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Tema 19. Anticuerpos Monoclonales y Policlonales. Produccin y Purificacin.

Aplicaciones

Concepto de suero policlonal y monoclonal Cuando se inocula un antgeno (o penetra un patgeno) se produce una respuesta de anticuerpos frente a cada uno de los determinantes antignicos (epitopos) del antgeno. Todos los anticuerpos se producen de forma simultnea, todos reaccionan con el antgeno, pero solo con un determinante concreto. Esto es lo que se produce en la respuesta inmune normal, y a esta mezcla de anticuerpos es a la que se denomina suero Policlonal, porque procede de varios linfocitos B que se expandieron (tras reconocer al antgeno) produciendo cada uno un clon celular. En cambio si la inoculacin o inmunizacin la realizsemos con un antgeno que contuviese un nico epitopo, solo se activara un clon celular y se producira un nico anticuerpo. A un suero que tuviese estas caractersticas se le denomina suero monoclonal. Esta situacin, no se produce en condiciones normales, pero en determinadas condiciones patolgicas aparecen neoplasias de clulas B y de los plasmocitos derivados de ellas (Mieloma mltiple). Como son clulas productoras de anticuerpos, estos se acumulan en la sangre en grandes cantidades. Como ocurre en todos los procesos tumorales el origen est en una clula que se maligniza y se multiplica de forma autnoma e independiente de los sistemas de regulacin del organismo, lo que es lo mismo que decir que todas las clulas del mieloma proceden de una misma clula y, por tanto, producen el mismo anticuerpo. Aunque existen mielomas de cada una de las cinco clases de inmunoglobulinas los ms frecuentes producen los isotipos IgA e IgG. Produccin de anticuerpos A partir de un suero policlonal se puede obtener un suero especifico para el antgeno mediante aislamiento y purificacin. Si bien los anticuerpos obtenidos, todos ellos especificos para el antgeno, variaran en su afinidad para el mismo al proceder de distintos clones. Este seria un suero, por tanto, policlonal. La Tcnica bsicamente consiste en efectuar una cromatografa de afinidad en columna. En esta tcnica se une el mismo antgeno que se utiliz para la inoculacin a unas bolitas especialmente preparadas para que lo capturen. Una vez recubiertas por el antgeno se empaquetan las bolitas en un tubo fino (se le llama columna) y se hace pasar por el al suero que se desea purificar. Los anticuerpos especficos para el antgeno retenido sobre las bolitas se unen a el y el resto de los anticuerpos y protenas del suero sale por la parte inferior. El paso final es la ruptura de las uniones entre antgeno y anticuerpos (cosa que se hace aadiendo a la columna una solucin hipertnica u otra con pH cido, con lo que los anticuerpos especficos se eluyen (salen) por la parte inferior. Obtencin de anticuerpos monoclonales En 1975 Kohler y Milstein desarrollaron la tcnica de los hibridomas, mediante la que pueden producirse en el laboratorio anticuerpos monoclonales especficos para un antgeno

(determinante antignico) concreto. La tcnica se desarroll inicialmente utilizando clulas de ratn, pero en la actualidad se producen hibridomas a partir de clulas de varias especies, incluyendo la humana. Fusin. La tcnica consiste bsicamente en fusionar clulas linfoides (productoras de anticuerpos) con clulas de mieloma (tumorales) en presencia de poli-etilen-glicol (PEG), que provoca la fusin de las membranas y la formacin de hbridos celulares. Las clulas productoras del anticuerpo se obtienen a partir de los rganos linfoides perifricos (bazo y/o ganglios linfticos) de animales hiper-inmunizados con un antgeno o patgeno concreto. Las clulas de mieloma a utilizar deben reunir, al menos, las siguientes caractersticas: Ser histocompatibles con las clulas productoras de anticuerpos No secretar inmunoglobulinas No tener la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT) Los hbridos resultantes pueden ser de cualquier tipo: Linfocito-Linfocito, Linfocito-Mieloma o Mieloma-Mieloma. Los que conocemos como Hibridomas son los hbridos LinfocitoMieloma. Seleccin Los hibridomas se recuperan cultivando la mezcla celular anterior en un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina. La aminopterina es un inhibidor del cido flico, sustancia que interviene en la sntesis de los nuclesidos y nucletidos necesarios para la replicacin del DNA. En este medio (y en cualquiera que se use) los hbridos LB-LB y los LB no fusionados mueren, ya que tienen una vida media limitada. Los hbridos M-M y las clulas de mieloma no fusionadas mueren por carecer de la enzima HGPRT. La clulas que sobreviven son los hibridomas LB-M, que heredan la capacidad de vivir indefinidamente y la alta capacidad biosinttica propias de la clula tumoral y la capacidad de producir anticuerpos y sintetizar guanina va HGPRT de los linfocitos B. HGPRT participa en la llamada va de salvamento, mediante la cual una clula puede usar la hipoxantina como precursor de otras bases nitrogenadas aun en presencia de aminopterina . Como en la fusin se usan clulas linfoides procedentes de un animal hiper-inmunizado, una parte de los hibridomas obtenidos son productores de anticuerpos y cada hibridoma produce un solo anticuerpo (monoclonal). Tras la seleccin en medio HAT las clulas supervivientes se reparten en los pocillos de placas de cultivo (rico en nutrientes e idneo para la proliferacin celular) y se incuban para que se produzca su crecimiento. En aquellos pocillos que presentan un crecimiento adecuado se recogen muestras del sobrenadante y se analizan en ELISA para ver si contienen anticuerpos especficos para el antgeno inicial (con el que se hiper-inmuniz inicialmente al animal utilizado). La clulas de los pocillos positivos se recuperan y, mediante un proceso de dilucin lmite o clonacin, se reaparten en los pocillos de nuevas placas a 1 clula por pocillo. Los pocillos que producen buenos clones se muestrean en busca de los anticuerpos y, los positivos, se vuelven a cionar. Mantenimiento Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden en recipientes de cultivo de mayor capacidad y se recogen las clulas por centrifugacin, se suspenden en medio de cultivo

suplementado con suero fetal de ternera y dimetil-sulfxido (DMSO) para congelarlas, primero a -70C y luego en nitrgeno lquido. La produccin del anticuerpo monoclonal se hace a partir del sobrenadante de cultivos en masa o tras la inoculacin intraperitoneal del hibridoma en animales histocompatibles. En este ltimo caso se produce un tumor que produce anticuerpos en esa localizacin acompaado de ascitis (acumulacin de lquido en el peritoneo) y en el liquido asctico (que se recupera por puncin) hay una gran concentracin de anticuerpos. En ambos casos los anticuerpos monoclonales se separan y purifican por los mtodos convencionales. Aunque son susceptibles de mutar, los hibridomas mantienen sus caractersticas durante muchas generaciones. Aplicaciones. Estos anticuerpos monoclonales (mAb) han permitido identificar y purificar gran nmero de marcadores celulares tales como los CD, receptores de citoquinas, etc. Tambin se usan en investigacin como herramientas para identificar y aislar molculas, en las pruebas inmunolgicas de diagnstico en el laboratorio clnico, como vehculos para el transporte de drogas y radio-istopos, etc. Pero quizs su aplicacin mas prometedora es en el campo de la terapetica. As ya se han desarrollado algunos contra enfermedades como el cancer de colon, de mama, contra el linfoma no Hodgkin y otras leucemias y enfermedades como artritis, enfermedad de Crohn, asma..etc En este ltimo apartado, Cuando se comenzaron a dar los primeros pasos en este campo cundi un optimismo ilimitado, ya que se pensaba que podran utilizarse, por ejemplo para el cancer a modo de misiles teledirigidos, portadores de txicos o istopos radiactivos que podran orientarse contra las clulas tumorales y depositar su carga letal, eliminando las clulas cancerosas y dejando intactas las normales. As hay en el mercado una decena de anticuerpos monoclonales. Cubren desde la prevencin del rechazo de un rgano trasplantado hasta la oncoterapia. Pero la realidad mostro que las cosas son ms difciles. Los anticuerpos monoclonales son protenas del sistema inmunitario muy puras que atacan dianas moleculares especficas. Para su infortunio, los individuos que recibieron la primera hornada de anticuerpos monoclonales con fines teraputicos tendan a desarrollar sus propios anticuerpos contra los anticuerpos inyectados. Eso hizo que, por causas que no acabamos de conocer, progresaran an ms en su patologa. El hgado secuestraba tales anticuerpos monoclonales y los eliminaba antes de que pudieran alcanzar sus objetivos. Este fracaso hizo pasar del optimismo al desanimo a las empresas y laboratorios que apostaron por este mtodo. Esto era debido fundamentalmente a que tales anticuerpos eran de origen murino y eran reconocidos como extraos por el sistema inmunitario humano, produciendose, por tanto la respuesta frente a ellos. No obstante mas adelante se descubrieron vas para corregir las deficiencias de los primeros frmacos surgiendo los anticuerpos quimricos y humanizados. Anticuerpos quimricos

Estos Ac son molculas artificiales en la cual, las porciones constantes de las cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables VE y VE son obtenidas de un AcMo murino. El objetivo perseguido con la construccin de un AcQ es reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratn o rata, pero sin afectar la especificidad del Ac. Estos anticuerpos presentaban un 70% de componente humano y un 30% era de origen murino, por lo que a pesar de ser menos inmunognicos que los denominados anticuerpos monoclonales de primera generacin seguan presentando problemas de inmunogeneicidad. Por ello se recurrio a los denominados: Anticuerpos humanizados Estos solo tienen de ratn los genes que entran en contacto con el antgeno. El 90 por ciento del anticuerpo es as de origen humano, por lo que al ser inyectado en los pacientes no se produce respuesta del S.I. En teora solo llevan del ratn el paratopo de unin al antgeno. El argumento que la soporta se basa en el supuesto de que el sitio de combinacin al antgeno, el paratopo, se forma a partir de la combinacin espacial de las asas hipervariables y que el resto de la regin variable (regan denominada M) slo funcionan como un andamio cuya nica funcin es servir de soporte estructural al paratopo. De esta manera en estos los epitopos asociados a las regiones M mridas, los cuales estn presentes en los AcQ no se encuentran en los AcH. Para producir un AcH es necesario, por tanto conocer la secuencia entera de los dominios V mridos y la localizacin de las secuencias de ADN correspondientes a las 3 RDC Hay dos aspectos que pudieran considerarse desventajosos en la produccin de un AcH. En primer lugar, la manipulacin de las RDC y su posterior insercin en el contexto de regiones M humanas, por lo general, conlleva a una disminucin de la afinidad del Ac. Ello se debe a que las regiones M no son slo andamios; ellas juegan un rol determinante en el arreglo tridimensional de las RDC El otro aspecto tiene que ver con la complejidad de la tcnica. Mientras que producir un AcQ es un procedimiento relativamente expedito, la creacin de un AcH es, comparativamente, ms laborioso, consume un tiempo considerable. En todo caso, el objetivo fundamental perseguido por la produccin de un AcH (eliminar la inmunogenicidad del Ac mrido) no siempre es alcanzado. Se ha reportado cierta inmunogenicidad "residual" en molculas de Ac completamente humanizadas, ello debido, aparentemente, a epitopos asociados con el idiotipo del Ac Anticuerpos bifuncionales. Ahora es posible construir anticuerpos con sitios de combinacin diferentes que pueden, por tanto, reconocer simultneamente a dos antgenos. Son producidos artificialmente al cruzar dos anticuerpos, uno dirigido contra el antgeno de superficie de la clula tumoral y el otro contra una molcula estimuladora de la clula efectora (complejo clula T receptora). Frmacos desarrollados

Al mercado han llegado ya una decena de anticuerpos monoclonales. Tres ms esperan una pronta aprobacin por la norteamericana Oficina de Alimentacin y Farmacia (FDA). Dos estarn equipados para llevar una dosis de radiactividad. Hay un centenar largo en fase de ensayo en humanos, superadas con xito las pruebas en animales. Siendo en la actualidad un campo en expansin. En este sentido la empresa Genentech esta desarrollando, hasta ahora con xito, aunque an no esta en el mercado unos anticuerpos monoclonales contra el asma (Xolair). Estos eliminan los anticuerpos que desempean una funcin clave en el asma y las alergias. As las cosas, y tomados en su conjunto, los nuevos tipos de anticuerpos monoclonales ofrecen ptimas perspectivas ante una serie de enfermedades

Eleccin entre anticuerpos monoclonales y policlonales Paradjicamente, los anticuerpos policlonales a veces proporcionan mayor especificidad que los monoclonales frente al mismo antgeno. sto es porque las reacciones cruzadas no deseadas se pueden eliminar de un suero policlonal mediante absorcin con el antgeno causante de la interferencia, mientras que las reacciones cruzadas no buscadas no se pueden eliminar de un anticuerpo monoclonal porque tiene una nica especificidad. La especificidad de los anticuerpos policlonales se pueden mejorar tambin mediante cromatografa de afinidad utilizando antgenos purificados. Fragmentos de anticuerpos A veces se desea evitar las funciones efectoras de los anticuerpos mediadas por Fc, tales como uniones a receptores Fc cuando se pretende detectar antgenos de superficie. Esto se puede evitar digiriendo el anticuerpo con enzimas proteolticas. El tratamiento con pepsina produce fragmentos F(ab')2 que se pueden separar de los Fc y del anticuerpo no digerido usando cromatografa con protena A- o protena G-Sepharose. Alternativamente, la digestin con papana genera fragmentos Fab monovalentes. Equilibrio antgeno-anticuerpo Aunque la unin del anticuerpo al antgeno se puede detectar en segundos, el equilibrio normalmente no se alcanza hasta que no pasan varias horas de la adicin del anticuerpo al antgeno. Para muchos ensayos, las incubaciones de 1-2 horas producen la mxima unin. El rendimiento se ve afectado por la temperatura y por eso se pueden hacer incubaciones ms cortas a 37C mientras que las incubaciones largas (por ejemplo toda la noche) se harn a 4C. El trmino temperatura ambiente que se emplea en muchas tcnicas se refiere a una temperatura de aproximadamente 20C. Titulacin de anticuerpos El ttulo de un anticuerpo se refiere a la mnima concentracin (mayor dilucin) de anticuerpo que resulta todava eficaz en un ensayo, por ejemplo la aglutinacin. Los anticuerpos deben titularse antes de utilizarlos en un inmunoensayo porque usar una concentracin muy grande es un desperdicio, puede dar seales inespecficas y puede ser

poco sensible en ensayos de inhibicin. Por otro lado, una concentracin demasiado baja obviamente produce una prdida de sensibilidad. Si se dispone de ms de un anticuerpo monoclonal frente a un antgeno de inters, es conveniente determinar si todos reconocen el mismo o diferentes epitopos del antgeno.

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