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Sommaire
I. II.
III.
Soxhlet .................................................................................................. 1
IV. V. VI.
Planning prvisionnel de la semaine dexprimentation........ 1 Matriel, produits, cot .............................................................. 1 Bibliographie et rseau graphie ................................................ 1
Introduction
Un projet de cration dun nouveau carburant, appele le biothanol fus mis en place pour une dure de 5 ans pour esprer obtenir du biocarburant partir de la micro algue Chlorella vulgaris.
Chlorella vulgaris est une espce dalgue verte unicellulaire microscopique depuis
2 milliards dannes. Grace la photosynthse, elle se reproduit trs rapidement en eau tempre dans des rgions o lensoleillement est important et les tempratures assez douces. Une cellule mre se divise en 4 cellules fille de 16 20 heures. Avec un diamtre cellulaire denviron 5micrometre, cette micro algues sphriques aux dimensions est comparable aux globules rouges. La Chlorella contient de grandes quantits de chlorophylles, dacides amins, dacides nucliques, denzymes, de lipides, de vitamines, de fibres et de minraux. Les lipides synthtiss par Chlorella vulgaris (10 15 % de matire sche) se composent de plus de 80 % dacides gras insaturs avec en majorit lacide alphalinolnique, jusquas plus de 30 %. Dans un premier temps, il faut dterminer les conditions optimales de la culture en quantit de lumire, la quantit de CO2, ainsi que lon ajuste la concentration en nitrates de potassium qui provoquera un stress et apporteras aller la formation de lipides. Des que ses conditions optimales seront atteintes, on pourra alors commencer une extraction optimales. La dtermination de la teneur en triglycrides peut tre effectue par diffrentes mthodes qui sont : Extraction de Soxhlet : elle se fait en plusieurs cycles qui se rptent indfiniment, elle permet de faire lextraction par solvant continue dune espce chimique contenue dans une poudre solide. (dichloromethanemethanol extraction) Mthode de Folch : consiste transfrer les acides gras de la micro algue dans une phase organique. Extraction Goldfisch : (hexane extraction) Hot extraction : mme que soxhlet mais plus rapides 3
Aprs diverses recherches, les mthodes les plus utilises sont soxhlet et la mthode de folch. Nous allons alors utilise dans notre dmarche la mthode de soxhlet pour alors extraire les lipides de notre micro algue. On passe notre chantillon obtenu aprs lextraction lvaporation rotative pour liminer lhexane. Par la suite, pour vrifier si lextraction se ralisa totalement, cest--dire que notre chantillon ne contient que des triglycrides, on fait une analyse des acides gras par chromatographie en phase gazeuse aprs saponification des glycrides et conversion des savons en esters mthyliques volatils. Les rsultats sont, par convention, exprims en % des acides gras totaux. Ils peuvent aussi tre exprims en % de lchantillon moyennant lutilisation dun talonnage interne. Une quantification sera effectue lorsque les rendements seront alors corrects. Notre projet se porte sur la dtermination en triglycrides dans Chlorella vulgaris, do notre problmatique : Extraction et dtermination du taux des TAG parmi tous les lipides compris dans les micros algues.
Synopsis
Centrifugation Elimination surnageant
Extraction Cyclohexane
Saponification KOH/Ethanol
Lavage l'eau
Materiel et protocoles
Ses manipulations devront se faire plusieurs fois pour confirmer les rsultats avec plusieurs peses diffrentes A. Principe Prparation de la micro algue
B.
1.
Soxhlet
Principe La mthode de soxhlet est la mthode la plus utilise pour la dtermination de la teneur en matires grasses. Cest une mthode gravimtrique, puisquon pse lchantillon au dbut et la matire grasse la fin de lextraction.
Matriel et ractifs Extracteur Soxhlet Cartouche de cellulose Hexane (Gants et lunettes) Pinces Micro algues Balance Filtres Mode opratoire On cherche dans un premier temps extraire les lipides des micros algues. Il faut alors : On pse la masse de micro algues schs ou humides On ajoute ses micros algues la cartouche de cellulose On met la cartouche de cellulose dans lextracteur de soxhlet, on las coince dans le contour mtallique du support On recouvre dhexane la cartouche de cellulose On effectue lextraction suivant un programme dfinis Lextraction est faite chaud ou lchantillon est immerg dans le solvant chaud et les matires grasses sont libres de lchantillon. Un quilibre se forme entre lextrait en solution et celui la surface de lchantillon. La cartouche est rince par le solvant, vapor et recondens
Programmation de soxhlet :
Trempage : Lchantillon est immerg dans le solvant qui chauffe et les matires grasses sont extraites de lchantillon vers le solvant en bullition. Cette tape dure 40 min.
Extraction : La cartouche est rince par le solvant vapore et recondens. Cette tape dure 1heure.
2. Evaporation rotative
Principe L'vaporateur rotatif utilise une technique rapide et efficace de sparation : elle permet l'extraction d'un solvant dont la temprature d'bullition est abaisse en travaillant sous pression rduite.
Matriel et ractifs Evaporateur rotative Solution dhexane prcdemment extrait contenant les lipides extraits Tuyaux en caoutchouc Ballon deau
Mode opratoire Mettre lchantillon dans le ballon Ajouter de leau dans le chauffe-ballon Chauffer la temprature dbullition de lhexane (69 C) Faire aller la pompe membrane pour fournir de la pression Mis en marche de lappareil On rcupre lhexane dans le ballon de rcupration Pese de la masse de lipides obtenus Arrt de lappareil : o Casser le vide o Couper laspiration o Arrter la rotation. Reprendre les lipides dans 1mL dhexane Extraction de solvants volatils qui peuvent tre toxiques, travail sous Sorbonne Risque d'implosion car le systme est sous pression rduite 9
3. Saponification
Principe La saponification est une mthode de sparation, aux cours de celle-ci les triglycrides sont hydrolyss en milieu alcalin par une base, gnralement de la potasse (KOH) ou de la soude (NaOH), une temprature comprise entre 80 C et 100 C. La temprature leve sert acclrer la raction de saponification. Puis une mthylation est alors ncessaire pour mthyls les acides gras obtenus au parant qui pourront alors tre pass la CPG.
Matriel et ractifs Bain-marie Colonne distiller KOH Bcher de 250mL Soude Mthanol
Mode opratoire
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C.
1.
Principe La chromatographie phase gazeuse est une technique qui permet didentifier ou sparer les molcules dun mlange. Le mlange analyser est vaporis l'entre d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appele phase stationnaire, puis il est transport travers celle-ci l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les diffrentes molcules du mlange vont se sparer et sortir de la colonne les unes aprs les autres aprs un certain laps de temps qui est fonction de l'affinit de la phase stationnaire avec ces molcules. Matriel et ractifs Appareil de chromatographie en phase gazeuse, volume d'injection : 18 L Logiciel : chromcard Micro pipettes Tubes ferms hermtiquement en verre Bombonne d'azote Hexane 7% de tri-fluorure de bore dans le mthanol (BF3) Mthanol FAME Mode opratoire Ajouter lchantillon 1mL de tri-fluorore de bore 7 % dans le mthanol Centrifuger Rcuprer la phase organique dans 1mL dhexane Faire un premier lavage en vaporant lhexane sous courant dazote 11
Remettre en solution les esters dacides gras mthyls dans un millilitre dhexane. Passer lchantillon lanalyse avec la CPG Conclure sur les rsultats
D.
Cependant, le rendement de cette manipulation nest pas trs haut, il faut alors le vrifi en faisant sur plusieurs pese diffrentes et sur diffrents schages.
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