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Los cultivos celulares: una herramienta clave

Los cientficos han desarrollado metodologas para aislar clulas y obtener, a partir de ellas, poblaciones homogneas que luego pueden ser analizadas, e incluso multiplicarse in vitro (en vidrio = en el laboratorio). Esto ofrece ventajas en la investigacin bsica ya que permite estudiar diversos procesos que ocurren en las clulas, y en la investigacin aplicada para la produccin de molculas de inters, ingeniera de tejidos, entre otras. Las clulas pueden ser aisladas y separadas en diferentes tipos El primer paso para aislar clulas del mismo tipo a partir de un tejido (formado por clulas de diversos tipos) es separar la matriz extracelular que las une. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolticas (como tripsina y colagenasas) que degradan las protenas de la matriz; tambin se utilizan agentes (como el EDTA - cido etilendiaminotetraactico-) que pueden secuestrar al ion calcio, del cual depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitacin, se obtiene a partir del tejido, una suspensin celular con ms de un tipo de clula, probablemente. Se pueden utilizar varios mtodos para separar los diferentes tipos celulares de la suspensin celular, segn sus propiedades: 1. La diferencia de tamao de las clulas permite separarlas por centrifugacin. 2. La capacidad que tienen algunos tipos celulares de adherirse al vidrio o al plstico, permite separarlos de otras clulas que se adhieren dbilmente. 3. Algunos anticuerpos se unen especficamente a sustancias presentes en determinadas clulas. Luego, se emplea diferentes matrices (como colgeno, bolitas de polisacridos, plstico) a la cuales slo las clulas reconocidas por los anticuerpos podrn adherirse. Las clulas pueden, luego, recuperarse por agitacin, por tratamiento con tripsina que digiere las protenas que median la adhesin o, en el caso de una matriz digerible (como el colgeno), degradando la propia matriz con enzimas (como la colagenasa). 4. Se emplean anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para marcar clulas especficas adheridas a ellos. Las clulas marcadas por interaccin con el anticuerpo pueden ser separadas de las no marcadas en un separador de clulas activado por fluorescencia o cell sorter ( ver figura 1).

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vibrador ultrasnico suspensin celular fluido de envoltura

lser pequeo grupo de gotas cargadas negativamente debido a la deteccin de una clula fluorescente.

Seal para otorgar la carga elctrica a la gota pequeo grupo de gotas cargadas positivamente debido a la deteccin de una clula fluorescente.

recipiente para la recoleccin de gotas no separadas

Figura 1. Equipo para la separacin de clulas activado por fluorescencia. Las clulas individuales viajan a travs de un conducto muy delgado y son iluminadas por un lser. El equipo puede detectar qu clulas emiten fluorescencia (por el anticuerpo adherido). Cada clula es incorporada en una gota que es cargada elctricamente como negativa o positiva en funcin de la presencia o ausencia del colorante fluorescente. Luego, las gotas son separadas por un campo elctrico hacia los recipientes colectores segn su carga (adaptado de Alberts y col., MBC 2002).

5. Diseccin de un grupo de clulas a partir de una seccin de tejido que ha sido preparada para microscopa (ver Cuaderno N 80). La regin que contiene las clulas de inters es irradiada con un pulso de lser infrarrojo, que funde un pequeo crculo con las clulas que estn por debajo. Estas clulas capturadas son luego removidas para mayor anlisis. La tcnica, denominada

EDICIN N 98 microdiseccin de captura por lser, puede utilizarse, por ejemplo, para aislar diferentes partes de un tumor, y analizarlas. Otra tcnica relacionada emplea un lser para disectar un grupo de clulas y catapultarlas a un contenedor apropiado para comenzar los anlisis de las mismas (figura 2).

Seccin delgada de un rgano afectado por un tumor.

Un lser corta alrededor de la regin de inters

Un segundo lser es usado para catapultar la regin seleccionada a un contenedor.

Figura 2. Tcnica de microdiseccin para seleccionar clulas aisladas a partir de porciones tisulares. Este mtodo emplea un lser para escindir una regin de inters y eyectarla a un contenedor, permitiendo el aislamiento an de una clula individual a partir del tejido. (Fuente: Alberts y col., MBC 2004).

Una vez que se obtiene una poblacin homognea de clulas, la muestra puede emplearse para anlisis bioqumicos. Tambin provee del material de partida para aumentar el nmero de clulas y establecer un cultivo que permita estudiar el comportamiento celular en una placa de cultivo (que no es igual que interaccionar con el resto del organismo). Las clulas pueden ser crecidas en una placa de cultivo La mayora de las clulas animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse e incluso expresar propiedades diferenciales, si se les provee un medioambiente apropiado en una placa de cultivo. As, las clulas pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas bioqumicamente, con la utilidad de explorar los efectos del agregado o remocin de molculas especficas, tales como hormonas o factores de crecimiento, al cultivo celular. Adems, mezclando dos tipos celulares, las interacciones entre ellas pueden ser estudiadas. Cuando los experimentos se realizan sobre cultivos celulares, se dice que son experimentos in vitro (en vidrio), para diferenciarlos de los experimentos que se llevan a cabo en organismos completos, a los que se denomina in vivo (en el organismo viviente)1.
1

En los laboratorios de bioqumica, por in vitro se entienden aquellas reacciones qumicas que se llevan a cabo en un tubo de ensayo en ausencia de clulas, mientras que in vivo se refiere a las reacciones qumicas que ocurren dentro de la clula, an en cultivo.

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El cultivo de tejidos y clulas comenz en 1907 con un experimento diseado para esclarecer una controversia en la neurobiologa por el investigador Dr. Ross Harrison (figura 3), quien trabajaba en la Universidad Johns Hopkins. El investigador public un breve pero crtico artculo (Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo) que introdujo exitosamente una nueva tcnica, el cultivo de tejidos, para demostrar experimentalmente cmo las fibras nerviosas se originan. Los experimentos originales en fibras nerviosas se basaron en el cultivo de pequeos fragmentos de tejidos, llamados explantos. Utilizando tcnicas aspticas desarrolladas para la manipulacin de embriones de ranas, Harrison tom a partir de uno de ellos, fragmentos del tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema nervioso), depositndolo en una gota de lquido linftico fresco (medio de cultivo) de rana colocada sobre un cubreobjetos estril (figura 3). Una vez que la linfa coagul, invirti el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que posea una depresin, creando as un cultivo en gota suspendida, tcnica utilizada por los microbilogos para estudiar las bacterias. Luego de peridicas observaciones al microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las neuronas presentes en el tejido extirpado. As, adems de argumentar slidamente la doctrina neural, resolvi los problemas bsicos del cultivo celular, como el medio, la observacin y la contaminacin.

Figura 3. Experimento del Dr. Harrison, 1907. A la izquierda se muestra una fotografa del Dr. Ross Granville Harrison, quien dise el experimento. A la derecha, esquema del diseo experimental, donde el explanto es la porcin de tejido neural, incluido en una gota de linfa. Adaptado de www.corning.com

Con este experimento, el cultivo de clulas comenz su camino para convertirse en una gran herramienta tanto para la investigacin como para la produccin de anticuerpos monoclonales, vacunas y productos farmacolgicos a gran escala. Distintos tipos de cultivos celulares Actualmente, los cultivos se establecen principalmente a partir de suspensiones celulares generadas por disgregacin de tejidos (explicado anteriormente). A diferencia de las bacterias, la mayora de las clulas obtenidas de tejidos no estn adaptadas para vivir en suspensin, y requieren una superficie slida en la cual crecer y dividirse. Para los cultivos celulares, este soporte est generalmente provisto por la superficie de una placa de cultivo plstica. De todas formas, como las diferentes clulas varan en sus requerimientos, a veces el crecimiento y diferenciacin de las mismas slo se logra recubriendo el soporte plstico con componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las clulas en los tejidos, con la cul interactan), como por ej. colgeno y laminina. Los cultivos se pueden clasificar en:

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Cultivos primarios Se denomina cultivo primario a aquellos cultivos preparados directamente a partir de los tejidos de un organismo, sin proliferacin (multiplicacin) in vitro. Este tipo de cultivo puede iniciarse con o sin fraccionamiento para separar los distintos tipos celulares. En la mayora de los casos, las clulas de los cultivos primarios pueden ser removidas del recipiente de cultivo a uno nuevo donde proliferarn para formar varios cultivos secundarios. Cultivos secundarios En estas condiciones, las clulas suelen crecer hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo, formando una monocapa (capa de una clula de espesor), donde como consecuencia del contacto entre las clulas se detiene temporalmente su proliferacin, hasta que se las subcultiva a un recipiente con medio fresco; as podrn subcultivarse durante semanas o meses. En este estadio, las clulas frecuentemente mostrarn distintas propiedades en funcin de su origen. Por ejemplo, los fibroblastos (clulas que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos animales) secretarn colgeno; las clulas derivadas de tejido muscular esqueltico se fusionarn para generar fibras musculares con capacidad contrctil espontnea; las clulas nerviosas extendern prolongaciones (axones) elctricamente excitables que podrn conectarse (establecer sinapsis) con otras clulas nerviosas; las clulas epiteliales formarn largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto (figura 4). Gracias a que estos fenmenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes metodologas, a veces no aplicables a tejidos intactos.

Figura 4. C lulas en cultivo. A M ) icrografas d contraste de e fase de fibroblastos en cultivo. B M ) icrografas de m ioblastos en cultivo m ostrando las clulas fusionadas para form clulas ar m usculares m ultinucleadas. C C las precursoras de ) lu oligodendroc itos en cu ltivo. D C lulas de tabaco, ) pertenecientes a la lnea ce lular B 2, en cu Y ltivo lquido; en ellas se pueden observar espacios translc idos co rrespondientes a las e norm vacuolas. Tom es ado de A lberts y col., M C 2004. B

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Cultivos continuos o Lneas celulares La mayora de las clulas de los vertebrados cesan su divisin celular luego de un nmero finito de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en cultivo, antes de detenerse. En estas clulas, as como en muchas otras, la capacidad limitada de proliferacin es el resultado de un acortamiento progresivo de los telmeros (porcin de ADN que se encuentra en los extremos de los cromosomas). En las clulas somticas (todas las clulas que no son clulas sexuales) se encuentra apagado el gen que codifica para la enzima telomerasa, que se encarga de mantener la integridad de los telmeros; como consecuencia, los telmeros se acortan en cada divisin celular. A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que codifica para la telomerasa; as, pueden propagarse como una lnea celular inmortalizada. Pero como se mencion, no todas las clulas humanas se inmortalizan de la misma manera. Algunas clulas, a pesar de que sus telmeros permanezcan largos, pueden frenar sus divisiones celulares como consecuencia de la activacin de mecanismos denominados puntos de control (check points) del ciclo celular. Para inmortalizar estas clulas, hay que lograr la inactivacin de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos oncogenes (genes promotores del cncer) que pueden ser obtenidos de virus cancergenos (como algunas cepas de HPV o virus del papiloma humano, adenovirus, etc.). A diferencia de las clulas humanas, las de los roedores no tienen apagado el gen de la telomerasa, por lo que sus telmeros mantienen el largo a travs de las divisiones celulares. Pero cuando son cultivadas, esas clulas experimentan cambios genticos que inactivan los mecanismos de check-point, produciendo lneas celulares inmortalizadas espontneamente. Ambos tipos de lneas celulares son muy tiles en la investigacin celular, como fuente de un gran nmero de clulas uniformes, que pueden ser conservadas y almacenadas en nitrgeno lquido (a -196C) por un perodo muy largo de tiempo, reteniendo su viabilidad, y constituyen un buen modelo experimental para las primeras etapas de una investigacin. A pesar de la gran similitud que las clulas de una lnea tienen entre s, no son idnticas. La uniformidad gentica en una lnea celular puede mejorarse por clonado celular, donde una nica clula es aislada y prolifera para formar una gran colonia de clulas clonales. Una de las aplicaciones ms importantes de esta estrategia es el aislamiento de lneas celulares mutantes que poseen defectos en ciertos genes. La informacin que su estudio puede proporcionar es de gran valor, ya que permite inferir el rol que la protena ausente o alterada tiene en las clulas normales. Entre los cultivos celulares ms polmicos y promisorios, desde un punto de vista mdico, se encuentran las lneas de clulas madre embrionarias humanas (ver Cuaderno N 83). Estas clulas, obtenidas del macizo celular interno de un embrin en los primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar indefinidamente reteniendo la habilidad de originar cualquier tipo celular del cuerpo. Estos cultivos celulares podran potencialmente revolucionar la medicina al proveer de clulas capaces de reemplazar o reparar tejidos daados. Otra fuente de clulas madre que se est investigando es el tejido adulto. Qu son los hibridomas? Se sabe que es posible fusionar dos clulas formando un heterocarionte, es decir, una clula con dos ncleos separados pero con los contenidos citoplasmticos compartidos. Para

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lograrlo, una suspensin de clulas es tratada con compuestos que inducen la fusin de membranas (fusgenos), tales como ciertos virus o el compuesto polietilenglicol (PEG). Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una clula hbrida en la cual las envolturas de ambos ncleos se han disgregado, permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un nico gran ncleo. Tales clulas hbridas pueden clonarse estableciendo una lnea celular, pero se sabe que en muchos casos la lnea resultante es inestable genticamente, y tiende a perder parte del material gentico. En 1975, un equipo integrado por el cientfico argentino Dr. Csar Milstein desarroll, mediante la tcnica de fusin, una lnea celular hbrida clave para la produccin de anticuerpos monoclonales (todos iguales) para fines de diagnstico y teraputicos: los hibridomas (este desarrollo llev al Dr. Milstein a ser galardonado con el Premio Nbel). Los hibridomas son lneas celulares resultantes de la fusin de dos tipos celulares: un linfocito B secretor de inmunoglobulinas (anticuerpos) y una lnea celular derivada de un tumor de linfocitos B. Los linfocitos B secretores de anticuerpos se generan mediante la inmunizacin de una rata o ratn con un antgeno de inters contra el cual se quieren generar los anticuerpos. Se obtiene como resultado una mezcla heterognea de clulas hbridas, seleccionndose a partir de ellas aquellas clulas con la capacidad de producir el anticuerpo deseado y de proliferar indefinidamente. Estos hibridomas son propagados como clones individuales, cada uno de los cules provee una fuente estable y permanente de un nico tipo de anticuerpo monoclonal (figura 5). Dicho anticuerpo reconoce un nico eptope antignico (es decir, por ej., un grupo particular de 5-6 aminocidos en una conformacin espacial tambin especfica). Entre las ventajas de los hibridomas frente a un cultivo clonal de un linfocito B secretor particular, est que los mismos tienen una vida limitada en cultivo.

Ratn inmunizado con el antgeno X

Lnea celular mutante derivada de un tumor de linfocitos B.

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Clula produciendo un anticuerpo anti-X Linfocitos B (mueren Pocos das despus De estar en cultivo)

Las clulas crecen indefinidamente en el medio normal, pero mueren en el medio selectivo

Se testea el medio que rodea las clulas en busca del anticuerpo anti-X, y lsa clulas del contenedor positivo se redistribuyen de una clula por nuevo contenedor.

Las clulas se multiplican y luego se vuelve a evaluar la presencia del anticuerpo anti-X

Figura 5. Preparacin de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra un antgeno en particular. Aqu el antgeno de inters es designado como antgeno X. El medio de crecimiento selectivo utilizado luego del paso de fusin celular, contiene un inhibidor (aminopterina) que bloquea las rutas biosintticas normales por las cuales se sintetizan los nucletidos. Como consecuencia, las clulas deben utilizar una va alternativa para fabricar sus cidos nucleicos. Esta va es defectiva en la lnea celular mutante derivada del tumor de linfocitos B, pero est intacta en las clulas obtenidas del ratn inmunizado. Debido a que ninguna de las clulas utilizadas para la fusin inicial puede crecer por s sola, solo las clulas hbridas sobreviven. Adaptado de Alberts y col., MBC 2004.

Qu contienen los medios para el cultivo de clulas? Hasta los aos 70, el cultivo de tejidos pareca resultar de la fusin entre la ciencia y la brujera. De a poco, los fluidos coagulados (como en el experimento de Harrison) fueron reemplazados por placas con medios lquidos que contenan pequeas cantidades de una serie de molculas necesarias para la supervivencia y multiplicacin celular: sales, glucosa, aminocidos y vitaminas; adems, la mayora de los medios incluan una mezcla poco definida

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de macromolculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios se siguen utilizando en la actualidad (ver tabla 3, para cultivo de clulas animales) para los cultivos de rutina, generando la dificultad para muchos investigadores en conocer cules son las macromolculas especficas que un dado tipo celular requiere para funcionar normalmente. Como consecuencia se desarrollaron numerosos medios qumicamente definidos, denominados libres de suero, que poseen, adems de las pequeas molculas mencionadas, varias protenas especficas necesarias para la supervivencia y proliferacin, como factores de crecimiento (estimulan la proliferacin celular). As se descubrieron muchas molculas de sealizacin extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y proliferacin de determinados tipos celulares, gracias a estudios que buscaban establecer las condiciones mnimas de cultivo para un comportamiento celular adecuado. Otro componente de importancia para los medios de cultivo son compuestos indicadores de pH. Los mismos le otorgan color al medio, que puede ir virando hacia otro color en funcin de los cambios de acidez del medio, permitiendo monitorear un parmetro muy importante para el cultivo celular.
Tabla 3. Composicin de medios de cultivo para clulas eucariotas animales
Aminocidos Vitaminas Arginina Cystina Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Tritopfano Tirosina Valina Biotina Colina Folato Sales NaCl KCl Otros compuestos Protenas requeridas en los medios definidos libres de suero glucosa Penicilina* Insulina Transferan Factores de crecimiento especficos

NaH2PO4 Streptomicina*

Nicotinamida NaHCO3 Rojo fenol pantotenato piridoxal Tiamina riboflavina CaCl2 MgCl2 suero

*Penicilina y estreptomicina son antibiticos adicionados para suprimir el crecimiento de bacterias

contaminantes. El rojo fenol es un colorante indicador de pH cuyo color es monitoreado para asegurar que el pH sea aproximadamente 7,4. Los cultivos crecen usualmente en contenedores de plstico o vidrio con una superficie apropiada para la adhesin celular. Los contenedores con el cultivo se mantienen en una estufa a 37C en una atmsfera de 5% de CO2, 95% aire.

Cultivos celulares y una variedad de contenedores Existen numerosos dispositivos diseados para realizar cultivo de tejidos, dependiendo de las caractersticas de las clulas a cultivar, y de la dimensin de cultivo que se quiera alcanzar. La mayora de los cultivos de tejidos o clulas se llevan a cabo en pequea escala, donde un nmero de clulas relativamente pequeo es necesario para realizar experimentos. En dicha escala, las clulas crecen frecuentemente en frascos de entre 25 a 175 cm2, una medida que se refiere a la superficie de uno de los lados sobre el cul las clulas se adhieren y

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crecen (ver figura 6: frascos T). En un recipiente tpico de 175cm2, el rendimiento es de aproximadamente 1x107 clulas de una lnea adherente, y 1x108 clulas de lneas que crecen en suspensin (siempre dependiendo del tipo celular). En los frascos T estndares, no es posible producir cantidades mayores de clulas, dada la cantidad de tiempo insumida para los repetidos pasajes necesarios a medio fresco, la demanda de espacio en un incubador (que controla la composicin de gases, la temperatura y la humedad del entorno) y el costo. Cuando se considera aumentar la escala del cultivo (escalado o scaling-up), se deben tener en cuenta numerosos parmetros, incluyendo problemas asociados a la deplecin de nutrientes, el intercambio gaseoso (especialmente deplecin de oxgeno), y la aparicin de metabolitos txicos como el amonio y el cido lctico.
Figura 6. Distintos contenedores para cultivo de clulas. A) Frasco T; b) Frasco triple; c) botellas rodantes; d) biorreactor; e) frasco con paletas; f) frascos con agitacin (erlenmeyer). Fotos: www.sigma-aldrich.com

a b d c

e
a

f
a

Existen muchos sistemas para escalar los cultivos celulares, que se muestran en la figura 6. Entre ellos, es posible encontrar desde arreglos de frascos triples y botellas cilndricas, hasta biorreactores ms complejos en su estructura. En todos los casos, es necesario asegurar el correcto intercambio gaseoso y la disponibilidad de nutrientes. Por ejemplo, el arreglo de botellas de cultivo sobre rodillos que se muestra en la figura 6 (c), est diseado de forma tal que las clulas cubran toda la superficie interna de la botella, con rodillos que al girar aseguran que el medio de cultivo bae a todas las clulas, aportndole nutrientes y retirando desechos. Otro ejemplo es el biorreactor (d) que permite obtener un rendimiento importante de

anticuerpos a partir de un cultivo celular.

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La adicin de bolitas de distintos materiales inertes puede ayudar tambin a aumentar la densidad celular en cultivos al aumentar la superficie de cultivo entre 10 y 100 veces.

Tabla 4. Tipo de contenedores para cultivo de clulas y sus capacidades Max Vol (ml) 150 150 8000 1000 1000 1000 Max clulas (suspensin) 1.5x108 1.5x108 -----1x109 1 x 109 1 x 109 Max clulas (adhesin) ~107 3x107 1.5x1010 1x108 -------------

Tecnologa Frasco T Frasco triple Factora celular Botellas rodantes Frascos para agitacin (erlenmeyer) Frascos con paletas

Como ya se mencion, las finalidades de los cultivos de clulas son mltiples, desde la investigacin bsica hasta muchas aplicaciones biotecnolgicas. Entre estas aplicaciones se pueden mencionar: la produccin de compuestos de inters farmacolgico y otros en clulas animales (anticuerpos, eritropoyetina, etc.), reparacin de dao tisular mediante cultivo de clulas madre (en desarrollo), produccin de compuestos de inters en clulas vegetales, transformacin vegetal empleando como explanto un cultivo celular, etc.

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CONSIDERACIONES METODOLGICAS Este texto se adapta especialmente a estudios terciarios y universitarios y, aunque puede ser complejo para alumnos de primaria y secundaria, resulta una fuente interesante de informacin que se puede adaptar al aula en trabajos ms simples destinados a comprender cmo trabajan los investigadores, cmo se realiza un cultivo de clulas y cmo es posible observar clulas. Se sugiere introducir estas ideas a partir de conocimientos ms cotidianos que tienen los alumnos. Por ejemplo, es posible que a muchos alumnos se les haya practicado en alguna oportunidad un exudado de fauces (mediante un hisopo que se introduce en la garganta) como consecuencia de una infeccin o dolor de garganta. Se puede utilizar este caso para explicar qu hace luego el mdico con esa muestra, cmo se hace el cultivo de clulas en el laboratorio de anlisis, la deteccin de bacterias y la realizacin de un antibiograma para determinar el antibitico a recetar. Esta sera una aplicacin prctica y ms prxima a los alumnos que podra acercar el concepto de cultivo de clulas y su utilidad, ms all de su uso en la investigacin bsica. Para trabajar estas ideas se sugiere en las actividades una experiencia simple de cultivo de microorganismos. A partir de esta idea, uno de los conceptos interesantes para trabajar en el aula se refiere al tamao celular y la posibilidad de observar clulas. Las clulas que se cultivan en laboratorio tiene un tamao microscpico y, por lo tanto, requieren de metodologas especiales para verlas (microscopios) o mtodos de deteccin a partir de reactivos. Esto es interesante para la reflexin del docente y el trabajo en el aula ya que implica que los alumnos deban creer o aceptar la idea de que eso que se ve (un crculo blanco en una placa, un lquido turbio, o un lquido con color) es resultado de la presencia de clulas. Seguramente, para quien trabaja en investigacin o tiene conocimientos ms avanzados, esos crculos que aparecen en el medio de cultivo son colonias de clulas. Sin embargo, hay que tener presente que para los alumnos esto no resulta obvio; ellos no ven all lo que el docente considera que se debe interpretar a partir de sus propios conocimientos. Lo que ellos ven frente a ellos son crculos posiblemente de diferentes colores. A partir de tener en cuenta esta idea, y trabajarla en clase a partir de las ideas previas de los alumnos acerca de lo que ven, y la interpretacin de lo que ven, se podra introducir el concepto de colonias de clulas, mtodos de deteccin, reactivos, y otras tcnicas que se emplean para ver lo que no se puede ver a simple vista. Se pretende que los alumnos entiendan el concepto de colonia de clulas, como un agrupamiento de clulas de la misma familia que quedan unidas y que permiten visualizarlas en conjunto, aunque no se puede ver a simple vista una clula particular. Si se cuenta con microscopios se puede intentar hacer un preparado a partir de esas colonias y verlo al microscopio con la idea de detectar clulas individuales.

Actividades
Las actividades que se presentan a continuacin pueden adaptarse a alumnos de niveles superiores y tambin a alumnos de primaria y secundaria, particularmente las actividades 2 y 3 que presentan experiencias que se pueden realizar en la escuela.

Actividad N1. Interpretacin de conceptos.

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Esta actividad tiene por objetivo repasar conceptos trabajados en el texto del Cuaderno. Responder Verdadero o Falso a las siguientes afirmaciones, y justificar las falsas: a) El primer paso para aislar clulas del mismo tipo a partir de un tejido (formado por clulas de diversos tipos) es separar la matriz extracelular que las une. b) Un medio de cultivo contiene pequeas cantidades de una serie de molculas necesarias para la supervivencia y multiplicacin celular: sales, glucosa, aminocidos y vitaminas, entre otras. c) Un cultivo de clulas primario es mantenido indefinidamente en el tiempo, solamente refrescando el medio de cultivo. d) Las lneas celulares se pueden establecer nicamente a partir de clulas tumorales. e) Las clulas de un cultivo celular, se comportan exactamente igual que las clulas del tejido original. f) Un hibridoma es el resultado de la fusin entre dos linfocitos B normales, y su producto es la secrecin de varios anticuerpos diferentes. g) Cuando los experimentos se realizan sobre cultivos celulares, se dice que son experimentos in vitro (en vidrio).
Respuestas: a) Verdadero. b) Verdadero c) Falso. El cultivo primario es aquel que se establece, luego o no del fraccionamiento, a partir de un tejido, sin etapas de multiplicacin in Vitro, por lo que duran un tiempo finito. d) Falso. Las lneas celulares tambin pueden establecerse a partir de clulas normales en las cuales se induce la prdida de control del nmero de divisiones celulares posibles por mecanismos de mutagnesis, introduccin de oncogenes, etc. e) Falso. Las clulas en un cultivo celular no siempre se comportan de la misma manera que en el tejido del cul se extrajeron originalmente; pueden conservar caractersticas diferenciales pero al perder la comunicacin con la matriz extracelular en la que estaban inmersas, as como el contacto con otros tipos celulares, muchas seales bioqumicas que sensaban se pierden, alterando entonces su comportamiento. f) Falso. Un hibridoma es el resultado de la fusin entre una lnea celular derivada de un tumor de linfocitos B con un linfocito B que secreta anticuerpos, obtenido de un ratn inmunizado con un antgeno particular. El hibridoma resultante luego de un proceso de seleccin exhaustivo, secreta solo un tipo de anticuerpo capaz de reconocer al antgeno de inters. g) Verdadero.

Actividad 2. Cultivo de bacterias y el efecto de antibiticos Las bacterias no pueden verse a simple vista. Sin embargo, es posible observar sus colonias, que son agrupaciones de bacterias de la misma especie, que se origina a partir de la multiplicacin de una bacteria original. Esta experiencia permitir comprobar la presencia de bacterias a nuestro alrededor. Materiales: 6 placas de Petri u otros recipientes poco profundos con tapa; agar o gelatina sin sabor; leche o yogur, una varilla metlica o hisopos esterilizados; un trozo de papa u otro vegetal cocido que se debe dejar pudrir varios das en un recipiente con agua. Discos embebidos en diferentes antibiticos (aportado por la escuela).

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Procedimiento:

preparar la gelatina con agua hirviendo como indica el envase (se le puede agregar caldo en polvo). Cuando est an caliente volcar una capa delgada sobre cada recipiente y cerrarlo inmediatamente. Colocar los recipientes boca abajo (para evitar que las gotas condensadas caigan sobre el medio de cultivo) y dejar enfriar. Una vez fros: placa 1: dejarlo sin abrir placa 2: dejarlo abierto durante toda la experiencia placa 3: toser dentro y cerrar inmediatamente placa 4: distribuir suavemente sobre el agar una pequea gota de leche o yogur con un hisopo o la varilla metlica (esterilizada en alcohol o fuego). Cerrar inmediatamente. placa 5: tomar una pequea gota de agua en la que se dej pudrir la papa y pasarla suavemente sobre el agar (como en el frasco 4). Cerrar inmediatamente. placa 6: hacer lo mismo que en la placa 5. Dejar las placas a temperatura ambiente, durante 7 das. A los 4 das, abrir la placa 6, con mucho cuidado, y colocar sobre el agar seis discos embebidos en diferentes antibiticos (que proveer el docente). Nota. En caso de no
poder realizar este paso de la experiencia se incluye a continuacin un resultado de un antibiograma para que sea analizado en clase

Anotar diariamente los cambios que se observan. Preguntas para el anlisis de la experiencia:
1. Cmo se percibe en la placa la presencia de bacterias?

2. Cul es el objetivo de la placa 1? 3. De dnde provienen los microbios que crecen sobre la placa 2? Y los que aparecen sobre la placa
3?

4. Se notan diferencias entre las colonias provenientes de diferentes orgenes? Cules son esas
diferencias?

5. Podran ser patgenas las bacterias que crecen en la placa 4? Por qu? Cmo se puede

determinar a partir de la placa con antibiticos cul de los antibiticos examinados es el ms efectivo?

Resultado de un antibiograma. Cada pastilla blanca es un antibitico diferente. Respuestas: 1. Se pueden ver colonias separadas, de diferentes tamaos y colores, o en caso de ser un nico tipo de bacteria, se puede extender como una cubierta de pequeas colonias del mismo color.

2. La placa 1 es un control o testigo que muestra que en un medio esterilizado (al hervir el agua) no crecen
microorganismos; es decir que provienen de alguna fuente externa.

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3. Los microorganismos en la placa 2 provienen del aire, del ambiente, y los de la placa 3 provienen de la respiracin de la persona que tambin es consecuencia de la entrada al cuerpo de microorganismos del ambiente (a travs de la respiracin, de los alimentos, etc.). 4. Posiblemente noten diferencias entre las colonias, en su aspecto y color, dependiendo del origen. 5. Se supone que, si no hubo contaminacin de otros microorganismos, las bacterias que son parte de los alimentos no son patgenas.

6. Se debe observar el crculo que se forma alrededor del disco de antibitico. El antibitico mata bacterias

o impide que se multipliquen, por lo tanto donde haya un crculo claro alrededor del antibitico significa que all no hay bacterias, es decir que el antibitico funcion. Cuanto ms grande sea ese crculo se supone que ms efectivo fue el antibitico en eliminar las bacterias a su alrededor.

ACTIVIDAD 3. Observacin de levaduras al microscopio Las levaduras son seres vivos, unicelulares que se reproducen asexualmente mediante un proceso conocido como gemacin que consiste en la formacin de brotes o yemas que luego se desprenden de la clula original para formar un nuevo organismo independiente. Es posible observar las levaduras al microscopio y, en algunos casos, detectar los brotes que estn en proceso de formacin. Materiales: levaduras (bloques o sobres que se compran en comercios) agua tibia azcar portaobjetos y cubreobjetos microscopio Procedimiento: 1. Preparar una mezcla con una pizca de levaduras, una cucharada de agua tibia y una pizca de azcar. 2. Dejar reposar 5-10 minutos. 3. Colocar sobre el portaobjetos y cubrir con el cubreobjetos. 4. Observar bajo el microscopio con un objetivo de fuerte aumento. 5. Dibujar lo que se observa. Nota: en caso de no poder observar claramente se debe probar alternativas para mejorar el preparado, por ejemplo, variando la cantidad de levadura que se coloca en la muestra. Preguntas para el anlisis de la experiencia 1. Qu se observa al microscopio? 2. Por qu se coloca agua y azcar al preparado? Cul es la funcin de estos componentes? Rta. Son nutrientes que aportan materia y energa a los hongos y les permiten
crecer y multiplicarse.
Levaduras en divisin

3. Teniendo en cuenta que las levaduras son seres vivos, por qu no se reproducen cuando se encuentran en la gndola del supermercado? (relacionar con la respuesta a la pregunta anterior) Rta. Para reproducirse, los hongos como todo ser vivo, requiere de las
condiciones adecuadas de nutrientes, temperatura, agua, oxgeno, etc. En la gndola del supermercado no tienen estas condiciones y, por lo tanto, detienen su reproduccin.

Actividad 4. Lectura y anlisis de un artculo

EDICIN N 98
Logran que clulas vegetales puedan vivir atrapadas en vidrio

Publicado el : 03/11/2005 en Novedades de Argentina, sitio Por Qu Biotecnologa http://www.porquebiotecnologia.com.ar/doc/reportes/result_indiv.asp?Id=2677

incluso se reproducen; la tcnica podra tener aplicaciones farmacolgicas. La unin de un compuesto biolgico con un material inerte como el metal o la cermica no es una novedad. De hecho, ciertos dispositivos para medir la glucemia en sangre se basan en este desarrollo. Lo que s es novedoso es que las clulas puedan dividirse (reproducirse) en esa situacin de inmovilidad que les confiere el material inorgnico. Pero un equipo de investigadores argentinos logr precisamente eso: que grupos de clulas vegetales, atrapadas dentro de un vidrio, pudieran no slo reproducirse, sino tambin, lo que es ms importante, fabricar protenas. El propsito es obtener productos de inters farmacolgico, como la insulina o distintos factores de crecimiento. "El problema fue lograr que las clulas pudieran vivir, multiplicarse y producir metabolitos de inters", seala la doctora Sara Aldabe Bilmes, profesora en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA e investigadora del Conicet. La clave est en las caractersticas del material, cuya porosidad debe permitir que las clulas reciban los nutrientes necesarios para vivir y que, a su vez, puedan salir los compuestos generados por ellas. "La importancia de que las clulas puedan vivir y multiplicarse reside en que algunos productos de inters biotecnolgico slo se generan a partir de clulas en pleno crecimiento", subraya. Pero cul es el objetivo de enjaular clulas en una matriz cermica? Una ventaja es que este mtodo impide la contaminacin con virus o bacterias, lo cual -segn la investigadora- no es poca cosa cuando se trata de clulas vegetales, de metabolismo lento, que tardan meses en crecer y ser productivas, lo que implica esfuerzo y dinero. Tambin permite una rpida y fcil separacin de las clulas del medio de cultivo (no es necesario filtrarlas, por ejemplo). "Trabajamos con bacterias, levaduras, algas unicelulares y clulas vegetales, por ejemplo de zanahoria y tabaco. En todos los casos vemos que las clulas se dividen y crecen y les llegan los nutrientes y el oxgeno", explica Mercedes Perullini, primera autora del trabajo que acaba de publicarse en la American Chemical Society. Por su parte, Aldabe Bilmes destaca que "lo importante en este trabajo es la confluencia de especialidades, algo poco frecuente en la ciencia argentina: un grupo de biotecnologa, que sabe manejar clulas vegetales (dirigido por el doctor Alejandro Mentaberry, profesor en la Fceyn e investigador del Conicet), y un grupo de qumica inorgnica, con experiencia en sntesis". Este ltimo, dirigido por Aldabe Bilmes, est conformado por Mercedes Perullini y el doctor Matas Jobbagy. En la actualidad, la biotecnologa ofrece distintas alternativas a la hora de obtener compuestos de inters farmacolgico. Una de ellas es hacer "trabajar" a las bacterias en tambores de fermentacin para que realicen su actividad metablica. Por lo general se les coloca un gen forneo, en muchos casos humano, para que fabriquen una protena en particular. Otra posibilidad es que la usina de produccin sea un mamfero, por ejemplo la cabra o la vaca, al que se inserta el gen apropiado para que produzca la protena y sta pueda extraerse a partir de su leche. Sin embargo, las tendencias ms novedosas se inclinan por las clulas vegetales como fbrica potencial de diferentes compuestos. Para atrapar las clulas, los investigadores fabrican en el laboratorio un tipo de vidrio, pero no el que se emplea para fabricar botellas. Se trata de un material cermico transparente que se sintetiza a temperatura ambiente a partir de pequeas partculas de dixido de silicio (arena) junto con ciertos agentes orgnicos que permiten la formacin de polmeros; es decir, molculas de gran tamao. Es como una gelatina, pero se endurece sin necesidad de heladera. El material debe tener poros del tamao justo para permitir que lleguen los nutrientes y se difundan los metabolitos al medio de cultivo. Pero esos poros no deben permitir la entrada de bacterias u otro tipo de contaminantes. Las clulas son inmovilizadas primero en una matriz orgnica y luego alrededor de ella se sintetiza el vidrio. "Hay que trabajar muy rpido, porque la sntesis tarda unos pocos minutos", comenta Perullini. Luego, esa matriz, que tiene dos centmetros de dimetro por un centmetro de espesor, se introduce en el medio de cultivo. La biloga Mercedes Rivero, investigadora del Laboratorio de Agrobiotecnologa de la Fceyn, precisa: "Lo interesante es que las matrices permiten conformar mdulos que se pueden apilar, y si alguna unidad tiene un problema o se contamina puede descartarse sin afectar el resto de las unidades. Y pueden agregarse nuevos mdulos con clulas nuevas o ms activas". Incluso se podran combinar mdulos con distintas cepas que produjeran distintos metabolitos. El hecho de que las clulas sean capaces de multiplicarse en el interior de la matriz es fundamental para que puedan producir los compuestos de inters, porque las clulas vegetales slo cuando estn en comunidad pueden producir metabolitos secundarios, aquellos con accin antibacteriana, o factores de crecimiento, por ejemplo. Si bien resta todava mucho trabajo para producir compuestos farmacolgicos en estas matrices cermicas, el hecho de haber logrado que las clulas vivan y crezcan en su crcel de vidrio representa un paso importante, sobre todo si se considera que las clulas vegetales son muy sensibles.

EDICIN N 98
Responder las siguientes preguntas: Cul es el hecho de relevancia en el artculo? b) Qu ventajas tiene el desarrollo desde un punto de vista productivo? c) Con qu clulas vegetales ensayaron la inmovilizacin? d) Qu tipo de cultivos (cultivos primarios o lneas celulares) convendra utilizar para la inmovilizacin? Por qu?
Respuestas a) la importancia del descubrimiento radica en que, una vez inmobilizadas clulas vegetales en una matriz inorgnica, las mismas puedan vivir, dividirse y producir metabolitos que se liberan al medio de cultivo. b) Las ventajas son que las clulas estn inmersas en una matriz cuyos poros son del tamao exacto para dejar salir los productos celulares de inters productivo, pero no lo suficientemente grandes para dejar entrar patgenos que puedan contaminarlas. Esto es particularmente importante en clulas vegetales que son muy sensibles. Otra ventaja es que los mdulos se pueden apilar, y si alguna unidad tiene un problema o se contamina puede descartarse sin afectar el resto de las unidades. Y pueden agregarse nuevos mdulos con clulas nuevas o ms activas. Adems, al estar inmovilizadas, los cambios del medio de cultivo se pueden realizar con mayor facilidad c) Se ensay con clulas de zanahoria y tabaco. d) Si se utilizan cultivos primarios, la inmovilizacin debe ser ms frecuente, teniendo que preparar clulas frescas reiteradamente, convirtiendo al procedimiento en poco practicable industrialmente. La opcin ms adecuada sera emplear lneas celulares (de tabaco, por ejemplo) que tienen una vida en cultivo ms larga. Pero, la eleccin depender de varios factores, entre ellos, de la disponibilidad de lneas celulares del cultivo de inters, de la capacidad de las matrices, y de la capacidad de las lneas celulares de producir el compuesto de inters de igual forma que el cultivo primario (aunque si se trata de un transgn que dirige la sntesis de una protena de inters, entonces la eleccin podra ser ms sencilla).

a)