CHIMIE- SENZORI ELECTROCHIMICI

Cuprins
CHIMIE- SENZORI ELECTROCHIMICI................................................................................1 INTRODUCERE........................................................................................................................2 1. ELECTROZI CHIMIC MODIFICAI ELECTROCATALITICI............................................................................................................3 1.1. Principiul de construcie i de funcionare...........................................................................3 1.2. Mediatori redox utilizai n construcia electrozilor chimic modificai...............................5 1.4. Aplicaiile mediatorilor redox..............................................................................................6 1.5. Electrozi chimic modificai bazai pe enzime......................................................................8 1.5.1. Bioelectrocataliza..............................................................................................................9 2. APLICAIILE ELECTROZILOR CHIMIC MODIFICAI...............................................11 3. IMPORTANA DETERMINARII DOPAMINEI...............................................................19 3.1. Metode de determinare.......................................................................................................20 3.2. Reactivi i soluii ...............................................................................................................23 3.3. Aparatura ...........................................................................................................................23 BIBLIOGRAFIE.......................................................................................................................30

INTRODUCERE
Biochimia este o ramur de studiu a proprietilor i a comportamentului unor importante substane biochimice de tipul proteinelor, enzimelor, hormonilor, imunoglobulinelor i a acizilor nucleici. Cele mai recente cercetri n domeniul biologiei i medicinei se bazeaz pe dezvoltarea noilor tipuri de electrozi cu membran ion-selectivi i a senzorilor cu membran biocatalitici. Lucrarea de fa intenioneaz s exemplifice noile domenii in care electrozii chimic modificai i-au gsit utilitate precum i s prezinte o metod amperometric de determinare a dopaminei. Metoda se bazeaz pe folosirea unui electrod chimic modificat electrocatalitic (CME) a crui construcie i funcionare va fi prezentat n partea experimental. Activitatea electrocatalitic a senzorului chimic modificat permite obinerea unui rspuns optim la un potenial mic fat de electrodul de Ag/AgCl. Electrodul chimic modificat prezint o stabilitate bun pe parcursul utilizrii repetate, ct i n timp. n ultimii ani s-a demonstrat c electrozii posednd anumite grupri chimice legate n mod intenionat pe suprafaa lor, prezint anumite avantaje comparativ cu electrodul de baz. Una din proprietile lor cele mai importante, care au fcut obiectul unor studii intensive, o reprezint capacitatea CMEs de a cataliza oxidarea sau reducerea anumitor compui chimici care prezint suprapoteniale mari la nivelul electrozilor nemodificai, ei putnd fi determinai cantitativ prin intermediul metodei electrochimice tradiionale[1]. O alternativ pentru micorarea suprapotenialului o reprezint utilizarea CMEs coninnd mediatori redox adecvai, imobilizai pe suprafaa electrozilor convenionali [2]. n scopul studierii comportrii electrochimice a unor compui se folosesc deci aceti mediatori redox pentru a facilita procesele de transfer a electronilor [3]. Deoarece CMEs conduc la micorarea potenialului formal de oxidare sau reducere a unor compui chimici de importan biochimic, aceti electrozi au implicaii directe n domeniul chimiei analitice. n particular ei pot nbunti mult posibilitile de detecie electrochimic n cadrul cromatografiei de lichide (LCEC) unde selectivitatea i sensibilitatea sunt direct dependente de potenialul impus de electrod, n scopul realizrii reaciei dorite [4]. n acest sens, CMEs prin caracteristicile lor, i-au gsit multiple aplicaii ca detectori amperometrici n cadrul cromatografiei de lichide de nalt performan (HPLC).

1. ELECTROZI CHIMIC MODIFICAI ELECTROCATALITICI

1.1. Principiul de construcie i de funcionare
Un electrod chimic modificat poate definit ca reprezentnd o modificare raional intenionat a structurii moleculare a suprafeei electrozilor convenionali n scopul utilizrii lor n cadrul unor aplicaii specifice [5-13]. Electrozii chimic modificai (CMEs) se bazeaz pe fixarea unui centru redox pe suprafaa electrodului. Acesta funcioneaz ca un mediator pentru transferul rapid de electroni spre molecula de substrat, fiind oxidat sau redus lent (sau deloc n unele cazuri) la suprafaElectrozii chimic modificai (CMEs) se bazeaz pe fixarea unui centru redox pe suprafaa electrodului. Acesta funcioneaz ca un mediator pentru transferul rapid de electroni spre molecula de substrat, fiind oxidat sau redus lent (sau deloc n unele cazuri) la suprafaa unui electrod convenional. Principiul de baz implicat n funcionarea unui CME electrocatalitic bazat pe un mediator redox este reprezentat n figura 1.1., pentru un process general de oxidare. n aceast secvent compusul de determinat difuzeaz din soluie spre suprafaa electrodului, unde este oxidat n cadrul unei reacii chimice de ctre mediatorul n form oxidat. Potenialul electrodului este meninut la o valoare sufficient de pozitiv pentru ca forma oxidat a mediatorului s fie forma stabil, iar forma sa redus sa fie rapid oxidat la forma catalytic activ, n scopul reacionrii n continuare cu compusul de analizat. n principiu, mediatorul poate fi considerat c funcioneaz cu un transportor de electroni ntre electrod i compusul de analizat. Cazul discutat mai sus reprezint unul ideal, care n practic poate fi mult mai complex. Necesitatea unei astfel de medieri apare ori de cte ori viteza directa a transferului de electroni este mic, atunci cnd la nivelul unui electrod convenional este necesar aplicarea unui suprapotenial pentru a face ca reacia redox s aibe loc cu o vitez apreciabil [14-18]. Prin utilizarea unui CME oxidarea sau reducerea compusului de analizat are loc la valoarea potenialului redox al mediatorului. In concluzie, prin fixarea intenionat a unui mediator adecvat pe suprafaa electrozilor convenionali, acetia pot cpta noi proprieti, cum ar fi: mrirea vitezelor de reacie electrochimic i a selectivitii, eliminarea fenomenelor de adsorbie, precum i obinerea unor caracteristici optice speciale.

Un electrod chimic modificat ideal pentru aplicaii analitice, ceea ce presupune funcionarea continu de durat n sisteme n flux, trebuie s prezinte urmtoarele caracteristici: a) O bun stabilitate mecanic i chimic att ale electrodului de baz i a grupri modificatoare, precum i a legturii dintre electrod i acesta din urm; b) Reproductibilitatea pe o anumit perioad i stabilitate n timp a activitii gruprii modificatoare fa de compusul de analizat; c) d) e) f) Flexibilitate n capacitatea de legare a gruprii modificatoare; Un domeniu larg de linearitate a pspunsului; Cureni de baz mici i stabili pe domeniul de potenial utilizat; Compatibilitatea cu o gam larg de solveni apoi i organici.

n ultima perioad au fost folosite diferite procese de imobilizare a unor compui chimici pe electrozi de diferite tipuri (n ceea ce privete materialul i construcia acestora), dar majoritatea proceselor au avut la baz cteva tehnici: I. II. III. IV. Adsorbia direct a modificatorului pe suprafaa electrodului; Legarea covalent a modificatorului la un centru specific al suprafeei; Acoperirea fizic a suprafeei cu un polimer coninnd modificatorul; Amestecarea modificatorului cu o matrice conductiv (past conductiv).

Dintre cele patru metode de fabricare prezentate, ultimele dou par s fac cea mai posibil obinerea unui electrod ideal. Folosirea CMEs n chimia analitic se bucur de un success considerabil. Prin modificarea chimic a suprafeei electrozilor a fost posibil obinerea unei varieti de electrozi chimic modificai prin intermediul crora pot fi determinai un numr mare de compui chimici. Datorit selectivitii i sensibilitii mrite, electrozii chimic modificai sunt ideali pentru electroanalize. CMEs i-au gsit largi aplicaii, dintre care n: electroanaliz, preconcentrare, permeabilitate selectiv recunoatere specific, calea fiind nc deschis i spre alte aplicaii [19-24].

1.2. Mediatori redox utilizai n construcia electrozilor chimic modificai

Mediatorii redox sunt utilizai n construcia senzorilor biochimici utilizai n diferite scopuri. Datorit dificultilor de a realiza un transfer direct de electroni ntre enzyme i electrozi s-a apelat la utilizarea unor molecule mici electroactive care se numesc mediatori, acetia mrind viteza cu care are loc transferul de electroni. Mediatorii redox sunt molecule chimice organice sau compleci organici care pot avea proprieti catalitice asupra unor compui. Compusul de analizat (substratul n forma redus Sred) difuzeaz n soluie spre suprafaa electrodului, unde este oxidat n urma reaciei chimice cu forma oxidat a mediatorului (Mox). La nivelul electrodului se aplic un potenial sufficient de pozitiv pentru ca forma stabil a mediatorului (Mred) rezultat n urma reaciei electrochimice cu schimb de electroni s fie rapid reoxidat la forma activ catalytic. 1.3. Proprietile mediatorilor redox Un mediator ideal prezint proprietile: 1. 2. 3. 4. 5. stoechiometrie a reaciei cu transfer de electroni bine definit. un potenial formal E0 cunoscut. un transfer electronic omogen i heterogen rapid. solubilitate mare n mediu apos la pH apropiat de 7. stabilitate n forma oxidat ct i redus.

6. s nu prezinte interferene optice n domeniul n care se face determinarea compusului de analizat. 7. s nu interacioneze cu compusul de analizat ntr-o manier care s altereze potenialul su redox. n general se recomand utilizarea mai multor mediatori redox n scopul studierii interaciei dintre acetia i biocomponentul de analizat. Este de dorit ca potenialul redox al biocomponentului s nu varieze, n caz contrar se poate presupune existena unei interacii ntre mediatorul redox i biocomponent. Potenialulu formal al compusului de analizat este un alt criteriu important n alegerea mediatorului. Potenialul formal al mediatorului ar trebui s fie nul la nceperea studierii biocomponentului. Parametrul care urmeaz s fie msurat nu trebuie s varieze la utilizarea unui variator, astfel interacia mediator-compus nu mai are loc corespunztor.

1.4. Aplicaiile mediatorilor redox Dintre mediatorii cu proprieti catalitice se menioneaz: ftalocianinele, porfirinele, compuii fenantrolinici. Dintre cei mai bine cunoscui mediatori putem meniona Co-ftalocianinele (depuse pe un electrod de pasta de crbune) i polimerul de ruteniu organic, electrodepus pe electrodul de Pt sau de crbune sticlos. Acetia au fost frecvent folositi datorit activitii lor catalitice pentru o mare varietate de analii i datorit solubilitii limitate, care le permit s fie stabili dup depunerea pe suprafaa electrodului. Compuii asupra crora au aciune o-ftalocianinele depuse pe electrod sunt: hidrazinele, tiolii, acidul uronic. n procesul redox ce are loc, se realizeaz electrooxidarea Co(II) din centrul catalytic activ, la Co(III). Baldwin i colaboratorii si [25-29] au descries metode pentru determinarea hidrazinei, cisteinei, glutationului, carbohidrailor i polialcoolilor. Ali mediatori sunt complecii cu Mn(III) i Fe(III) depui pe electrodul de past de crbune. Ei pot cataliza reducerea oxigenului. Recent, complecii de Fe(II)-fenantrolin au fost introdui ca mediatori pentru electrozii de past de crbune n scopul oxidrii sau reducerii catalitice a oxizilor de azot, SO2 , clorailor i H2S, n sisteme speciale n flux. Albastrul de Prusia prezint activitate catalitic fa de reducerea oxigenului sau a compulor peroxidici n medii acide i a fost utilizat ca mediator depus pe electrod de Au. A fost menionat i un grup de electrozi pe care se depun straturi de oxizi metalici. Dei din punct de vedere ethnic nu puteau fi considerai CMEs, ei ei se asemnau cu acetia datorit aplicaiilor numeroase n cromatografia de lichide. Dintre matalele folosite pot fi amintite Pt, Au, Ni, Cu, Ru. La folosirea metalelor nobile ca Au sau Pt stratul de oxid a dovedit o activitate catalitic capabil s medieze reacii de dehidrogenare sau oxidare a unui numr important de compui. ntotdeauna produi de reacie ai procesului anodic sunt puternic adsorbii pe metal, ceea ce conduce la ntreruperea semnalului, datorit blocrii sistemelor active de pe suprafa, necesare pentru noi procese de oxidare. Ali compui foarte importani detectai cu aceti electrozi sunt: carbohidraii, derivai ai acestora, aminoacizi. Electrozii de past de crbune care conineau eteri coroan, tropolone i fenantroline, au fost folosii la determinarea Co i Pb. Unii electrozi au fost modificai prin folosirea la suprafaa lor a unui film polymeric care conine compui de tip violagenic, chinone i bipiridin ruteniu legat de polivinil-piridina. O serie de mediatori redox au fost utilizai n construcde mediatori redox au fost utilizai n construcia electrozilor chimic modificai cu enzyme: ferocenii, O-fenilendiamine, chinone, fenoxazine, fenazine, tetrahidrofulvene (TFF), tetraciano-quiodimetan. Dintre acetia, ferocenii i derivaii lor au fost cel mai des folosii. Ferocenilor li s-a acordat o atenie deosebit datorit proprietilor lor legate de hidrofobicitate, proprieti electrochimice, posibilitii de a fi modificai structural inducndu-se astfel o modificare a potenialului lor redox. Hidrofobicitatea este un factor important deoarece previne desprinderea mediatorului de suprafaa electrodului cnd acesta este utilizat n sisteme apoase.

Electrozii enzimatici amperometrici pentru glucoz, acid lactic i acid glutamic au fost construii utiliznd glucozo-oxidaza (GOX), lactatoxidaza i glutam-oxidaza imobilizai pe un electrod crbune sticlos modificat cu polianilinometilferocen. n aceti biosenzori enzimatici H2O2 format n reacia enzimatic a glucozei, acidului lactic i acidului glutamic cu O2 n reacia enzimei corespunztoare a fost detectat la 50mV (v.s. Ag/AgCl). Datorit deteciei la potential mic aplicat, compui electroactivi ca acidul ascorbic, acidul uric nu interfer n analiz. Un ferocen substituit mediaz transportul de electroni dintre glucozoxidazaimobilizat Si un electrod de grafit. Acest sistem este independent de oxygen; ionii de fericiniu nlocuiesc O2, drept cofactor al GOX. Odat redui, aceti ioni pot fi generai la suprafaa electrodului. Biosenzorii care au la baz enzyme din clasa oxido-reductazelor utilizeaz O2 ca acceptor de electroni, avnd rolul de a reduce enzima n starea redox iniial. n tabelul 1.1. sunt redate o serie de enzyme electroactive din clasa oxido-reductazelor. Tab. 1.1. Oxidoreductaze electrocatalitic active Enzime Metilamina-Dehidrogenaza Succinate-Dehidrogenaza Substratul reaciei de electrod Metilamina Succinat Fumarat D-fructoza Etanol D-gluconat Celobioza Proces de electrod Oxidare Oxidare Reducere Oxidare Oxidare Oxidare Oxidare

D-fructoza-Dehidrogenaza Alcool-Dehidrogenaza D-gluconat-Dehidrogenaza Celobioza-Dehidrogenaza

O problem care se ridic n cazul utilizrii oxidoreductazelor este aceea c O2 este un factor limitative n condiiile operrii biosenzorilor la concentraii mari de substrt. De asemenea, H2O2 rezultat n urma reaciei enzimatice conduce la inactivarea multor enzyme. Dehidrogenazele sunt folosite mai rar n construcia unor astfel de electrozi comparativ cu oxidorectazele, deoarece cofactorul enzymatic NAD+/NADH este mult mai dificil de a fi redus n mod reproductibil la suprafaa electrozilor. n majoritatea cazurilor de construire a unor senzori bazai pe dehidrogenaze este aplicat reacia de oxidare. La nivelul electrozilor metalici aceast reacie apare le o valoare de suprapotenial de 1 V i decurge printr-un mecanism radicalic, fapt care ridic o serie de probleme legate de acoperirea suprafeei electrodului i interferenele posibile datorit unor specii n solu posibile datorit unor specii n soluia de analizat. Toate acestea fac ca metoda de regenerare a NAD+ s nu fie cea mai adecvat n cazul electrozilor enzimatici ampermetrici. Un numr de cercettori au cutat s gseasc suprafee de electrod catalitice la care reacia s apara rapid la valori mici de potenial. Aceste studii au avut la baz electrozi chimic

modificai (CMEs). n cazul CMEs, un mediator redox este modificat pentru o metod oarecare la suprafaa electrodului iar transferul de electroni dintre speciile de determinat din soluie, NADH i electrod are loc prin intermediul acestuia. n general un mediator trebuie s combine o cinetic omogen a reactivilor cu molecula de interes cu o cinetic de electrod rapi. Cercetrile iniiale au fost axate pe studiul ortochinonelor ca mediatori pentru oxidarea NADH-ului, dar electrozii obinui nu ar fi putut fi folosii cu success n construcia biosenzorilor datorit stabilitii lor reduse.

1.5. Electrozi chimic modificai bazai pe enzime

Unul din factorii care limiteaz aplicaiile practice n chimia analitic a senzorillor chimici este selectivitatea. Folosirea enzimelor imobilizate, pe lng mediatorul redox (M) , la construcia electrozilor rezolv problema selectivitii. Aprnd astfel i o nou clas de detectori numii electrozi chimic modificai bazai pe enzime imobilizate (IECMEs). Studile privind IECMEs au luat amploare mai ales n ultimii ani, IECMEs fiind instrumente analitice care combin selectivitatea, specificitatea i capacitatea catalitic a enzimelor pentru substratul lor natural cu avantajele deteciei electrochimice. n ultima decad electrozii chimic modificai i-au gsit largi aplicaii n construcia biosenzorilor, care sunt electrozi chimic modificai bazai pe enzime,ce combin specificitatea, selectivitatea Si capacitatea catalitic a enzimelor fa de substratul lor natural cu avantajele deteciei electrochimice. Biosenzorii bazai pe enzime pot fi folosii n mod selective n cadrul analizei unor compui diveri. Un factor care limiteaz atingerea ntregului potenial de proiectare i realizare a acestor senzori este legat de proprietile enzimei ca atare. n ultimii ani o atenie deosebit s-a acordat unei noi clase de enzyme, quinoproteinel, care prezint diferite activiti enzimatice asupra unor substane de importan biologic. Se presupune c prin utilizarea acestor quinoproteine n construcia biosenzorilro se poate realiza un transfer direct ntre centrul activ al enzimei i electrod eliminndu-se utilizarea mediatorilor redox. Schimbul de electroni direct ( fr mediatori) ntre o grupare redox a proteinei suprafaa electrodului a fost studiat pentru un numr de proteine ca: citocromul, plastocianina, azurine, glucoz-oxidaza. n ultimii ani au fost realizai biosenzori amperometrici i poteniometrici, care pe lng mediatorul redox include Si biomolecule, rezultnd o nou clasa de detectori numii electrozi chimic modificai bazai pe enzime imobilizate. n literature de specialitate exist o serie de revievuri [30-39] prezentnd principiul de construcie funcionare, precum i principalele caracteristici i aplicaiile electrozilor chimic modificai bazai pe enzyme imobilizate. Sunt doua ci de cuplare a procesului de electrod cu reacia enzimatic. Prima aproximare este bazat pe utilizarea mediatorilor de mrime molecular mic. n acest caz

reacia de transfer de electroni are loc fr mediatori. Regenerarea mediatorului are loc pe suprafaa electrodului. Tehnicile de imobilizare constau n metode fizice i chimice de imobilizare ct i n combinaii ale acestora. Principalele metode fizice sunt adsorbia pe matrici insolubile i entraparea n geluri insolubile. Imobilizarea chimic este efectuat prin legarea covalent pe suporturi derivatizate sau legarea ncruciat intermolecular a biomoleculelor. Procedeele de imobilizare a enzimelor sunt prezentate sistematizat n tabelul 1.2. Tab. 1.2. Procedee de imobilizare a enzimelor. Metoda 1. adsorbia pe matrici insolubile 2. Entraparea n gel Avantaje Simpl, condiii de lucru blnde, fr distrugere a enzimei. Procedur aplicabil oricrei enzyme, condiii blnde. Dezavantaje Legturile enzimei cu suportul sunt puternic dependente de pH, solvent i temperatur. Bariere difuzionale latgi, pierderea activitii , posibila denaturare a moleculei enzimei ca rezultat al apariiei unor radicali liberi. Complexul enzima-suport este Tehnica complicat, timp de stabil, metoda este ideal lucru mare, posibilitatea pierderii pentru producia n mas i activitii datorit reacilor n comercializare. care sunt implicate gruprile eseniale pentru activitatea biologic. Procedura simpl, legturi Dificulti n controlul reaciei, chimice puternice a necesit o cantitate mare de biomoleculelor cu support; larg enzim, activitate enzimatica folosit n stabilizarea fizic a relativ mic dup imobilizare. enzimelor adsorbite pe un support. Procedura relativ simpl, se Mecanismul proceselor cinetice poate controla grosimea este nc neelucidat. filmului de polimer i implicit cantitatea de enzim depus n imediata apropiere a suprafeei electrodului. Se poate folosi uor la realizarea microelectrozilor.

3. Legarea covalent de o membran , de un support insolubil ( celuloza, dextran, collagen, gelatin, albumina, rini schimbtoare de ioni, policlorura de vinil, sticla poroas). 4. Legarea ncruciat de un agent multifuncional (cum ar fi derivai ai bis-izocianat sau bis-diazobenzidin glutaraldehidei). 5. electropolimerizarea

1.5.1. Bioelectrocataliza

Bioelectrocataliza se preocup cu utilizarea materialelor biologice drept catalizatori pentru procesele electrochimice de oxidare i reducere[40]. Bioelectrocataliza se refer la transferul direct de electroni fr mediatori. n 1978 a fost demonstrat c enzime ca lacaza au capacitatea de a cataliza electroreducerea.O2. a fost artat c O2 este redus la electrod n prezena lactazei print-un mecanism direct (fr mediatori) [41]. O2 + 4H+ + e2H2O

Tot n acelai an s-a descoperit c citocrom b2 (FMN) i hemul su coninnd lactat dehidrogenaza catalizeaz electro-oxidarea lactatului. Lactat
citocrom

piruvat + 2H+ + 2e-

Electro-oxidarea lactatului a fost studiat pe un electrod de crbune modificat cu o sare organic conductiv. Mecanismul de reacie al oxidrii lactatului implic transferul direct de elecroni ntre enzim i electrod. Mecanismului de transfer de electroni pentru sistemul enzime-catalizatori nu a fost elucidat. Ipoteza sugernd transferul de electroni mediat de gruprile active de le suprafaa electrodului a fost propus de unii autori. S-a descries electroreducerea H2O2 cu peroxidaza inclus n matrice polypyrrol pe suprafaa electrodului. Enzima accelereaz electroreducerea H2O2, fiind mediat de gruprile active de la suprafaa electrodului. Proprietile electrocatalitice ale enzimelor redox au fost observate pe o varietate de electrozi incluznd : crbune sticlos, electrod past de crbune, electrozi chimic modificai cu polimer organic[42-44]. Studii ale transferului redox ale gruprilor prostetice ale enzimei indic urmtoarele: posibilitatea sau imposibilitatea de a obine transferul electrochimic a gruprii prostetice ale enzimei, nu indic prezena proprietilor electrocatalitice ale enzimei; gruparea prostetica a enzimei nu poate fi considerat ca un mediator redox intramolecular. Cercetri ale cineticii formale ale enzimelor-catalizatori ale reaciilor de electrod sunt valabile pentru lacaz, hidrogenaz i peroxidaze. Modelele cinetice ale peroxidazei ( catalizator al reducerii H2O2 ) au fost studiate amnunit i comparate cu datele experimentaledin care reiese c 42% din cantitatea total de enzyme adsorbite pe suprafaa electrodului sunt accesibile pentru transferul direct de elctroni. Aceste studii sunt eseniale pentru nelegerera proceselor de electrocataliz. n general, mecanismele catalizei enzimatice a reaciilor de electrod nu au fost nc cercetate n detaliu. nc nu este clar ce parametric determina posibilitatea enzimelor redox de a cataliza reaciile de electrod. Exist o serie de nelmuriri n ceea ce privete: rolul gruprilor prostetice ale enzimei n electrocataliz; rolul moleculelor de protein n procesul de transfer de elctroni;

influena orientrii moleculelor de enzime pe suprafaa electrodului n procesul de bioelectrocataliz;

 influena naturii materialului din care este realizat electrodul i structura suprafeei electrodului n bioelectrocataliz; relaiile dintre mecanismul catalitic de aciune a enzimei i manifestarea capacitii electrocatalitice.

2. APLICAIILE ELECTROZILOR CHIMIC MODIFICAI

Folosirea electrozilor chimic modificai n chimia analitic se bucur de un success considerabil. Prin modificarea chimic a suprafeei electrozilor a fost posibil obinerea unei mari varieti de electrozi chimic modificai prin intermediul crora pot fi determinai un numr mare de compui chimici. Datorit selectivitii i sensibilitii mrite, electrozii chimic modificai sunt ideali pentru electroanalize. Electrozii chimic modificai i-au gsit largi aplicaii i anume n: electrocataliz, preconcentrare, permeabilitate selectiv i recunoatere specific. Datorit proprietilor lor deosebite electrozii chimic modificai i vor gsi n continuare largi aplicaii n domeniul chimiei analitice. n tabelul 2.1 sunt prezente diferite aplicaii ale electrozilor chimic modificai n cadrul analizei chimice i biochimice. Metalo-ftalocianinele reprezint o clas de compui care a fost foarte bine studiat datorit activitii sale catalitice. Cobalt-ftalocianinele au o eficien dosebit n reaciile n care sunt implicai compuii : N2H4 , acidul oxalic, alpfa-cetoacizi, compui tiolici, cisteina, homocisteina, glutation, tiopurine [45-49].

Tab. 2.1. Aplicatiile electrozilor chimic modificati Nr. CME Compuii analizai 1. CobaltHidrazina (N2H4) ftalocianina n pasta de crbune Caracteristici ale electrozilor chimic modificai Oxidarea catalitic a N2H4 pe acest electrod chimic modificat a fost folosit n FIA. Detecia a fost realizat la o,1V v.s. Ag/AgCl n soluie de NaOH 0,2 M, valoare care este cu mai mult de 100 mV mai mic comparativ cu cea necesar deteciei electrochimice la nivelul unui electrod de crbune nemodificat. Rspunsul liniar a fost observat pentru concentraii de 10-8 10-3 M ale N2H4 , detecia limit fiind mai mic de 1 pmol. CobaltCisteina, Electrodul chimic modificat catalizeaz ftalocianina n Homocisteina, N- electrooxidarea tiolilor la +0,75 +0,85 V v.s. pasta de crbune acetilcisteina, Ag/AgCl ntr-un mediu de H2SO4 0,5 M sau PO4-3 Glutation 0,5 M. Folosit n combinare cu cromatografia de lichide , electrodul chimic modificat manifest un rspuns liniar pentru cistein ntre 2,7 270 pmoli. Electrodul a fost sufficient de stabil pentru folosirea continu timp de o zi iar suprafaa sa a putut fi regenerat cu o deviaie standard relativ de o,7%. Metodele LCEC avand la baz electrozii chimic modificai au fost utilizate pentru determinarea cisteinei i glutationului n snge i plasma. CobaltTiopurine Procedeul a fost realizat pentru determinarea 6ftalocianina n mercaptotiopurinei, 6-tioguaninei i a altor pasta de crbune tiopurine din snge i plasm. Detecia limit a fost de 1,58 pmoli, aproximativ cu un ordin de mrime mai mare dect detecia prin absorbie n U.V. sau prin fluorescen. CobaltAc. Oxalic, -ceto- Electrodul chimic modificat catalizeaz oxidarea ftalocianina n acizi, ac. Piruvic, acidului oxalic i a cetoacizilor la o valoare pasta de crbune ac. Fenil piruvic, cuprins ntre + 0,75 + 0,90 V v.s. Ag/AgCl ntrac. -ceto glutaric un mediu de PO4-3 0,5 M, pH =2 care reprezint o valoare cu 500 mV mai mic comparativ cu potenialul aplicat unui electrod nemodificat. La 0,75 V rspunsul pentru acid oxalic a fost liniar ntre 10-72*10-5 M, iar detecia limit este de o,3 pmoli. Pentru cetoacizi detecia limit variaz ntre 0,15 1,00 nmoli.

2.

3.

4.

5.

Electrod de Insulina crbune sticlos acoperit cu un film de ruteniu i cianur

6.

7.

8.

Electrodul chimic modificat catalizeaz electrooxidarea insulinei print-un mecanism presupus ce implic oxidarea uneia sau mai multor legturi SS. cataliza se realizeaz la un potenial mai pozitiv + 0,9 V v.s. Ag/AgCl permind o detecie FIA la o concentraie de 10-7 M. Mn(III) mAcid ascorbic, Electrozii de crbune sticlos coninnd compleci tetrafenil hidralazin, porfirinici pe baz de Mn conduc la oxidarea porfirin depus epinefrina diferiilor compui biologici. Deoarece efectul pe un electrod apare la diferite poteniale pentru aceti compui, de crbune cataliza implic probabil interacii specifice ntre sticlos compusul de analizat i mediator i nu un process de sarcin mediat. n FIA efectul primar al electrodului chimic modificat const n micorarea potenialuluinecesar oxidri cu 50360 mV comparativ cu electrodul nemodificat. Electrod de Cistein, glutation Electrodul chimic modificat catalizeaz oxidarea crbune acoperit cisteinei i glutationului la un potenial cuprins cu un film ntre + 0,9 +1,0 V v.s. Ag/AgCl. n FIA detecia compus din limit a acestor compu a fost stabilit sub un cianur i oxid nivel microM, iar rspunsul a fost liniar pentru trei de ruteniu ordine de mrime. Stabilitatea n timp a electrodului chimic modificat a fost foarte bun; nu s-au osservat scimbri pentru mai mult de 200 de injectri, timp de dou sptmni. Electrod de Compui tioici, Electrodul chimic modificat este folosit ca sensor crbune sticlos cistein, glutation amperometric n cromatografia de lichide. Acest acoperit cu Coelectrod realizat prin electropolimerizare anodic a ftalocianin C0-4,4, 4,4 tetra-amino-ftalocianina ofer compatibilitatea fa de solvenii organici i , de asemenea , stabilitate. Cu ajutorul acestui electrod s-au putut determina diveri compui tiolici n cantiti de pmoli. Pspunsul electrodului este foarte stabil n timp, dup 40 de ore de funcionare continu pstrndu-i aproximativ 80% din activitatea iniial.

n ultima decad electrozii chimic modificai i-au gsit largi aplicaii n construcia biosenzorilor, care sunt electrozi chimic modificai bazai pe enzyme, ce combin specificitatea, selectivitatea i capacitatea catalitic a enzimelor fa de substratul lor natural cu avantajele deteciei electrochimice. Biosenzorii bazai pe enzime pot fi folosii n mod selective n cadrul analizei unor compui diveri, un factor care limiteaz atingerea ntregului potenial de proiectare i realizare a acestor senzori este legat de proprietile enzimei ca atare. n ultimii ani o atenie deosebit s-a acordat unei noi clase de enzime, quinoproteinele, care prezint diferite activiti enzimatice asupra unor substane de importan biologic.

Se presupune c prin utilizarea acestor quinoproteine n construcia biosenzorilor se poate realiza un transfer direct ntre centrul activ al enzimei i electrod eliminndu-se utilizarea mediatorilor redox. n ultimii ani, interesul chimitilor i biochimitilor analiti s-a axat pe realizarea i caracterizarea IECMEs care ofer o alternativ amperometric de studiu i determinare a multor compui chimici de importan biochimic:proteine redox, enzyme, diferite substrate, utiliznd mediatori fie liberi n soluie, fie fixai pe suprafaa electrozilor. Datorit proprietilor acestora studiile bioelectrochimice au fost canalizate n cteva direcii [20-24, 50]. Una dintre acestea a fost legat de folosirea CMEs n studiile bioelectrochimice n scopul unei mai bune nelegeri a reaciei cu transfer de electroni n cadrul sistemelor biologice. Prin folosirea CMEs a fost posibil studiul compuilor biochimici care prezint un transfer heterogen de electroni ce se desfoar cu o vitez mic la nivelul electrozilor convenionali, presupune n consecin, o comportare electrochimic ireversibil. S-a demonstrat c electrozii chimic modificai reprezint o alternativ real pentru transferul omogen de electroni cu ajutorul mediatorilor n soluie , ei putnd fi utilizai pentru determinarea cantitativ a proteinelor i enzimelor. Cercetarea caracteristicilor de oxido-reducere a sistemelor biologice este important n nelegerea principalelor procese biologice. Tehnicile electrochimiei convenionale ca de exemplu: titrarea poteniometric i titrarea coulometric, voltametria ciclic i polarografia au fost utilizate n studiul biocomponentelor electroactive. Cteodat, multe specii biologice urmeaz un mecanism heterogen de electroni cu viteza mic n consecin perzint un comportament electrochimic ireversibil. Studii intense au fost realizate pentru a obine o reacie de electrod reversibil sau cvasireversibil. De exemplu, electroliza reversibil sau cvasireversibil a citocromului a fost realizat utiliznd oxidul de indiu. Utilizarea oxidului de ruteniu a fost cercetat pentru a uura reaciile de electrod ale ctorva proteine : citocrom c, azurin, rubredoxin, feredoxin i plastocianin. O alternativ accesibil care a fost aplicat cu succes la obinerea informaiilor electrochimice provind enzimele i proteinele a fost folosirea mediatorilor. Aceste specii care au o comportare reversibil ideal sunt adugate la soluia de protein sunt utilizai ca intermediary ai transferului de electroni n oxidarea sau reducerea macromoleculei. [52-55]. Alte studii legate de acest domeniu au demonstrat posibilitatea unui transfer direct de electroni ntre gruparea redox a unei proteine i suprafaa electrodului . aceste studii dezvolt o baz electrochimic pentru cercetarea structurii proteinelor, mecanismul transformrilor redox al proteinelor i proceselor metabolice implicnd transformarea redox [55-60]. Studiile existente pn la ora actual au indicat faptul c viteza schimbului de electroni ntre centrul activ al enzimei i electrod este determinat de natura enzimei materialul de electrod. Astfel, gsirea unor noi materiale de electrod care ar putea conduce la un transport eficace de electroni este de interes theoretic i practice. Un alt domeniu de interes pentru studiile electroanalitice bazate pe CME l reprezint construcia i caracterizarea electrozilor modificai bazai pe enzyme imobilizate (IECMEs) care combin specificitatea, selectivitatea i capacitatea catalitic a enzimei fa de

substratul ei natural cu avantajele oferite de detecia electrochimic. Cercetrile n domeniul tehnologiei biosenzorilor se dezvolt foarte rapid; descoperirile recente n studiul moleculelor i proceselor biochimice au un impact deosebit n diferite domenii ale electrochimiei, dintre care unul din cele mai importante l reprezint electroanaliza. n tabelul 2.2 sunt prezente o parte din aplicaiile CMEs n domeniul compuilor chimici de importan biochimic. Realizarea i caracterizarea IECMEs se afl nc la nceput este de ateptat ca datorit proprietilor menionate, acetia s devin n perspectiva instrumente analitice foarte utile n determinrile de interes chimic i biochimic [61-66].

Tab. 2.2. Aplicaiile CMEs bazai pe enzime Compus de analizat L-lactat CMEs Electrod pasta de crbune modificat cu lactatoxidaz i peroxidaz din hrean. Caracteristici ale elctrodului chimic modificat Lactatoxidaza i peroxidaza pot fi imobilizate prin adsorbie pe particulele de grafit. Permite detecia L-lactatului la poteniale joase, cuprinse ntre 50 i 50 mV (v.s. Ag/AgCl). Operand la un potenial de 50 mV i 50 mV (v.s. Ag/AgCl), aceti electrozi sunt capabili s msoare analiii dorii cu o selectivitate ridicat i o bun precizie.

Glucoza Acid lactic Acid glutamic

Glucoz-oxidaza Lactato-oxidaza Glutam-oxidaza Imobilizate pe un electrod crbune sticlos modificat cu peroxidaza-polianilinometil ferocen. Electrod past de crbune modificat cu quinoproteinglucoza-dehidrogenaza

Fenolii

Fenolii

Electrod past de crbune modificat cu Co-ftalocianin cu polifenol-oxidaza imobilizat pe suprafaa electrodului fr mediator.

Enzima este inclus n pasta de crbune. Rspunsul electrodului este bazat pe regenerarea enzimatic. Electrodul este poteniostatat la 500 mV (v.s. Ag/AgCl /0,1 mol/L KCl). Senzitivitatea cea mai mare este obinut pentru p-aminofenol care poate fi determinat la nivelul subnanomolar Acest electrod permite detecia fenolilor pe ntregul domeniu de potenial (-0,2 la +0,5 V ) cu oxidarea ncepnd la 0,2 V i reducerea la poteniale mai sczute.

Fructoza

Electrod crbune sticlos modificat cu un complex format din particule de Au colloidal i D-fructozodehidrogenaza.

Hemoglobina

Lactat

Rspunsul curentului anodic la D-fructoz a fost msurat prin utilizarea unui electrod crbune sticlos modificat cu complex la +0,5 V (v.s. Ag/AgCl). Timp de rspuns: 15s. n absena enzimei nu se obine nici un rspuns al curentului; deci creterea curentului de oxidare a fost confirmat a fi cauzat de transferul de electroni de la enzim la electrod. Electrod chimic modificat cu Electrodul chimic modificat riboflavin este construit prin adsorbia riboflavinei pe suprafaa de grafit. Suprafaa acoperit este de 9,6 x 10-10 mol/cm2. acest electrod chimic modificat permite electroreducerea hemoglobinei care are loc la poteniale joase corespunztoare potenialului de reducere a mediatorilor. Electrod modificat cu flavin- Rspunsul bioelectrodului s-a reductaza i riboflavina bazat pe oxidarea la 0,1V v.s. SCE a dihidroriboflavinei generate enzymatic. Cu imobilizarea flavin-reductazei ia lactat-dehidrogenazei conduce la un bioelectrod bazat pe dehidrogenaza pentru determinarea lactatului n prezena riboflavinei i NAD+.

3. IMPORTANA DETERMINARII DOPAMINEI

Dopamina face parte din grupa unor importante substane numite catecolamine sau hormoni medulosuprarenalieni. Este un intermediar important n biosinteza adrenalinei i a noradrenalinei, principalele secreii ale acestor hormoni. Principalul effect fiziologic al catecolaminelor este cel asupra sistemului circulator. n acelai timp sunt efectori ai strii nervoase i au rol important n transmiterea fluxului nervos simpatic. Rolul biochimic al catecolaminelor const n implicaiile lor n circuitul hidromineral. Reglarea secreiilor hormonale se face cu ajutorul influxurilor nervoase transmise cu ajutorul neurotran-smitorilor. Secreia de hormoni medulosuprarenali este provocat de excitarea cilor nervoase transmise cu ajutorul dopaminei, noradrenalinei i serotoninei. Totodat, s-a demonstrat faptul c dopamine este un factor de inhibiie al prolactinei, care este hormonal lactogen sau lactotrop ce acioneaz asupra secreiei glandei mamare prin mrirea att a cantitii de esut glandular, ct i a produciei de lapte. Cu ajutorul tehnicii de histofluorescen s-a putut alctui o hart a conexiunilor dopaminei. Dopamine este unul dintre cei mai interesani neurotransmitori pentru c este implicat n cteva funcii interesante cum este mobilitatea , atenia i capacitatea de nvare. Degenerarea neuronilor dopaminergici ce conecteaz substan cenuie n circuitul nervos cu nucleul cutat provoac boala lui Parkinson, caracterizat prin tremurul i rigiditatea extremitilor, lipsa de echilibru i dificultate n iniierea micrilor. Dopamine este implicat ca i substan neurotransmitoare n schizofrenie, o dereglare mental serioas, caracterizata prin halucinaii, deziluzii i ntreruperea procesului normal logic, de gndire. Prin descompunerea dopaminei se obine melanina, care este pigmentul pielii. Scderea cantitii de dopamin poate avea loc prin inhibiia unor enzyme ca tirozinhidroxilaza, DOPA-decarboxilaza prin dereglarea acumulrii de dopamin i acid homovanilic, metabolitul principal al dopaminei n organismul uman. Obinerea efectului scontat n tratamentele ce folosesc medicamente ce provoac stri antidepresive se bazeaz pe buna funcionare a sistemului dopaminergic. Funciile terminaiilor nervoase ale sistemului dopaminergic pot fi studiate n figura 3.1., n care: Totodat , datorit implicrii n sistemul circulator, dopamine se folosete n tratarea afeciunulor cardiace i n cazurile de edem pulmonar. Avnd n vedere importana sa clinic i biochimic, n literature de specialitate sunt prezentate o serie de procedee de determinare a acesteia.

3.1. Metode de determinare

Una din metodele de determinare a dopaminei a fost cea folosind tehnica perfuziei push-pull care const din dou tuburi concentrice prin care lichidul fiziologic este n acelai timp infuzat ( push) i scos (pull) [67]. Sensibilitatea ridicat a tehnicii cromatografiei de lichide cu deteci electrochimic, face ca aceast tehnic cuplat cu tehnica push-pull s devin ideal pentru aceste analize. Astfel, compusul de analizat din sistemul nervos este scos i analizat prin orice metod folosit pentru cantiti mici de prob. Tot datorit prezenei n cantiti mici a dopaminei n sistemul nervos s-au folosit markeri radioactivi. Aceast metod seamn cu cea amintit nainte, doar c lichidul de perfuzie trece prin membrana de dializ. Moleculele mici prezente n mediul extern pot difuza prin membran i ndeprtate din sistemul nervos. Experimentele in vivo necesit folosirea unor aparate foarte sensibile i n acelai timp de dimensiuni mici. Electrozii voltametrici ndeplinesc aceste condiii i cu timpul au devenit din ce n ce mai specializai [68-71]. Pentru a ndeplini cerinele de mrime, cercettorii au adoptat tehnica folosirii unui electrod cu fibr de carbon. Fibra de carbon se nchide ntr-o capilar de sticl i I se las un vrf ascuit la exterior. Aria sensibil a acestui vrf are o raz minim de 5 m i maxima de 35 m. Pentru a se crete selectivitate pentru catecolamine, se fixeaz pe suprafaa elctrodului o membran perfluorinat schimbtoare de ioni ( Nafion). Folosirea membranelor schimbtoare de ioni este o tehnic des adoptat de cercettori, simplicitatea metodei fiind un avantaj valoros. Polimerii folosii ca membrane sunt diferii, avnd fiecare avantajele i dezavantajele lor, dar toi i pastreaz caracteristica de baz, adic las s treac dopamine care este protonat la pH fiziologic, celelalte substane fiind excluse. Pentru a se putea crete timpul de rezoluie al acestei tehnici, s-au dezvoltat cteva tehnici electrohimice rapide. O astfel de tehnic este cronoamperometria, tehnic n care se aplic un potenial asupra unui electrod, sufficient pentru electroliza speciei care ne intereseaz [72-76]. Voltameria ciclic i mbuntirile aduse acestei metode sunt o tehnic folosit n mod current pentru determinarea dopaminei. Se fac comparaii ntre metodele de amperometrie la potenial constant i voltametria ciclic de scanare rapid ca tehnici de monitorizare in vivo . Datorit potenialului constant, prima metod este piin afectat de schimbarea de current. Acest avantaj situeaz metoda, a doua dup cromatografoa de lichide, ca metod uzual.

Determinrile de dopamin se realizeaz i enzymatic prin intermediul unor preparate enzimatice obinute prin extracia enzimelor din diferite esuturi ale plantelor. Folosind un sistem de injecie n flux se poate determina dopamine cu soluia de enzim folosit ca purttor. Pentru acest sistem s-a determinat c soluia de enzim obinut din frunze de spanac este mai adecvat dect cea obinut din pulp de banan [76-80]. Acest sistem de injecie n flux poate fi combinat cu folosirea de microelectrozi ca i detectori amperometrici. Ca mediator redox se folosete tetratiofulvalena tetracianochinodimetanul ( TTF-TC) care se amestec cu clorur de polivinil ( PVC) n raport de 13: 1 i se suspend ntr-o soluie de tetrahidrofuran (THF). Concluziile acestor determinri sunt acelea c, datorit unei cinetici de o rapiditate rezonabil, dopamin prezint o sensibilitate mai mare dect acidul ascorbic i hidrochinon, la diferene relativ mici n fraciunile ariei active a suprafeei investigate, astfel nct sensibilitatea de detecie a dopaminei este mai mare. In vivo , determinrile sunt mult mai dificile dect in vitro . De aceea determinrile de acest tip trebuie s fie mult perfecionate. Voltametria cu electrozi sufficient de mici pentru a putea fi introdui ntr-o celul, asigur un mijloc de monitorizare cantitativ a substanelor uor oxidabile, atunci cnd concentraia lor se schimb n citoplasma celulei. Aceast metod se bazeaz pe o diferen de potenial ntre electrodul voltametric i electrodul de referin, ce duce la reacia de oxidare, result intensitate msurabil n picoamperi. Electroforeza capilar este o metod de nalt eficien, ce folosete volume foarte mici ( picolitri), pentru separarea moleculelor ionice, metoda ce se bazeaz pe mobilitatea electroforetic [81-83]. Cu ajutorul electroforezei capilare s-a determinat pentru prima dat cantitatea relativ de neurotransmitor liber, respective vascularizat, din corpul cellular al unei cellule nervoase singulare din Planorbis corneus. Sensibilitatea i selectivitatea unei tehnici depinde de cele mai multe ori de natura electrozilor. S-a demonstrat c , electrozii modificai chimic prezin o mai mare stabilitate i selectivitate n determinrile bioanalitice. Un exemplu de astfel de electrod chimic modificat, este electrodul din pasta de crbune modificat cu stearat ( SMes). Modificrile de baz aduse de acest nou tip de electrod sunt acelea ca prezint pe SMEs aresturilor carboxilice neprotonate la pH fiziologic ntrzie electrooxidarea speciilor anionice, c ascorbatul i DOPAC, astfel nct speciile cationice de dopamin pot fi determinate n prezena lor [84,85]. Cu toate avantajele metodei amperometrice , cercettorii au gsit o alt metod mai eficient combinnd detecia electrochimic cu tehnica cromatografiei de lichide. S-a descries o metod de microcromatografie de lichide cu detecie electrochimic folosind un nou tip de electrod. Acest tip de electrod se obine , n principiu, prin comprimarea i nclzirea a dou buci de polimer umplute cu crbune pe un fir metallic introdus n dou capilare din silice care se alipesc. Obiectul obinut seamn mai mult sau mai puin cu un cip folosit n electronic i de aceea a fost denumit electrodul Chip. Firul se

scoate cnd cipul este cald. Cele dou capilare silicioase conduc fluxul lichidului cromatografic de-a lungul electrodului, parte a cipului. Volumul celulei de analiz este determinat de dimensiunile firului i a capilarelor silicioase folosite [86]. Aceast metod s-a folosit pentru determinarea catecolaminelor din urin i dintr-un amestec preparat. O metod foarte recent i spectaculoas n acelai timp, presupune folosirea unor lentile termice pentru determinarea spectrometric (TLS) a catecolaminelor dup oxidarea acestora la aminocromi. n aceast derminarea se folosete o tehnic laser foarte sensibil [87]. Substanele cu un spectru larg de absorbie molar la o lungime de und a pompei de radiaie pot fi determinate prin TLS; substanele cu o absorban mic pot fi determinate, deasemenea, prin aceast metod, chiar la o concentraie foarte mic. TLS permite determinarea dopaminei la nivelul de concentraie gsit n probele fiziologice cu o sensibilitate i reproductibilitate satisfctoare. La concentraii foarte mici, oxidarea d soluii stabile de aminocromi. Stabilitatea ridicat permite ca oxidarea s poat avea loc la valori mari de pH, avnd loc cu o vitez foarte mare. Sensibilitatea asemntoare obinut pentru toate catecolaminele constituie un avantaj dac se compar cu majoritatea metodelor fluorimetrice [89]. Caracteristicile analitice indic faptul c detecia TLS poate constitui o alternativ valoroas n determinarea catecolaminelro folosind HPLC ( high performance liquid chromatography). Determinarea dopaminei din urina uman prin HPLC const din trei etape: prepurificarea catecolaminelor, separarea catecolaminelor prin cromatografia perechilor de ioni sau prin schimb de ioni i detecia prin metoda electrochimic sau fluorimetric. Aceste procese pot fi automatizate i rezultatele obinute asigur utilizarea cu rezultate bune a acestei metode pentru determinrile directe ale catecolaminelor din urin[90-91]. Construcia, caracterizarea i aplicaiile electrozilor modificai chimic posednd suprafee funcionalizate specifice, reprezint un nou domeniu de cercetare electrochimic, care n principiu poate deschide o serie de posibilitnd suprafee funcionalizate specifice, reprezint un nou domeniu de cercetare electrochimic, care n principiu poate deschide o serie de posibiliti analitice unice n domeniul electrochimiei [91-96]. Recent, pretatarea electrochimic a electrozilor de grafit realizat prin ciclizarea potenialului ntre valori anodice i catodice extreme a permis daterminarea selectiv in vivo a doapminei i acidului ascorbic. Pn n present, n literature de specialitate sunt prezentate numeroase exemple de ECM [91-96]. n majoritatea cazurilor, n literature de specialitate sunt prezentate numeroase exemple de ECM [91-96]. n majoritatea cazurilor electrozii chimic modificai au fost proiectai pentru a mima la nivel heterogen sistemele redox observate n soluprezentate numeroase exemple de ECM [91-96]. n majoritatea cazurilor electrozii chimic modificai au fost proiectai pentru a mima la nivel heterogen sistemele redox observate n soluii ( medii omogene). n mod obinuit, gruparea modificatoare selectat i legat pe suprafaa electroduuli este o molecul electrolizabil reversibil, capabil s medieze un process de oxidare sau

reducere care n condiii normale are loc la valori mari de potenial datorit vitezei mici de transfer a electronilor ntre compuii de analizat i electrodul nemodificat. n aceast lucrare se examineaz posibilitatea utilizrii analitice a electrozilor chimic modificai electrocatalitici, avnd la baz TMPD ( N,N,N,N- tetrametil fenilendiamin), pentru determinarea dopaminei. Electrozii utilizai au fost ECM pe baz de past de crbune, realizai prin includerea direct a TMPD n pasta de crbune. S-au studiat att proprietule catalitice ale acestor ECM fa de dopamin, ct i caracteristicile de rspuns.

3.2. Reactivi i soluii

N,N,N,N- tetrametil fenilendiamin ( TMPD) i dopamine s-au obinut de la firma Aldrich Co i au fost folosite ca atare, fr o purificare ulterioar n ap deionizat. Toate soluiile au fost proaspt preparate pentru fiecare experiment n parte i deoxigenate prin barbotare de azot. Experienele s-au realizat n soluii tampon fosfat-acid azotic de diferite pH-uri.

3.3. Aparatura
In cazul determinrilor s-a utilizat drept electrod inicator, electrodul pe baz de past de crbune modificat cu TMPD. Electrozii construii din materiale pe baz de past de crbune prezint curenti de baz mici, ceea ce asigur un raport semnal/zgomot mic i de aceea sunt des utilizai n cazul determinrilor electroanalitice. Electrodul pe baz de past de crbune s-a preparat prin amestecarea ntr-un mojar a 5 grame de pulbere de grafit ( de puritate spectral Fluka) cu 3 mL de ulei de Nujol ( obinut de la firma Mccarthy Scientific Co, Fullerton CA). Electrozii chimic modificai s-au obinut n mod similar cu diferenta c, iniial, mediatorul se amestec cu pulberea de grafit n cantitatea dorit, apoi se amestec cu eter rezultnd un amestec eteric; ulterior se las eterul s se evapore. Acest amestec, pulbere de grafit/mediator. Se introduce n ulei de Nujol, se mojareaz i se introduce ntr-un tub de sering de unic folosin. Contactul se realizeaz cu ajutorul unui fir de platin. s-au observat variaii mici ale curentului pentru diferite sarje de past de crbune modificat, coninnd aceeai cantitate de mediator. Din acest cauz este necesar realizarea unor noi curbe de calibrare ori de cte ori se utilizeaz o nou sarj de past. Curbele de calibrare redate corespund la media a trei voltamograme diferite realizate pentru trei suprafee de electrod, diferite pentru fiecare concentraie. Curenii obinui pentru dopamin au fost corectai prin scderea curentului de baz datorat oxidrii TMPD.

Varianta de obinere a electrozilor chimic modificai prin includerea mediatorului redox n pasta de crbune reprezint metoda cea mai simpl de fabricare a acestuia. Ea ofer posibilitatea obinerii unui electrod a crui suprafa modificat poate fi regenerat rapid i reproductibil. Se pot obine cantiti mari de past de crbune modificat ntr-un timp scurt ( cteva minute) prin simpla amestecare normal a unor propotii adecvate de pulbere de grafit, mediator i liant organic. Utilizarea acestor electrozi n practic este limitat de folosirea lor n mediu apos ( pentru meninerea intact a suprafeei electrodului) i de fabricarea unor mediatori care s prezinte o solubilitate redus n ap. Electrodul de referin utilizat a fost cel de Ag/AgCl , iar cel auxiliar a fost de Pt. n figura 3.2. se red montajul voltametric utilizat n cadrul determinrilor. Viteza de baleiere a potenialului a fost de 20 mV/s. Componenta principal a echipamentuuli, necesar pentru controlul potenialului electrodului indicator i pentru msurarea simultan a curentului, este reprezentat de analizorul voltametric (poteniostat). Caracteristica principal a analizoarelor voltametrice moderne const n controlul poteniostatic al potenialului electrodului inducator. Circuitul este astfel realizat nct este posibil controlul potenialului dintre electrodul indicator i electrodul de referin n timp ce curentul care circul ntre electrodul indicator i cel auxiliar este msurat. Un astfel de poteniostat este cuplat cu un nregistrator x-y , obinndu-se voltamogramele ciclice. Volumul celulei electrochimice este de 10 mL. Soluiile au fost deaerate prin barbotare de azot. Potenialul electrodului indicator s-a fixat la o valoare sufficient de pozitiv comparativ cu potenialul formal de oxido-reducere al mediatorului ( Ef =0,10 v ), astfel nct forma oxidat a acestuia s fie cea stabil la suprafaa electrodului. 3.4. Rezultate i discuii Voltamograma ciclic tipic obinut pentru oxidarea TMPD la nivelul electrozilor de past de crbune este redat n figura 3.3: Fig. 3.3. Voltamogramele ciclice obtinute la nivelul electrozilor de pasta de carbune pentru solutii ce contin: 2x10-4M TMPD, 1x 10-3 dopamina Din toate punctele de vedere, comportarea anodic obsevat este similar cu cea prezentat n cadrul studiilor electrochimice existente n literature de specialitate. La pH-uri acide TMPD prezint dou oxidri bine definite implicnd un electron. Prima prezint un pic de potenial la +0,10 V fa de Ag/AgCl, este reversibil i poate fi ciclizat un timp indefinit, ce-a de a doua aprnd la +0,40 V care devine ireversibil datorit unei reacii chimice ulterioare, probabil hidroliza produsului de reacie. S-a evideniat faptul c TMPD poate cataliza oxidarea dopaminei la nivelul primei unde i cea a NADH-ului la nivelul celei de a doua unde. n ambele cazuri a fost evidenevideniat faptul c TMPD poate cataliza oxidarea dopaminei la nivelul primei unde i cea a NADH-ului la nivelul celei de a doua unde. n ambele cazuri a fost evideiat prin creterea dramatic a curentului anodic observat la nivelul undelor de oxidare ale TMPD implicate n process i scderea corespunztoare a curentului catodic observat pentru aceste unde prin baleierea n sens invers a potenialului. n cadrul lucrrii s-a studiat sistemul

electrocatalitic n mediu omogen (soluie) la nivelul electrozilor de past de crbune nemodificai. Dopamine, ca atare a fost oxidat, prezentnd o serie de unde anodice avnd potennd potenialul de pic la 0,26 V fa de Ag/AgCl. Voltamograma ciclic tipic ( comportarea electrochimic ) observat pentru soluii coninnd compusul de analizat ( dopamine) i catalizatorul (TMPD) n concentraie de 1x10-4 M este redat in figura 3.3. Secventa de reacie urmeaz binecunoscutul mecanism P Q+A P+B Q + ne catalitic EC :

Unde: P = forma redus a TMPD; Q = forma oxidat; A = corespunde substratului ( dopamina). De notat este faptul c terminologia utilizat este invers fa de cea convenional, folosit de electrochimiti pentru a descrie un mecanism. Din punct de vedere al unui process de elctrod primar, termenul de catalizator ar trebui utilizat pentru a ne referi la speciile A. Totui, deoarece reacia de interes final este cea de-a doua, procesul redox chimic, TMPD este privit a cataliza oxidarea dopaminei.

Electrozi chimic modificai coninnd TMPD

n principiu este posibil s se realizeze aceleai procese catalitice la nivelul ECM coninnd TMPD. ECM utilizai n acest studiu au fost electrozii pe baz de past de crbune modificai chimic prin simpla adugare a cantitii dorite de TMPD n pulberea de grafit naintea realizrii pastei de crbune. cest tip de ECM a fost ales datorit simplitii construciei a posibilitii de variere a concentraiei de electrocatalizator i a uurinei de generare a suprafeelor noi de electrod, prezentnd o reproductibilitate cantitativ. Electrodul chimic modificat cu TMPD este stabil i reproductibil. Prin baleierea potenialului n sens anodic, pe baz de past de crbune ce conine TMPD ca mediator, se observ apariia unei unde de oxidare n domeniul de poteniale asemntor cu cel la care are loc oxidarea TMPD n soluie. ECM poate fi ciclizat repetitive nspre prima und de oxidare pe o perioad de 15-20 minute, fr s se observe o scdere notebil a intensitii curentului obinut. Totui, scanarea potenialului nspre cea de-a doua und a TMPD face electrodul inutilizabil. Electrodul poate fi inactivat fie prin meninerea acestuia n soluie timp de cteva ore, sau prin aplicarea continu a potenialului corespunztor picului anodic timp de cteva minute. n ambele cazuri inactivarea are loc datorit trecerii n soluie a mediatorului. Activitatea electrodului poate fi uor refcut prin refacera suprafeei prin poliare, ndeprtndu-se stratul extern i generndu-se o suprafa nou electrochimic activ. Elctrozii rennoii prin aceast metod prezint o comportare electrochimic stabil i reproductibil pe o perioad definit de timp ( cteva sptmni), funcie de numrul de determinri effectuate.

Suprafeele noi de electrod pot fi uor regenerate cu o reproductibilitate a picului anodic de 510%.

Influena fa de pH
n ambel cazuri (TMPD n soluie i fixat n pasta de crbune), potenialele picurilor anodice i catodice au fost influenate n mod identic de modificarea vitezei de baleiere a potenn ambel cazuri ( TMPD n soluie i fixat n pasta de crbune), potenialele picurilor anodice i catodice au fost influenate n mod identic de modificarea vitezei de baleiere a potenialului. Pentru valori de pn la 50 mV/s potenialele de pic au fost independente de viteza de baleiere, n timp ce pentru valori mai mari, att procesele de faz omogen ct i heterogen, au fost deplasate spra valori mai mari de potenial. n plus, variaiile potenialelor de pic cu pH-ul , au fost identice pentru ambele sisteme. n ambele cazuri graficul Ep-pH (figura 3.5.) a prezentat un salt de 59 mV/unitate de pH la valori de pH mai mici dect 6,0, curbele aplatizndu-se peste aceast valoare de pH. Acest tip de dependen fa de pH sugereaz faptul c gruprile electroactive din ECM-PC se comport ca adevrate center active de suprafa, influenate de condiiile din soluie, ele nefiind ascunse n interior, ECM nu prezint o comportare ideal corespunztoare unui monostrat (un singur strat de grupri modificatoare fixate pe suprafaa electrodului). Criteriile experimentale utilizate n caracterizarea comportrii unui ECM sunt separarea picului anodic de cel catodic, i dependena curenilor anodici i catodici asociai Ipa i Ipc pentru astfel de elctrozi variaz direct proporional cu rdcina ptrat a vitezei de baleiere a potenialului, specific electrozilor controlai de difuzie. Aa cum rezult din figurile 3.3 i 3.4. pentru Ecm-PC folosind n acest studiu, forma i separarea picurilor anodice i catodice observate pentru primul transfer electronic TMPD sunt asemntore cu cele obinute pentru TMPD n soluie la suprafaa unui sensor nemodificat de past de crbune; aceast comportare persist i pentru valori mici de baleiere a potenialului. n final, au fost construii i comparai diferii ECM coninnd concentraii diferite de TMPD n amestecul iniial de past de crbune. Aa cum se observ din tabelul 3.1., pentru ECM fabricai din amestecuri de past coninnd 0,25% pn la 1% TMPD n greutate, curenii obinui au fost proporionali cu concentraia de TMPD. Tab. 3.1. Caracteristicile ECM funcie de concentraia modificatorului Conc. TMPD % 1,00 0,75 0,50 0,25 Epa(V), v.s. Ag/AgCl 0,090 0,090 0,095 0,090 Ipa (A) 29,0+2,4 17,3+2,4 11,0+1,0 5,0+0,4

Concentraiile mai mari de 1% nu au fost folosite datorit curenilor necontrolai care se obin. ncercrile de a folosi concentraii de 0,1% TMPD sau mai mici nu au fost ncununate de success n privina obinerii unor ECM care s genereze unde semnificative.

Evident, comportarea catalitic a ECM este similar cu cea a TMPD n soluie fa de dopamin, cataliz fiind evineniat printr-o cretere semnificativ a curentului anodic. n plus, funcie de concentraiile de dopamin prezente n soluie, unda de reducere se micoreaz sau dispare total n cazul scanrii n sens invers a potenialului. Dependena de pH a procesuuli catalytic a fost studiat i a fost similar cu cea anterioar observat pentru oxidarea TMPD. n continuare au fost studiate dou aspecte legate direct de aplicaiile analitice ale catalizei prin intermediul ECM i anume: depandena de concentraie i mrimea selectivitii. Curbele de calibrare obinute pentru ECM coninnd diferote concentraii de TMPD i corectate pentru curenii rezultai n absena compusului de analizat au prezentat domenii mari de liniaritate. Domeniul cel extins de liniaritate s-a obinut pentru electrodul coninnd cantitatea cea mai mare de TMPD. La concentraTii mici de dopamin rspunsul electrodului a fost limitat de curentul de baz existent datorat nsi oxidrii TMPD, n timp ce la concentraii mari de dopamin, principala surs de interferene a constituit-o curentul de baz generat de oxidarea direct necatalizat a dopaminei care apare la o valoare de potenial de +0,26 V vs. Ag/AgCl (aceeai cu cea de la nivelu unui electrod de past de crbune nemodificat). Determinarea unor concentaii mici de dopamin a fost limitat de primul effect i favorizat de utilizarea unor concentraii minime de TMPD n past de crbune. Deci sensibilitatea maxim s-a obinut la un electrod coninnd concentraii de 0,25% TMPD n past de crbune. Limita de detecie folosind acest electrod a fost de 5x10-5 M dopamin, comparabil cu cea obinut la nivelul unor electorzi nemodificai. Domeniul de liniaritate pentru acest electrod a fost cuprins ntre 0,05-5,0 mM. Reproductibilitatea msurtorilor picurilor de current pe domeniul menionat realizate cu diferite suprafee de electrod a fost de 5-10%. n general rezultatele obinute cu ajutorul ECM au fost comparabile ca precizie i reproductibilitate cu cele obinute la nivelul electrozilor de past de crbune. Prin folosirea ECM , totui curentul este urmrit la +0,1 V vs. Ag/AgCl valoare corespunztoare oxidrii dopaminei la suprafaa electrodului de past de crbune. Cel mai important aspect al performanelor Ecm-TMPD a fost aceast deplasare a potenialului care ofer posibilitatea determinrii acestui compus n prezena altor specii care la nivelul electrozilor nemodificai apar la aceeai valoare de potenial. Un exemplu n acest sens l reprezint dopamine i acidul ascorbic care se oxideaz pe suprafaa electrozilor de past de crbune la poteniale de +0,26 V i respective 0,28 V. de fapt, determinarea separat a acestor doi compui este de importan practic deoarece discriminarea acestor specii n esutul nervos a fcut obiectul multor studii publicate n literatur, de cercettorii interesai n chimia proceselor de neurotransmitere. Voltamogramele pentru o soluie coninnd un amestec echimolecular de dopamin i acid ascorbic obinute la suprafaa unui electrod de past de crbune i a unuia CM-TMPD 0,25% sunt redate n figura 3.9. Apar n mod clar dou unde anodice separate numai pentru ECM, dopamine aprnd la prima oxidare a TMPD i acidul ascorbic la potenialul obinuit

de 0,28 V. deoarece voltamograma ciclic a fost trasat pn la valoarea de 0,35 V cea de-a doua und pentru TMPD nu apare. Avantajul oferit de ECM pentru determinarea a doi compui n amestec este redat n tebelul 3.2., n care picul de current obinut pentru o soluie de concentraie 1x10-3 M este constant n prezena unor concentraii diferite de acid ascorbic. Tabel 3.3. curentul pentru dopamin n prezena acidului ascorbic Dopamine (M) 1,0x10-3 1,0x10-3 1,0x10-3 1,0x10-3 1,0x10-3 Acid ascorbic (M) 5,2x10-4 210x10-4 1,1x10-4 5,2x10-4 2,0x10-4 Ipa (A) 36,0 33,0 30,4 32,3 29,7

Unde: a=rezult la +0,10 V vs. Ag/AgCl Curba de calibrare obinut pentru diferite concentraii de dopamin n prezena unei concentraii constante de acid ascorbic. 1x10-3 a fost liniar pe domeniul 0,05-5,0 mM (coeficientul de corelaie 0.991). n prezena acidului ascorbic, curba de calibrare prezint o pant mai mare comparativ cu cea observat anterior pentru dopamin. Mult mai dificil dar, n acelai timp mult mai realistic, este cazul n care compusul de analizat apare la cea de-a doua und i inteferentul n exces la prima, este simultan de situaia invers implicnd determinarea unor urme de acid ascorbic n prezena unui exces de dopamin. Gradul mai mare de dificultate analitic rezult din faptul c, n aceste condiii cele dou unde apar nc la poteniale distincte, cea de-a doua und corespunztoare acidului ascorbic se suprapune pe coad poriunea final dar semnificativ a oxidrii dopaminei. Aceasta depete cu mult selectivitatea obinut la nivelul electrozilor de pasta de crbune nemodificai. Interesant este de comparat rezultatele obinute cu cele ale lui Cheng pentru un electrod de grafit/epoxi electrochimic pretratat prin ciclizarea iniial a electrodului ntre +0,7 i 0,2 V naintea determinrii. n general, electrozii notri chimic modificai nu au fost capabili s conduc la o discriminare mare ntre oxidrile dopaminei i ale acidului ascorbic, cum este cazul electrozilor electrochimic pretratai. Unul dintre motive este acela c oxidarea dopaminei nu este catalizat cu eficien de TMPD ncorporat fcnd ca oxidarea acesteia s fie separat de cea necatalizat a acidului ascorbic i s fie de numai 0,18 V.

CONCLUZII
S-a proiectat i construit un electrod chimic modificat bazat pe includerea direct n pasta de crbune a N,N,N,N- tetrametil p-fenilendiamin. Proprietile acestuia au fost caracterizate prin voltametrie ciclic. Electrozii astfel construii au prezentat dou unde de oxidare (dou oxidri) dependente de pH la +0,1 V i +0,4 V vs. Ag/AgCl la fel ca i soluia de TMPD. Curenii obsrvai (rezultai) au fost dependeni, direct proporionali cu concentraia de TMPD adugat n pasta de crbune; suprafee noi de electrod pot fi generate n cteva minute cu o reproductibilitate de 5-19%. Electrozii chimic modificai pe baz de TMPD pot cataliza electrooxidarea dopaminei la nivelul primei unde anodice. Domeniul de liniaritate a fost cuprins la nivelul primei unde anodice. Domeniul de liniaritate a fost cuprins ntre 5x10-3 M i 5x10-5 M dopamin. Din punctul de vedere al simplitii, flexibilitii i reproductibilitii ECM pe baz de past de crbune posed n mod clar proprieti attractive. Procesul de modificare utilizat este unul din cele mai generale.

BIBLIOGRAFIE
1. 2. R.W. Murray, A.G Eewing and R.A. Durst, Anal. Chem. , 1987, 59, 379 E. Wang, H. Hou, Electroanalysis, 1991, 3, 1

3. P.T. Kissinger, Laboratory Techniques in Electroanalytical Chemistry, P.T. Kissinger and W.R. Heineman, Eds., Dekker, New York, 1984, pp. 611-635 4. 5. 110, 618 6. 7. 8. L.L. Miller and M.R. Van de Mark, J. Am. Chem. Soc. , 1978, 100, 3223 A. Merz and A.J. Bard, J. Am. Chem. Soc. , 1978, 100, 3222 A.N.K. Lau and L.L. Miller, J. Am. Chem. Soc. , 1983, 105, 5271 D.S. Austin Harrison and D.S. Johnson, Electroanalysis, 1989, 1, 189 H. Lee, L. J. Kepley, H.G. Hong and T.E. Mallouk, J. Am. Chem. Soc. , 1988,

9. J.M. Kalvert, R.H. Schmel, B.P. Sullivan, J.S. Facci, T.J. Meyer and R.W. Murray, Inorg. Chem. , 1983, 22, 2151 10. R.N. Dominey, N.S. Lewis, J.A. Bruce, D.C. Bookbinder and M.S. Wrighton, J. Am. Chem. Soc. , 1982, 104, 467 11. 2379 12. 13. M. Umaa and J. Waller, ibid. , 1986, 58, 2979 N.C. Foulds and C.R. Lowe, ibid., 1988, 60, 2473 K.M. Kost, D.E. Bartak, B. Kazee and T. Kuwana, Anal. Chem. , 1988, 60,

14. H.D. Arbuna, P. Denisevich, M. Umaa, T.J. Mayer and R.W. Murray, J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 1 15. C.R. Martin and L.S. Van Dyke, In Molecular Desing of Electrod Surface, R.W. Murray, Ed., John Wiley, New York, 1992 16. 17. 18. 19. P.G. Pickup and R.W. Murray, J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 4510 R.A. Bull, F.R. Fan and A.J. Bard, J. Electrochem. Soc., 1984, 131, 687 N. Oyama and F.C. Anson, J. Electrochem. Soc., 1984,106, 1606 C.A.H. Chambers and J.K. Lee, J. Electroanal. Chem., 1967, 14, 309

20. 21. 22. 23.

R.N. Adams, Anal. Chem., 1976, 48, 1128A T. Kuwana and W.G. French, Anal. Chem., 1964, 36, 241 F.A. Schultz and T. Kuwana , J. Electroanal. Chem., 1965, 10, 95 D. Bauer and M.P. Gaillochct, Electrochim. Acta, 1974,19, 597

24. B.F. Walkins, R.J. Sehling, E. Karin and L.L. Miller, J. Am. Chem. Soc. , 1975, 97, 3549 25. 26. 27. D.A. Buttrey and F.C. Anson, J. Am. Chem. Soc. , 1982, 104, 4824 N. Oyama and F.C. Anson, J. Am. Chem. Soc. , 1979, 101, 739 M.N. Szentimary and C.R. Martin, Anal. Chem. , 1984, 56, 1898

28. A.F. Diaz and J. Batgon, In Handbook of Marcel Dekke, New York, 1986, Vol. I, pp. 81-116 29. 105, 7002 M. Krishnan, J.R. White, M.A. Fox and A.J. Bard, J. Am. Chem. Soc. , 1983,

30. D.C. Bookbinder, J.A. Bruce, R.N. Dominey, N.S. Lewis and M.S. Wrighton, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1980, 77, 6280 31. 32. 33. 34. A. Fitch, Clays and Clay Minerals, 1990, 38, 391 D.R. Rollinson, Chem. Rev., 1990, 90, 867 K. Itaya, I. Uchida and V.D. Neff, Acc. Chem. Res., 1986, 19, 162 C.A. Goss, C.J. Miller and M. Majda, J. Phys. Chem., 1991, 300, 377

35. A. Despic and V. Parkhutik, in Modern Aspect of Electrochemistry, J. Bokris, R.E. White and B.E> Conway, Eds., Plenum, New York, 1989, chap. 6 36. 37. 508 38. 39. 40. 41. 1969 B.R. Shaw and K.E. Creasy, ibid., 1988, 60, 1460 K.E. Creasy and B.R. Shaw, ibid., 1989, 61, 1460 R.N. Adams, Anal. Chem. , 1958, 30, 1576 R.N. Adams, Electrochemistry at Solid Electrodes, Marcel Dekker, New York, W. Kurner, T.J. Meyer and W.R. Murry, J. Electroanal. Hem., 1985, 195, 375 J. Wang, T. Golden, K. Varughese and J. El- Rayes, Anal. Chem., 1989, 61,

42. 43. 44. 45. 46. 47. 342 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57.

C. Olson and R.N. Adams, Anal. Chim. Acta, 1960, 22, 582 C. Olson, R.N. Adams, Anal. Chim. Acta, 1963, 29, 358 E.S. Jacobs, Anal. Chem., 1963, 35, 2112 G. Farsang, Acta Chim. Acad. Sci., Hung, 1965, 45, 163 R. Landsberg and R. Thiele, Electrochim. Acta, 1966, 11, 1243 H. Monien, H. Ipecker and K. Zinke, Fresenius Z. Anal. Chem., 1967, 225, J. Lindquist, J. Electroanal. Chem., 1974, 52, 37 C.A.H. Chambers and J.K. lee, J. Electroanal. Chem., 1967, 14, 309 R.N. Adams, Anal. Chem., 1976, 48, 1128A G.T. Cheek and R.F. Nelson, Anal. Lett., 1978, 11, 393 T. Yao and S. Musha, Anal. Chim. Acta, 1979, 110, 203 K. Ravichandran and R.P. Baldwin, J. Electroanal. Chem., 1981, 126, 293 R.N. Adams, Rev. Polarog., 1963, 11, 71 A.A. Kaplin, N.P. Pikula and E.Y. Neiman, Zh. Anal. Khim., 1990, 45, 2086 A.A. Kaplin, N.P. Pikula and E.Y. Neiman, Zh. Anal. Khim., 1991, 45, 198 M. tulikova and tulik, Chem. Listy, 1974, 68, 800

58. T.R. Mueller, C> Olson and R.N. Adams, in Advances in Polarography, J.S. Langumir, Ed., Vol. I, Pergamon, London 1960, pp. 198 59. F. Vydra, K. tulik and E. Julkov, Electrochemical Stripping Analysis, Ellis Horwood, Chichester, UK 1976 60. J. Wang, Stripping Analysis, VCH, New York, 1985

61. G. Dryhust and D.L. McAllsiter, Laboratory Technique in Electroanalytical Chemistry, P.T. Kisseger and W.R. Heineman, Eds., Marcel Dekker, New York 1985, pp. 294 62. R.J. Foster and J.G. Vas in Wilson & Wilson`s Comprehensive Analytical Chemistry, Vol. XXVII: Analytical Voltammetry, M.R. Smish and J.G. Vos, Eds., Elsevier Amsterdam, pp. 465 63. K. Khalcer, J. M- Kauffmann, J. Wang, I. Svancara, K. Vytras, C. Neuhold and Z. Yang, Electroanalysis, 1995, 7, 5

64. 65. 66. 67.

J. Wang, Anal. Chim. Acta, 1990, 243, 41 G.J. Patriache and J.C. Vire, Anal. Chim. Acta, 1987, 196, 193 Kh. Z. Brainina and V.V. Ahspur, Zavod. Lab., 1979, 45, 10 Kh. Z. Brainina and M.B. Vydrevich, J. Electroanal. Chem. , 1981, 121, 1

68. N.A. Vlakhovich, E.P. Medyntseva and G.K. Budnikov, Zh. Anal. Khim., 1993, 48, 980 69. I. Svancara, K. Vytras, F. Renger and M.R. Smyth, Sb. Ved. Pr., Vys. Sk. Chemickotechnol, Padubice, 1992, 56, 21 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 1268 78. 79. 80. R.C. Engstrom, K.W. Johnson and S. Des-Jarlais, Anal. Chem., 1989, 59, 670 J. Wang, L.H. Wu and R. Li, J. Electroanal. Chem., 1989, 272, 285 J.D. McLean, Anal. Chem., 1982, 54, 1169 M.E. Rice, Z. Galus and R.N. Adams, J. Electroanal. Chem., 1983, 143, 89 F.I. Cheng and C.R. Martin, Anal. Chem., 1988, 60, 2163 J. Wang and J.M. Zadeii, J. Electroanal. Chem., 1988, 249, 339 C. Urbaniczky and K. Lindstrm, J. Electeroanal. Hem., 1984, 176, 169 J. Lindquist, Anal. Chem., 1973, 45, 1006 R. Landsberg and R. Thiele, Electrochim. Acta, 1966, 11, 1243 D.G. Davis and M.E. Everhard, Anal. Chem., 1964, 36, 38 L.S. Chulkina, S.I. Siniakova and Y.K. Vulfson, Zh. Anal. Khim., 1970,25,

81. J. Wang, T. Martinez, D.R. Yaniv and L. McCormick, J. Electroanal. Chem., 1990, 286, 265 82. 339 83. 84. Z. Gabes and R.N. Baldwin, Anal. Chem., 1984, 67, 866 K. Ravinchandran and R.P. Baldwin, Anal. Chem., 1984, 56, 1744 R. Neeb, I. Keihnast and A. Narayan, Fresenius Z. Anal. Chem., 1972, 262,

85. A. Ciucu, Biosensors for Envirommental Monitoring, Niculescu Publishing House, Bucharest 2000, pp. 200-245

86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96.

K.N. Thomsen and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1990, 2, 263 J.W. Schlager and R.P. Baldwin, J. Chromatog., 1987, 390, 379 J. Ye and R.P. Baldwin, Anal. Chem., 1988, 60, 2263 K.N. Thomsen and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1990, 1, 236 J. Ye, R.P. Baldwin, and J.W. Schlager, Electroanalysis, 1989, 1, 133 S.V. Pralehu and R.P. Baldwin, Anal. Chem., 1989, 61, 852 Idem, ibid., 1989, 61, 2258 P. Luo, S.V. Prabhu and R.P. Baldwin, ibid., 1990, 62, 752 X. Qi and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1991, 3, 119 A. Ciucu and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1992, 4, 515 X. Qi and R.P. Baldwin, Electroanalysis, 1993, 5, 547