en perspectiva, se estima que en el ser humano el 50% de los alimentos slidos abandonan el estmago en dos horas y el 50% de los lquidos lo abandonan en aproximadamente 25 minutos (Sleisenger y Fordtran 1989). Si una parte de la protena hubiera sobrevivido al sistema gstrico, las proteasas intestinales la degradaran rpidamente. El trnsito a travs del intestino (del cromato marcado con Cr51, que no se absorbe) se estima entre 4 y 10 horas hasta que los primeros productos aparecen en las heces y entre 68 y 165 horas hasta que aparecen los ltimos. La vida media de 10 minutos observada para la degradacin de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 in vitro permite afirmar con un amplio margen de certeza que prcticamente toda la protena se degradara durante el trnsito inicial a travs del tracto intestinal.

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Figura 33. Digestibilidad in vitro de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 de E. coli en jugos gstricos (parte superior) e intestinales (parte inferior) simulados. Las alcuotas se extrajeron transcurridos 0, 15, 30, 60 y 120 segundos desde el comienzo de la digestin con jugo gstrico simulado (fajas E a I, parte superior), o transcurridos 0, 10, 32, 100 y 270 minutos desde el comienzo de la digestin con jugo intestinal simulado (fajas E a I, parte inferior) y luego se efectu una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico. Las protenas separadas se sometieron a electrotransferencia con una membrana de fluoruro de polivinilideno y luego se trataron de forma secuencial con IgG de conejo anti5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 y con 125IProtein G. En cada gel se incluyeron muestras de 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 purificada (5 y 10 ng en las fajas A y B, respectivamente), buffer control (faja C) y 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 en buffer de reaccin sin enzimas digestivas (faja D).

Ausencia de homologa entre la protena 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 y otras toxinas proteicas

La secuencia de aminocidos de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 que se dedujo (se predijo) se compar con la secuencia de las 1935 toxinas proteicas conocidas que se encuentran en las bases de datos Pir protein, Swissprot y Genpept porque los patrones en las secuencias de aminocidos o las regiones de mucha homologa entre dos o ms protenas pueden contribuir a elucidar la actividad biolgica de la protena en estudio. La estructura y las secuencias de aminocidos de protenas homologas derivadas de una fuente u ancestro comn son similares y a menudo estas comparten una funcin. La homologa se determin comparando el grado de similitud entre las secuencias de aminocidos de las protenas segn los criterios publicados (Doolittle 1990). No se detectaron homologas con las toxinas conocidas. La ausencia de similitudes entre las secuencias se evalu aleatorizando la secuencia de aminocidos de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa

123

CP4, manteniendo proporciones relativas de aminocidos individuales constantes y comparando la secuencia aleatoria con la misma base de datos de toxinas proteicas conocidas. Los resultados obtenidos son similares a los obtenidos con la secuencia de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 sin aleatorizar.
Conclusin

La secuencia de aminocidos de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 no presenta similitudes con otras protenas que son toxinas conocidas, se degrada rpidamente in vitro en condiciones que simulan la digestin en el estmago o en el tracto intestinal de los mamferos y no presenta toxicidad por administracin de una nica dosis segn se observ al tratar los efectos adversos relacionados en ratones a los que se administr la protena por va oral.
Referencias

Doerfler, W. y Schubbert, R. (1997). Fremde DNA im Saugersystem. Deutsches Arzteblatt 94, 51-52. Doolittle, R.F. (1990). Searching through sequence databases. In: Molecular Evolution: Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences. Doolittle, R.F. (ed.). Pp. 99-110. Academic Press, San Diego, CA. Naylor, M. (1993). Acute oral toxicity study of CP4 EPSPS in albino mice. Monsanto Report ML92542, St. Louis, MO. OCDE (2000): Report of the task force for the safety of novel foods and feeds. C(2000)86/ADD1 Organizacin de Cooperacin y Desarrollo Econmicos, Pars. Sleisenger, M.H. y Fordtran, J.S. (1989). Gastrointestinal Disease. Volume 1, Pathophysiology Diagnosis Management. 4th Edition. W.B. Saunders Co., Toronto. pp 685-689. US Pharmacopeia (1990). Vol. XXI, NF XVII. United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, MD. 1788 pp.
Evaluacin de la posible alergenicidad

La alergenicidad potencial de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 expresada en la soja GTS 40-3-2 se evalu con (1) la inmunoreactividad de las protenas de la soja separadas con anticuerpos IgE de suero de individuos alrgicos a la soja; (2) las propiedades fisicoqumicas de la protena en comparacin con las de las protenas alergnicas conocidas; (3) la labilidad de la protena en jugos gstricos e intestinales simulados; (4) las similitudes entre su secuencia de aminocidos y la de otras 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa vegetales que ocurren naturalmente y la de de protenas alrgenas conocidas y (5) la exposicin a la protena estimada en la dieta en funcin de su concentracin en los alimentos.

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Inmunoreactividad con suero de individuos sensibilizados

Los extractos de protena se prepararon a partir de harina de soja sin tostar y sin grasa elaborada a partir de soja GTS 40-3-2, de la soja progenitora A5403 y a partir de tres preparaciones de harina de soja comerciales y se separaron con electrofresis en gel de poliacrilamida con sulfato dodecil sdico. Las protenas separadas se sometieron a electrotransferencia con una membrana de fluoruro de polivinilideno y se les agreg una sonda de anticuerpos IgE de una mezcla de suero de varios individuos sensibles a los productos elaborados a partir de la soja segn se determin mediante ingestin directa (Burks et al. 1988). Los anticuerpos IgE de individuos normales y sensibles a los cacahuetes o manes se emplearon como control con el fin de determinar la especificidad de anticuerpos similares de individuos sensibles a la soja. Las cantidades relativas y el tipo de protenas alrgenas endgenas son similares en todas estas preparaciones, lo que demuestra que el perfil de protenas alrgenas no sufri modificaciones significativas durante la produccin de la soja GTS 40-3-2.
Propiedades fisicoqumicas de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4

Si bien el peso molecular de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4, 47,6 kDa, se encuentra dentro del rango de 10 y 70 kDa caracterstico de muchas protenas alrgenas, sus otras propiedades fisicoqumicas no son las de la mayora de las protenas alrgenas. La 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 no es termoestable y toda su actividad enzimtica detectable as como tambin su estructura terciaria desaparecen (segn se determin con la prdida de reactividad con ELISA) al tostarla durante la elaboracin (Padgette et al. 1993). La protena purificada pierde rpidamente su actividad con tratamiento trmico (65C durante 15minutos) lo que permite predecir la inestabilidad de la protena durante la elaboracin. La mayora de las protenas alrgenas son glucosiladas por lo cual se buscaron porciones de carbohidratos en la protena 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 pero se comprob que esta protena no est glucosilada (Harrison et al. 1993). La ausencia de glucosilacin se esperaba ya que la adicin de carbohidratos slo ocurre si la protena pasa a travs del retculo endoplasmtico grueso y del aparato de Golgi, pasaje que solo ocurre con secuencias dirigidas especficas en el extremo N de la protena que no se incluyeron en la construccin de la 5enolpiruvilsiquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4. El objetivo del producto gnico que codifica la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 es el cloroplasto, donde se efecta la biosntesis de aminocidos aromticos, que no necesita ni promueve la glucosilacin.
Estabilidad en la digestin in vitro

Es probable que para que un compuesto provoque alergia, este compuesto debe obligatoriamente alcanzar y atravesar la membrana mucosa del intestino e ingresar al sistema circulatorio. Es ms probable que una protena que permanece estable a las proteasas cidas y a las condiciones proteolticas del estmago y del intestino respectivamente, alcance la mucosa intestinal. La actividad proteoltica no afecta a muchas protenas alrgenas, aunque la gran mayora an no se han estudiado (King et 125

al. 1967; Kortekangas-Savolainen et al. 1993; Onaderra et al. 1994; Taylor 1992; Taylor et al. 1987; Metcalfe 1985). La 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 es sumamente susceptible a la degradacin (Ream et al. 1993) tanto en jugos gstricos simulados (por ejemplo, digestin con pepsina; T50 < 15 segundos) como en jugos intestinales simulados (por ejemplo, digestin con tripsina ; T50 < 10 minutos), como ya se mencion en el Captulo 9 (Toxicidad). La mayora de las protenas alrgenas no son lbiles a la digestin por proteasas del tracto digestivo de los mamferos, una prueba ms de la ausencia de potencial alrgeno de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4.
Anlisis de la secuencia de aminocidos

La secuencia de aminocidos de la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 que se predijo se compar con las secuencias de amino cidos de 121 protenas alrgenas conocidas de tres bases de datos de protenas (Genpept, Pir protein y Swissprot) con el programa informtico FASTA (Pearson y Lipman 1988). No se observaron homologas significativas del punto de vista biolgico (Doolittle 1990) y tampoco se observaron similitudes significativas del punto de vista inmunolgico con las secuencias de aminocidos contiguos alergenos conocidos empleando en la comparacin eptopos de ocho aminocidos.
Prevalencia en los alimentos

La concentracin de las protenas alrgenas en los alimentos constituye un factor importante en la determinacin del potencial alergnico. La mayora de las protenas alrgenas estn presentes en los alimentos en cantidades abundantes que varan entre el 1 y el 80% del total de protenas (Fuchs y Astwood 1996). Esto se aplica a los alrgenos de la leche (Taylor et al. 1987), de la soja (Burks et al. 1988), y del man o cacahuete (Barnett et al. 1983). El poroto de la soja, por el contrario, contiene muy poca cantidad de 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 (0,03% del peso hmedo, o 0,08% del total de protenas).
Conclusin

El Cuadro 7 contiene un resumen de la informacin y los anlisis descritos que permiten concluir que la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 no proviene de una fuente alergnica, su secuencia no presenta similitudes importantes del punto de vista inmunolgico con la de los alrgenos conocidos y no posee las caractersticas de las protenas alrgenas conocidas. Por otra parte, la rpida digestin de esta protena in vitro en condiciones similares a las de la digestin en el ser humano, indica que no hay motivo para creer que la 5enolpiruvil-siquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 expresada en la planta presenta riesgos alergnicos significativos debido al consumo de productos elaborados a partir de la soja GTS 403-2.
Caractersticas de las protenas alrgenas conocidas1

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Caracterstica

Alergenos

Alergenicidad de la fuente del gen Peso molecular entre 10 y 70 kDa Glucosilacin Similitudes con la secuencia de alrgenos Estabilidad en la digestin Estabilidad en la elaboracin Presente en grandes cantidades en los alimentos 1. Segn Taylor (1992) y Taylor et al. (1987). 2. En general, pero no de forma absoluta.

si si si2 si si si si

5enolpiruvilsiquimato-3 fosfato sintetasa de la cepa CP4 no si no no no no no

Referencias

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Kortekangas-Savolainen, O., Savolainen, J. y Einarsson, R. (1993). Gastrointestinal stability of bakers yeast allergens: an in vitro study. Clin. Exp. Allergy 23, 587-590. Anderson, J.A. (1996): Allergic reactions to foods. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 36, S19-S38. Metcalfe, D.D. (1985). Food allergens. Clin. Rev. Allergy 3, 331-349. Metcalfe, D.D., Astwood, J. D., Townsend, R., Sampson, H. A., Taylor, S. L. y Fuchs, R. L. (1996): Assessment of the allergenic potential of foods derived from genetically engineered crop plants. Critical Reviews in Food Science and Nutrition 36, S165-S186. Onaderra, M., Monsalve, R.I., Mancheno, J.M., Villalba, M., Martinez Del Pozo, A., Gavilanes, G. y Rodriguez, R. (1994). Food mustard allergen interaction with phospholipid vesicles. Eur. J. of Biochem. 225, 609-615. Padgette, S.R., Nida, D.L., Biest, N.A., Bailey, M.R. y Zobel, J.F. (1993). Glyphosate tolerant soybeans in the U.S. in 1992: Field test, processing studies, and analytical evaluation. Monsanto Study 92-01-30-02, Technical Report MSL-12906, St. Louis, MO. Parker, S. L., Leznoff, A., Sussman, G. L., Tarlo, S. M. y Krondl, M. (1990): Characteristics of patients with food-related complaints. Journal of Allergy and Clinical Immunology 86, 503-511. Pearson, W. y Lipman, D. (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448. Ream, J.E., Bailey, M.R., Leach, J.N. y Padgette, S.R. (1993). Assessment of the in vitro digestive fate of CP4 EPSP synthase. Monsanto Study 92-01-30-15, Technical Report MSL-12949, St. Louis, MO. Sampson, H. A. (1990): Immunologic mechanisms in adverse reactions to foods. Immunology and Allergy Clinics of North America 11, 701-706. Sampson, H. A. y Burkes, A. W. (1996): Mechanisms of food allergy. Annual Review of Nutrition 16, 161-177. Taylor, S.L. (1992). Chemistry and detection of food allergens. Food Technol. 39, 146-152. Taylor, S.L., Lemanske Jr., R.F., Bush, R.K. y Busse, W.W. (1987). Food allergens: Structure and immunologic properties. Ann. Allergy 59, 93-99.

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Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional

La composicin de la soja resistente al glifosato y de la soja control (el progenitor A 5403) se analiz en los nueve predios cosechados en 1992. Estos nueve sitios se escogieron como representativos de la vasta rea geogrfica en la que se planta la soja. Adems, en 1993 se efectuaron otros cuatro ensayos de campo y se efectuaron algunas mediciones analticas. El objetivo de las mediciones fue determinar los efectos del gen y la protena introducidos, por lo tanto , el material de ensayo se obtuvo de sojas sin aplicacin de glifosato. Si bien muchos de los anlisis se efectuaron con el poroto de la soja, tambin se elaboraron productos a base de soja GTS 40-3-2 para efectuar otros estudios, por ejemplo: la harina de soja porque constituye el principal producto proteico de soja que se emplea en piensos, la harina desgrasada porque es la base para un gran nmero de productos elaborados a base de soja que se utilizan como alimento y el concentrado proteico de harina desgrasada porque se utiliza como alimento. Adems se elabor lecitina cruda y aceite refinado, blanqueado y desodorizado.
Anlisis de la composicin aproximada

La composicin aproximada, es decir, las concentraciones de carbohidratos, protenas, lpidos, fibras y cenizas, expresadas en base al peso seco, de los porotos de soja GTS 40-3-2 y de la soja progenitora control A5403 se midieron segn los procedimientos de Mtodos Cenizas: La muestra se coloc en un horno a 550 C y se separ la materia orgnica voltil. El residuo se cuantific gravimtricamente y se midi el porcentaje de ceniza (AOAC mtodo 923.03, 1990): El lmite inferior de confianza de este mtodo es 0,2% con una muestra de 3 g. Carbohidratos: El contenido de carbohidratos se calcul con valores de peso hmedo y restando segn la ecuacin: (USDA Agricultural Handbook No. 8, 1975): % de carbohidratos = 100% - (% de protenas + % de lpidos + % de cenizas + % de humedad) Fibra cruda: La fibra cruda se calcula como la perdida por incineracin del residuo obtenido de la digestin de las muestras con soluciones de cido sulfrico al 1,25% y de hidrxido de sodio al 1,25% en condiciones controladas (AOAC mtodo 7.0667.070, 1984). El lmite inferior de confianza de este mtodo es 0,2% con una muestra de 2 g.

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Lpidos: Los lpidos se extrajeron con ter y hexano. El extracto se lav con una solucin bsica diluida y se filtr con una columna de sulfato sdico. El residuo se evapor, se sec y se pes (AOAC mtodo 920.39C). El lmite inferior de confianza de este mtodo 0,1% de lpidos con una muestra de 2 g. % de humedad: La muestra se sec hasta peso constante en un horno de vaco a 133C (aproximadamente 2 horas) (AOAC mtodo 44-15A, 1987). La prdida de humedad se determin gravimtricamente. Protenas: La muestra se digiri con cido sulfrico y una mezcla cataltica de sulfato de potasio, dixido de titanio y sulfato cprico para convertir las protenas y otros compuestos con nitrgeno orgnico en sulfato de amonio. El pH cido del producto se convirti a bsico y el amonio se destil y se titul con un estndar cido. Se determin el porcentaje de nitrgeno y el resultado se convirti a protenas utilizando el factor 6,25 (AOAC mtodo 988.05, 1990). El lmite inferior de confianza de este mtodo es 0,1% de protenas (0,02% de nitrgeno) con una muestra de 1 g. Resultados Los anlisis de la composicin de protenas, lpidos, fibras, cenizas y carbohidratos de los porotos de las sojas GTS-40-3-2 y de la soja control de nueve ensayos de campo de 1992 y de cuatro de 1993 se encuentran en las Figuras 22 y 23, respectivamente. No se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico en ninguno de los componentes medidos en los porotos de las soja GTS 40-3-2 y en la soja control y excepto los carbohidratos totales, los valores medidos se encuentran dentro de los rangos citados en la literatura cientfica. La media del contenido de carbohidratos de los porotos de la soja GTS 40-3-2 en el estudio de nueve sitios es 37,1% del peso seco, en comparacin con un mximo de 34% citado en la literatura. Del punto de vista de la inocuidad, la diferencia no se considera significativa debido a que la concentracin media de carbohidratos en los porotos de la soja control cosechados en los mismos sitios es 38,1% del peso seco.

Figura 22. Composicin aproximada de los porotos. Las barras representan las medias de los porotos de nueve sitios, los tringulos indican los valores mximos y mnimos de cada componente citados en la literatura.

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Figura 23. Composicin aproximada de los porotos. Las barras representan las medias de los porotos de cuatro sitios en 1993, los tringulos indican los valores mximos y mnimos de cada componente citados en la literatura.

Los mismos anlisis se efectuaron en muestras de harina tostada (Figura 24) y sin tostar y en muestras de concentrados de protenas elaborados con porotos de la soja GTS 40-3-2 y de la soja control no transgnica. No se observan diferencias apreciables en los contenidos de macronutrientes.

Figura 24. Composicin aproximada de la harina tostada. Las barras representan las medias de los tres estudios de elaboracin, los tringulos indican los valores mximos y mnimos de cada componente citados en la literatura.

Composicin de aminocidos

Mtodos Las muestras de porotos se sometieron a hidrlisis cida con HCl 6N, se ajust el pH a 2,2 y se cuantific cada aminocido con un analizador de aminocidos automtico con un dispositivo de derivacin de ninhidrina post columna y un sistema de deteccin colorimtrica (Moore & Stein 1954). Resultados No se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico en los contenidos de los 18 aminocidos medidos, incluso los aminocidos aromticos, entre los porotos de la soja GTS 40-3-2 y de la soja control no transgnica.

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Figura 25. Anlisis de los aminocidos de los porotos. Las barras representan la concentracin media de cada aminocido de las muestras de porotos de soja de los nueve ensayos de campo de 1992. Los tringulos indican los valores mximos y mnimos citados en la literatura. Varios de los valores citados en la literatura se calcularon convirtiendo los gramos de aminocido cada 100 g de protena a gramos de aminocido cada 100 g de muestra con el factor 41,5%, es decir, la concentracin media de protenas de los porotos analizados.

La ruta del siquimato juega un papel clave en el metabolismo de los vegetales y se estima que aproximadamente un quinto del carbono que fijan las plantas se canaliza por esta ruta (Haslam 1993). Segn ciertos estudios, la 5-enolpiruvil-siquimato-3fosfato sintetasa no limita la tasa de la ruta metablica del siquimato, sino que la regulacin se efecta en el primer paso donde se convierte la eritrosa 4 fosfato en 2ceto 3-desoxi D-arabino heptulosonato 7-fosfato en la reaccin catalizada por la sintetasa correspondiente. Esto corrobora la ausencia de diferencias en los contenidos de aminocidos aromticos de los porotos de las sojas GTS transgnicas y de las no transgnicas detectada (Weiss y Edwards 1980). Por lo tanto, no se espera que un aumento de la actividad de la 5-enolpiruvil-siquimato 3-fosfato sintetasa cause un aumento de los contenidos de compuestos aromticos en las plantas. Por otra parte, se ha observado que clulas vegetales que expresan 40 veces ms la 5-enolpiruvilsiquimato 3-fosfato sintetasa que los cultivos de clulas de genotipos silvestres no producen aminocidos aromticos en exceso (Smart et al. 1985).
Composicin de cidos grasos

Mtodos Las muestras de porotos de soja o de aceite de soja refinado se destilaron con una mezcla de cloroformo y metanol saponificada con hidrxido de potasio alcohlico. Los cidos grasos se extrajeron con hexano, se lavaron con agua y se secaron con sulfato sdico. Los cidos grasos se esterificaron con metanol empleando trifluoruro de boro como catalizador, se captaron con heptano y se analizaron por cromatografa de gases (AOAC mtodo 983.23 1990). La abundancia porcentual de steres metilo de cidos grasos individuales se calcul en relacin al total de steres metilo de cidos

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grasos presente. El menor intervalo de confianza de este mtodo fue de 0,1% de un ster metilo de cido graso individual. Resultados La abundancia relativa de cada cido graso se determin en muestras de aceite de soja refinado, blanqueado y desodorizado y de porotos de la soja GTS 40-3-2 y de la soja control no transgnica (Figura 26). La composicin de cidos grasos del poroto de la soja GTS 40-3-2 y de la soja control no presenta diferencias significativas del punto de vista estadstico, excepto por el contenido de C 22:0, el que representa menos del 0,6% del total de la fraccin de cidos grasos. Todos los valores, incluso el del C22:0, obtenidos de las muestras de porotos se encuentran dentro de los rangos normales citados en la literatura para cada uno de los cidos grasos.

Figura 26. Anlisis de los cidos grasos del poroto. Las barras representan la concentracin media de cada cido graso determinada en muestras de porotos de los nueves sitios del ensayo de campo realizados en los Estados Unidos en 1992. Los tringulos indican los valores mximos y mnimos citados en la literatura para cada cido graso.

La lecitina, un fosftido que se obtiene del aceite de soja crudo, se utiliza como emulsionante, lubricante y estabilizador (Waggle y Kolar, 1979). Las mismas muestras de aceite refinado, blanqueado y desodorizado elaborado a partir de soja GTS 40-3-2 y de soja no transgnica que se emplearon para los anlisis de cidos grasos se emplearon para obtener fracciones de lecitina. Estas se analizaron para obtener la composicin de fosftidos (fosfatidil etanolamina, cido fosfatdico, fosfatidil inositol, fosfatidil colina) (AOAC mtodo Ja 7b-91). La abundancia relativa de cada uno de los fosftidos en las fracciones de lecitina cruda del aceite de soja elaborado a partir de la soja GTS 40-3-3 es similar.

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Figura 27. Anlisis de la lecitina cruda en muestras de aceite de soja refinado, desodorizadoy blanqueado elaborado a partir de porotos de soja cosechados de los 4 ensayos de campo de 1993 en Estados Unidos. Los valores de los componentes de la fraccin de lecitina cruda no estn citados en la literatura cientfica.

Protenas del poroto de soja

Los perfiles de las protenas de almacenamiento del poroto de la soja GTS 40-3-2 y de la soja control no transgnica se compararon con electrofresis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico. No se observaron diferencias apreciables entre la soja transgnica y la soja control (Figura 28). Esta ausencia indica que la composicin general de las protenas de los porotos de la soja GTS 40-3-2 y de la soja control no difiere sustancialmente.

Figura 28. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico de las protenas del poroto con tincin con azul de Coomassie. Se extrajeron muestras de mezclas de semillas de soja GTS 40-3-2 (fajas B, E, H), de la soja control A5403 no transgnica (fajas A, D, G) y de una soja GTS 61-67-1 (fajas C, F, I), que se desnaturalizaron con dodecil sulfato sdico y con 2-mercaptoetanol al 1% y se analizaron con electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sdico con un gradiente de poliacrilamida de 4 a 20%. En cada uno de los tres pocillos se cargaron alcuotas equivalentes a 25, 12 y 6,25 ug de protenas de cada muestra de soja.

Contenido de antinutrientes

La soja es una fuente natural de varios compuestos con propiedades antinutritivas. Entre estos se encuentran los inhibidores de la proteasa, por ejemplo el inhibidor de la tripsina de la soja, las lectinas (por ejemplo, la hemaglutinina de la soja), las isoflavonas y los fitatos que forman compuestos con el fsforo inorgnico de la semilla as como tambin con otros iones metlicos, por ejemplo el hierro, el calcio, el zinc y el magnesio, que impiden que estos iones estn disponibles del punto de vista nutritivo. Los contenidos de estos antinutrientes se determinaron en muestras de porotos de soja GTS 40-3-2 y en harina de soja tostada que se emplea en piensos, y luego se compararon con los contenidos de la soja progenitora no transgnica.
Inhibidores de la tripsina

Las propiedades antinutrientes de los inhibidores de la tripsina en productos elaborados a partir de la soja sin tratamiento trmico ha sido el tema central de muchos estudios (Rackis et al, 1986). La destruccin de los inhibidores de la tripsina que causa la ausencia de efectos hipertrficos en el pncreas constituye un paso 134

importante en la elaboracin de productos de muy buena calidad proteica a partir de soja cruda (Anderson et al. 1979). La actividad inhibidora de la tripsina se midi en extractos de porotos de soja cruda o de harina tostada de pH bsico (pH entre 9,5 y 9,8), incubados con una concentracin conocida de tripsina y con aadido de benzolo D-arginina p nitroanilido. Luego de diez minutos de reaccin se midi la absorbancia a 410 nm. La tripsina no inhibida cataliza la hidrlisis del benzolo D-arginina p nitroanilido formando una pnitroanilina de color amarillo. La unidad de tripsina se define como el aumento equivalente a 0,01 unidades de absorbancia a 410 nm transcurridos10 minutos con 10 ml de volumen de reaccin. El lmite inferior de confianza de este mtodo es de una unidad de inhibidor de la tripsina por mg de muestra, con una muestra de 1 g. No se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico en la actividad de los inhibidores de la tripsina entre los extractos de porotos de soja GTS 40-3-2 crudos y de soja control no transgnica (Figura 29). La elaboracin comn de la harina de soja para obtener harina de soja tostada elimina ms del 90% de la actividad de los inhibidores de la tripsina, tanto con soja GTS 40-3-2 como con la soja control (Figura 8.9).

Figura 29. Actividad de los inhibidores de la tripsina en harina de soja cruda y tostada. Las barras representan los resultados de los estudios por duplicado, los tringulos indican los valores mximos y mnimos de actividad del inhibidor de la tripsina de la harina de soja tostada citados en la literatura.

Anlisis de lectinas

Las lectinas vegetales son una clase de protenas con alta afinidad de enlace a carbohidratos que contienen glucoprotenas, que habitualmente se encuentran presentes en las paredes o en la membrana plasmtica de la clula vegetal. El enlace de las lectinas a las glucoprotenas de la superficie de la clula puede causar aglutinacin, mitosis y otros cambios bioqumicos en la clula. La ingestin de lectinas, por ejemplo, de la hemaglutinina de la soja, se asocia a varios efectos antinutritivos y a patologas de enfermedades. Segn la literatura, el 25% de la inhibicin del crecimiento observada en ratas se atribuye a la lectina ingerida con la harina de soja cruda (Leiner 1953) aunque recientemente algunos investigadores concluyeron que en el caso de la soja la aglutinina no juega un papel clave en la determinacin de la calidad nutritiva de la protena (Leiner 1980). Segn otros

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autores, existen pruebas circunstanciales de la contribucin considerable de la lectina de la harina de soja cruda ingerida a la inhibicin del crecimiento (Pusztai 1989). Los contenidos de lectina en la harina de soja cruda y tostada se estimaron midiendo la hemaglutinacin de varios extractos en glbulos rojos de conejo (Leiner, 1955; Klurfeld y Dritchevski, 1987). No se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico entre la actividad de la lectina de la soja GTS 40-3-2 y la de la soja control no transgnica. La hemaglutinacin con harina de soja cruda es inferior a 7 unidades de hemaglutinacin por mg de protena y casi no se detect en muestras de harina de soja tostada (Figura 30). La variabilidad de los grupos de glbulos rojos no permiti comparar la actividad de la hemaglutinina de la harina de soja cruda con los valores publicados en la literatura, entre 60 y 426 unidades de hemaglutinacin/g de protena. La sensibilidad del estudio se determin con pruebas de control positivo con lectina de soja purificada, en los que se registraron entre 461 y 541 unidades de hemaglutinacin/mg de protena.

Figura 30. Anlisis de lectina en harina de soja cruda y tostada. Las barras representan las medias obtenidas de muestras con mezclas de porotos cosechados de los nueve ensayos de campo efectuados en 1992. Los valores estn expresados en unidades de hemaglutinacin por mg de protena.

Anlisis de isoflavonas

La daidceina, la genisteina y el coumestrol son isoflavonas que estn naturalmente en la soja y cuya ingestin causa alteraciones bioqumicas en las distintas especies de mamferos, incluso actividad estrognica e hipocolesterolemica (Wang et al. 1990; Murphy 1982). La literatura tambin las cita como causantes de los efectos nocivos observados en ganado alimentado con harina de soja (Setchell et al. 1987). La daidceina y la genisteina libres y enlazadas a otros compuestos en muestras de harina de soja cruda y tostada se separaron y los contenidos se determinaron con cromatografa de lquidos de alta presin (Pettersson y Kiessling, 1984). Las concentraciones de isoflavonas libres y totales se calcularon en extractos de las muestras y post hidrlisis cida para liberar las isoflavonas enlazadas a otros compuestos, respectivamente. La concentracin de isoflavonas enlazadas a otros compuestos se calcul restando estos dos valores.

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No se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico entre los contenidos de ninguna isoflavona de la harina de soja cruda o tostada elaboradas a partir de la soja GTS 40-3-2 y de la soja control no transgnica (Figura 31). Las diferencias observadas entre los valores obtenidos de los porotos de soja de los distintos ensayos de campo se atribuyen al efecto del medioambiente en la formacin de estos compuestos en las plantas.

Figura 31. Anlisis de daidceina y genisteina en harina de soja cruda y tostada. Las barras de los porotos representan las medias de los contenidos de isoflavonas de los porotos cosechados en los nueve ensayos de campo de 1992. Las barras de harina tostada son las medias de los tres estudios de elaboracin. Las lneas finas son los rangos de los valores determinados experimentalmente y los tringulos los valores mximos y mnimos citados en la literatura.

Anlisis de estaquiosa, rafinosa y fitatos en la harina de soja

La estaquiosa y la rafinosa, carbohidratos de bajo peso molecular, causan flatulencia, una caracterstica bien conocida de los productos elaborados a partir de la soja (Rackis 1976). El cido ftico (fitato) es un derivado cido hexafosfrico del inositol y en el poroto se presenta principalmente como un complejo de calcio, magnesio y potasio insoluble y no disponible del punto de vista nutritivo (Mohamed et al. 1991). Los piensos para animales monogstricos (por ejemplo, aves, peces y cerdos) que no digieren el fitato tienen un suplemento de fsforo y otros minerales o se les agrega fitasa, la enzima que degrada el fitato. Los contenidos de estaquiosa y rafinosa en extractos preparados a partir de harina de soja tostada se determinaron con cromatografa de lquidos de alta presin (Dunmire y Otto 1979). El cido ftico se extrajo con HCl diluido y se separ de los fosfatos inorgnicos con cromatografa de intercambio aninico (Ellis y Morris 1983). Los fitatos enlazados a otros compuestos se lavaron con una solucin de NaCl y se digirieron con una mezcla de cidos ntrico y sulfrico para liberar los fosfatos libres. Estos se cuantificaron por espectrofotometra luego de la reaccin con molibdato de amonio y cido sulfnico. Los valores obtenidos se convirtieron a cido ftico empleando la equivalencia de peso molecular y el lmite inferior de confianza del anlisis es 0,028% de cido ftico con una muestra de 2 g. No se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico en los contenidos de estaquiosa, rafinosa y fitato, respectivamente, medidos en muestras de

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harina de soja elaborada a partir de soja GTS 40-3-2 y de la soja control no transgnica (Figura 32).

Figura 32. Anlisis de ftato, estaquiosa y rafinosa en harina tostada. Las barras representan las medias de los tres estudios de elaboracin, los tringulos indican los valores mximos y mnimos de cada componente citados en la literatura.

Biodisponibilidad de nutrientes: confirmacin con estudios de alimentacin de animales

Los estudios de alimentacin con ratas de laboratorio, pollos de asar, bagres y vacas lecheras se realizaron con el fin de determinar si la modificacin gentica de la soja GTS 40-3-2 altera de forma negativa la integridad (es decir, la capacidad para promover el crecimiento y el bienestar tpicos del animal) de los productos elaborados. Las ratas se alimentaron con harina de soja elaborada y sin elaborar por dos motivos: en primer lugar porque la mayora de los alimentos y piensos con soja cuentan con un tratamiento trmico y en segundo lugar porque las ratas son similares a los mamferos salvajes que pueden ingerir la soja plantada en el campo. En pollos de asar se midi el crecimiento durante seis semanas porque aproximadamente el 49% de la soja que se emplea como pienso se destina a alimentar pollos. El estudio en vacas lecheras se efectu durante cuatro semanas porque la soja cruda se utiliza como fuente de protenas para los rumiantes. El estudio en bagres (orden Siluriformes) se realiz porque la harina de soja se usa en raciones acucolas comerciales para la acuicultura. Por ltimo, se realiz un estudio de 5 das en codornices (Colinus virginianus) ya que las aves se alimentan de los restos de soja que quedan en el campo luego de la cosecha. Mtodos Un grupo de ratas Charles River CD hembras y machos de ocho semanas de edad se alimentaron durante cuatro semanas con raciones compuestas de harina elaborada y sin elaborar de soja GTS 40-3-2 y de la soja control no transgnica, ad libitum, con hasta 24,8% y 10% de sustitucin, respectivamente. El consumo de racin y el peso corporal se midieron una vez por semana y la mortalidad y los signos clnicos adversos se controlaron dos veces por da. Al finalizar el estudio se sacrificaron todos los animales y se realiz una necropsia. Se pesaron los hgados, los testculos y los riones y se recolectaron aproximadamente 40 muestras de tejidos de cada animal que se conservaron adecuadamente. Los pesos corporales del animal vivo, el peso acumulado, la ganancia de peso y el consumo de racin de los grupos control y en estudio se compararon con la prueba de (Falta continuar con la traduccin del parrafo, pgina 198 del libro original)

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Estudio de alimentacin de seis semanas en pollos de asar: El estudio consisti en alimentar pollos de asar comerciales (White Plymouth Rock x White Cornish; Cobb 500 gallos jvenes x Cobb 500 pollas) con dietas que contenan harina elaborada de soja GTS 40-3-2 o de la soja control progenitora no transgnica A5403, con harina de maz como la nica otra fuente de protena. Las dietas se formularon de forma que contuvieran cantidades iguales de aminocidos esenciales (metionina, cistena, lisina, arginina, triptfano y treonina), no contenan otros medicamentos o aditivos para promover el creamiento y cumplan con los requisitos publicados por el National Research Council (Consejo nacional de investigacin) para piensos de aves. La mortalidad se verific todos los das y los pollos que murieron durante el estudio se pesaron, se realiz una necropsia y se determino la posible causa de la muerte. Se midieron los pesos corporales y el consumo de racin y al finalizar el estudio se sacrificaron todos los pollos y se disecaron y pesaron los msculos pectorales mayores y menores (de la pechuga) del lado derecho. La grasa abdominal tambin se extrajo y se pes. Estudio de alimentacin de cuatro semanas en vacas lecheras: Treinta y seis vacas Holando que estuvieran al menos en su segunda lactancia (entre 93 y 196 das de lactacin) se alimentaron con una racin mezclada (35% de heno de alfalfa, 17% de silo de maz y 37% de una mezcla de granos comercial) con un 10% (peso en peso en base a la materia seca) de soja GTS 40-3-2 cruda o de la soja control no transgnica A5403 cruda. Este contenido constituye el lmite superior de incorporacin de soja cruda en las dietas mezcladas que utilizan los productores lecheros para sus vacas. Adems se someti a las vacas a un perodo de adaptacin a dietas con alto contenido de soja antes de comenzar el estudio. Durante el estudio se recolectaron muestras de leche todos los das y se analiz la lactosa, la grasa, la protena y el recuento de clulas somticas. Adems durante los ltimos siete das del estudio se recolect toda la orina y las heces para determinar la digestibilidad de la materia seca y el balance de nitrgeno. Estudio de diez semanas en bagres: Un grupo de pececillos de bagre (Ictalurus punctatus), de la cepa Mississippi Select, se colocaron en una pecera de vidrio durante diez semanas y se los aliment con una racin que contena harina de soja GTS 40-32 o harina de la soja control no transgnica con las mismas proporciones de sustitucin que se emplean comercialmente (entre 45 y 47% peso en peso). Todas las dietas se formularon de forma tal que la concentracin final de protenas fuera del 32%. Los peces se pesaron al comenzar el estudio y en las semanas 2, 6 y 10; tambin se cuantific el consumo de racin restando el peso de los grnulos de racin no ingerida que se encontraba en el fondo de la pecera al total de racin suministrada. En las semanas 2, 6 y 10 se estim la relacin de conversin acumulada de la racin dividendo el total de racin suministrada hasta el momento entre la ganancia de peso total correspondiente, realizando el ajuste necesario por mortalidad. Al final del estudio se seleccionaron varios peces al azar, se prepararon muestras de mezclas de tejido comestible y se analiz la composicin aproximada. Resultados El ndice de conversin (el ndice de transformacin del pienso) de la soja GTS 40-32 y de la soja control no transgnica se resumi y se efectuaron comparaciones entre

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los estudios (Cuadro 5). El estudio en codornices no se incluy en la comparacin debido a su corta duracin (5 das). No se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico entre los piensos que contienen soja GTS 40-3-2 y los que contienen la soja progenitora A 5403. Estos resultados son consecuentes con los anlisis de la composicin exhaustivos que prueban que las propiedades nutritivas de la soja GTS 40-3-2 no difieren significativamente de las de la soja control.
Cuadro 5. Comparacin del ndice de conversin en los estudios de alimentacin.

Lnea

Ingesta de alimento: media (g/animal)

Indice de conversi n:media

Gananc ia de peso: media (g)


177a 165a,b 154b

Peso final: media (g)

Estudio de alimentacin en ratas (4 semanas). Soja elaborada


Machos

Control negativo Soja control A5403 GTS 40-3-2


Hembras

811 764 749

4,58 4,63 4,86

426a 415a,b 403b

549 8,23 66,7 256 Control negativo A5403 538 7,87 68,4 259 GTS 40-3-2 538 8,78 61,3 252 a,b: Las medias marcadas con distintas letras son diferentes del punto de vista estadstico p<0,05 Estudio de alimentacin en ratas (4 semanas). Soja sin elaborar
Machos

Control negativo A5403 5% A5403 10% GTS 40-3-2 5% GTS 40-3-2 10%
Hembras

753 755 769 750 768

6,55 7,26 7,25 7,35 6,86

115 104 106 102 112

431 421 424 420 430 241 231 238 237 236

510 12,6 40,6 Control negativo A5403 5% 493 16,3 30,2 A5403 10% 513 13,9 36,8 502 13,9 36,2 GTS 40-3-2 5% GTS 40-3-2 10% 491 14,2 34,6 Estudio de alimentacin en pollos de asar (6 semanas). Soja elaborada Soja control A5403 3893 1.816 2147 3844 1.832 2099 GTS 40-3-2 Estudio de alimentacin en bagres (10 semanas). Soja elaborada Soja control A5403 22,1 1,12 19,7 GTS 40-3-2 21,8 1,17 18,8 Estudio de alimentacin en vacas lecheras (4 semanas). Soja cruda partida

Sexo combinado no se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico p<0,05

2193 2144

Sexo combinado no se observaron diferencias significativas del punto de vista estadstico p<0,05

22,6 21,8

Lnea

Leche (kg/da)

Grasa (%)

Leche normalizad a 3,5% grasa (kg/da)

Ingesta energtic a neta (mcal/da )

Leche normalizad a / ingesta energtica neta (kg/mcal)

Soja 34,9 3,37 34,1a 40,1 0,81 control A5403 GTS 40-336,2 3,59 36,8b 42,9 0,88 2 a,b: Las medias marcadas con distintas letras son diferentes del punto de vista estadstico p<0,05

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Referencias

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