Introduccin a la biologa celular y molecular

Extraccin, cuantificacin, electroforesis en SDS PAGE de protenas y Western blot

Alumnas : Denis Vernica Ortegas Vernica Vargas Paola Instructores : Rubio Fernanda Romanauski Andres

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Resumen
En el presente trabajo prctico se extrajeron protenas a partir de una muestra de tejdo de hgado de ratn por medio de la aplicacin de un buffer de homogeneizacin ( para degradar los lmites celulares y obtener el extracto crudo) y la separacin de las protenas de los restos celulares a traves de sucesivas centrifugaciones. Se estim la concentracin de protenas obtenidas utilizando una curva de calibracin hecha a partir de dilusiones de una protena de concentracin conocida (BSA). A estas protenas se las separ mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Antes de eso se agreg un detergente para desnaturalizarlas y para que obtengan todas la misma carga neta. Entonces la separacin de las protenas solo se debi al peso molecular de las mismas sin influir la conformacin ni la carga de cada una de ellas. En el gel obtenido, teido con el colorante coomasie blue solo se pudieron identificar algunas manchas, por lo cual solo se calcul el peso molecular de dichas manchas. Por otro lado, se utiliz la tecnica de Westernblot para identificar los niveles de la protena inmunoglobulina (IgG) antiHA. Para ello, se utilizaron anticuerpos secundarios que reconocen la secuancia de 50KD de las protenas transferidas a una membrana de nitrocelulosa y un colorante (luminol) el cual permiti revelar en placas radiogrficas las bandas correspondientes a la secuencia de 50KD.

Introduccin
Antes de realizar un extracto de protenas es importante tener en cuenta la fuente de la protena deseada (tejido animal, vegetal o cultivo celular) y la finalidad del extracto para determinar el buffer de extraccin, dependiendo de si se quiere o no que las protenas conserven determinadas caractersticas biolgicas. Ambos detalles permiten programar el protocolo a utilizarse. Preparacin del extracto crudo Una vez que la fuente de las protenas ha sido seleccionada, el paso que sigue es la extraccin de las mismas. 1. A partir de un cultivo celular: La extraccin puede realizarse adicionando un detergente, ocasionando un shock trmico. 2. Cuando se trata de una muestra de tejido: Se debe homogeneizar el tejido y destruir sus lmites celulares mediante el uso de qumicos que retienen las protenas en solucin (extracto crudo) o con mtodos mecnicos.

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Para formar un homogeneizado, se debe romper las membranas celulares, fraccionndose las clulas de los tejidos. Se puede utilizar la centrifugacin diferencial para obtener fraccionamientos subcelulares o aislar organelas especficas. En esta tcnica, las molculas ms pesadas o ms densas sedimentan con mayor rapidez que las livianas o menos densas. Durante todo el proceso se debe procurar que las protenas se preserven intactas, lo que implica trabajar con las muestras en hielo para inhibir la accin de las proteasas. Cuantificacin de las muestras mediante ensayos colorimtricos Los ensayos colorimtricos involucran la adicin de un reactivo qumico capaz de reaccionar con determinados residuos aminoacdicos. Como resultado de estas reacciones, la solucin cambia de color y se puede medir utilizando un espectrofotmetro. Los mtodos colorimtricos ms usados son:

1. Ensayo de Lowry (750 nm): Es rpido, sencillo y relativamente sensible. Es

afectado por un amplio rango de compuestos no proteicos como EDTA, sulfato de amonio y B-mercaptoetanol, pero existen variables que pueden realizarse para evitar estas interferencias.

2. Ensayo de Bradford (595nm): Es doblemente sensible que el ensayo anterior.

Es un mtodo rpido y muy sencillo y adems, no presenta interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el B-mercaptoetanol. La desventaja es que es altamente sensible a detergentes y lpidos.

3. BCA (Bicinchoninine acid assay 562nm): Es compatible con detergentes.

Mucho ms sensible que el ensayo de Lowry. Los complejos coloreados son muy estables pero es suscepible a interferencias. Para determinar la concentracin de protenas se construye una curva de calibracin con los resultados de absorbancia de una protena standard de concentracin conocida (generalmente BSA, albmina srica bovina) y se interpolan los resultados de absorbancia obtenidos de las muestras incgnitas. Como se trabajan con datos reales, los grficos que se obtienen no son tan ideales. Por eso, al realizar la curva de calibracin se suelen eliminar los valores que no forman parte de la serie de puntos que forman una recta.

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Como las protenas absorben a 280 nm y a bajas concentraciones de manera proporcional con su concentracin, puede construirse una curva de calibracin que represente la absorbancia vs. concentracin, para determinar la concentracin de protenas totales en la muestra, analizando los resultados de absorbancia e interpolando a una curva de calibracin de una protena estndar de concentracin conocida. Electroforesis en gel de agarosa SDS-PAGE Los pesos moleculares de las protenas se pueden estimar si son sometidas a electroforesis en presencia de un detergente (SDS) y de un agente reductor (Mercaptoetanol y DTT). Cuando la protena es tratada con SDS, el detergente desbarata las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria para producir cadenas lineales de polipptidos cubiertas de la carga negativa de las molculas del SDS. La presencia del mercaptoetanol ayuda a la desnaturalizacin, reduciendo todos los puentes disulfuro. El detergente se une a las regiones hidrofbicas de las cadenas de protenas desnaturalizadas en un radio constante de 1.4 g. de SDS por gramo de protena. Las cargas negativas del detergente esconden la carga natural de las protenas. Entonces se forman cadenas polipeptdicas de forma constante. La movilidad electrofortica del complejo SDS-protena est influenciada principalmente por el tamao de las molculas: aquellas ms grandes son retenidas por el gel (efecto de colador), teniendo mayor movilidad las molculas ms pequeas. Despus de la electroforesis, las protenas se pueden visualizar en el gel tiindolas con plata o con un colorante como el azul de Coomassie, que revelan una serie de bandas. La movilidad electrofortica de muchas protenas en geles de SDS-poliacrilamida es inversamente proporcional al logritmo de su masa: por lo que, la movilidad es medida y los pesos moleculares son determinados graficamente. La electroforesis en gel de poliacrilamida en SDS es rpida, sensible y tiene alto poder de resolucin. Al ser muy sensible, puede ser afectada por muchos errores experimentales: Temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel: La viscosidad del agua aumenta a bajas temperaturas, afectando la movilidad de las protenas. Este efecto puede atenuarse manteniendo baja la temperatura durante la electroforesis.

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Velocidad de polimerizacin: Una polimerizacin muy rpida puede llevar a una contraccin no uniforme del gel, deformando las bandas. Por ello, se reduce la cantidad de TEMED y de persulfato de amonio, con el objetivo de hacerla ms lenta. Pureza de los reactivos: Para tener geles de alta resolucin es indispensable utilizar reactivos de alta calidad y agua desionizada. Tiempo de corrida: Cuando el tiempo de corrida es muy corto, los polipptidos no avanzan la distancia necesar banda. Preparacin de las muestras: Para evitar errores en las bandas es necesario lograr una completa desnaturalizacin de las protenas. Tincin: Para evitar la elusin de las protenas pequeas son esenciales una rpida tincin, destincin y fijacin de las mismas. WESTERN BLOT para su correcta separacin, aunque una corrida relativamente rpida minimiza la dispercin de la muestra y el ensanchamiento de la

La inmunoelectrotransferencia se usa para idenificar la presencia de una

protena dada en un lisado de clulas.

A clulas no marcadas se las coloca en detergente para solubilizar todas las

protenas celulares y el lisado se corre sobre SDS-PAGE para separar las protenas.

A continuacin, las protenas separadas segn su tamao se transfieren desde

el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (soporte ms estable).

Luego se trata a las protenas con anticuerpos que pueden reaccionar con
protenas desnaturalizadas y solubilizadas con SDS.

Los anticuerpos unidos se revelan por medio de anticuerpos contra

inmunoglobulina marcados con radioistopos o una enzima. La electroransferencia Western tiene muchas aplicaciones en investigacin bsica y en el diagnstico clnico. A menudo se usan para analizar sueros para buscar la presencia de anticuerpos contra protenas especficas, por ejemplo para detectar anticuerpos contra distintos constituyentes del virus de la inmunodeficiencia humana, VIH.

Materiales y procedimientos:
Se siguieron los pasos descriptos en la gua de trabajos prcticos de Introduccin a la biologa celular y molecular.

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Resultados y Discusiones:
En la siguiente tabla se muestran los valores de absorbancia de las distintas concentraciones de la muestra (se rest el promedio de los dos blancos) y la desviacin estndar de cada uno de los puntos de la curva con respecto al promedio de los duplicados:

Absorbancia (595 nm) 0.0005 0.0055 0.3775 0.237 0.0035 0.4145 0.494 0.545 0.806 0.957

Concentracin (ug/ul) 0 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5

Desviacines estndar 0.0035 0.00070 0.0601 0.0452 0.00919 0.0162 0.0056 0.1781 0.0070 0.0056

Curva de calibracin hecha con los valores de la tabla para lograr una ecuacin que relaciona linealmente a las concentraciones de la protena conocida con las absorbancias de las mismas:

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A partir de la curva de calibracin se traz la recta de regresin correspondiente a la misma y r2 dio un valor no tan cercano a uno; por lo que, se considera que algunos de los puntos se desviaban bastante de la linelidad. Esto se puede ver tambin en las desviaciones estndar de dichos puntos (nombradas anteriormente). El punto cinco de la curva ( ubicado entre 0.2 y 0.3) da un valor de casi cero cuando debera dar un valor mayor al del punto anterior, adems en el momento de preparar la gradilla con las muestras se observ que el punto cinco no tena el color azul que se observaba en el resto de las muestras preparadas con el reactivo de Bradford por lo cual absorbi como si no estuviera la muestra, comparando este valor con el blanco obtenido. Seguramente en el momento de preparar la muestra n 5 se cometi algn error con la cantidad de Bradford o BSA, o directamente se omiti alguno de estos dos. Igualmente no se elimin ninguno de los puntos ya que no se cuenta con algn criterio para poder saber cual de los puntos son los que realmente corresponden con la concentracin de protenas y la absorbancia que se pretenda tener. Para el calculo de la concentracin de protena obtenida se utiliz la ecuacin resultante. Es decir que utilizando los valores de absorbancias de concentraciones conocidas de una protena se puede comparar la absorbancia de la muestra con ellas y as calcular la concentracin total de protenas obtenidas. Para calcular la concentracin de protenas obtenidas se utiliz la ecuacin resultante; es decir, se compararon los resultados de absorbancia obtenidos, con los de otra protena cuya concentracin es conocida. Esta ecuacin es calculada del promedio de las concentraciones y absorbancias de todos los grupos para que todos tengan el mismo error. Se calcul la concentracin necesaria de la muestra para obtener 80ug de protenas en la corrida electrofortica SDS-page a realizar.

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La intensidad de las bandas pueden ser utilizadas de forma analtica para comparar la cantidad de protenas en las distintas bandas, siempre y cuando se siembre la misma cantidad de protenas en todas las calles. Para ello se debi realizar una dilucin 1 en 7 porque la cantidad calculada previamente estaba en un volumen no pipeteable. El volumen calculado entonces es 10.5ul. (clculos en anexo). Corrida electrofortica: sds-page de las protenas extradas: El gel fue teido overnight con coomasie blue. Y se realizaron lavados con soluciones de metanol- actico-agua en una relacin 3-1-6, respectivamente. Sabiendo que el Ladder est en la calle nmero 1, se detallan a continuacin la fuente de las protenas extradas por los distintos grupos y su respectiva calle:

calle fuente grupo

2 bazo 2

3 corazn 3

4 pulmn 4

5 cerebro 1

6 rin 5

7 hgado 6

Ladder o marcador de peso molecular:

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Todas las calles se encuentran difusas y no se pueden diferenciar muy bien las bandas por algn tipo de error experimental o por la accin de las proteasas que son las enzimas que degradan las protenas. Las nicas calles que muestran bandas son la 2 y la 3. Calle 2: presenta dos bandas, una de 10 y otra de 15 kD. Calle 3: hay una banda de 10 kD. A partir de esto dado que el desplazamiento de las cadenas polipeptdicas es proporcional al logaritmo de la masa, se construy una curva de calibracin con los datos de distancia de migracin de un patrn de protenas de peso molecular conocido; y pudo estimarse, por extrapolacin, el peso molecular de las fracciones de protenas.
Rf 0,14 0,21 0,3 0,37 0,57 0,72 0,9 0,93 0,95 0,97 log PM (KDa) 2,39 2,18 2 1,87 1,7 1,57 1,4 1,3 1,17 1 PM (KDa) 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10

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Log PM vs. Rf
1,2 1 0,8 Rf 0,6 0,4 0,2 0 0 0,5 1 1,5 Log PM 2

y = -0,7116 x + 1,7858 R = 0,9537

2

2,5

Reemplazando el valor de Rf de la protena incgnita se obtiene: Rf Log PM (kDa) PM (kDa)

Membrana con la transferencia de las inmunoglobulinas. Gel teido con rojo ponceau. Se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa volumenes conocidos de la protena inmunoglobulina para ser utilizada en la tecnica de western blot. En la calle que contiene al ladder ( bandas azules) se pueden observar las diferentes bandas correspondientes a volmenes conocidos de la protena, pero en la otras calles las nicas bandas que se ven son las de aproximadamente 50 KD( bandas de color rosa fuerte). Las de 25KD no se ven en la imagen por que la misma fue escaneada luego de haber realizado un primer lavado y, como el ponceau es un colorante reversible algunas de las manchas se van. Antes del valado podan verse tenues bandas de aproximadamente 25KD. Esta tcnica de tincin se utiliza simplemente con el objetivo de verificar que efectivamente la protena fue trasferida a la membrana, por lo cual luego se lava varias veces para quitar el colorante y utilizar la membrana para realizar el western blot.

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Westernblot (revelado): En esta tcnica se utilizaron anticuerpos secundarios que reconocen la secuencia de 50KD de la protena inmunoglobulina (igG) antiHA. Como se sabe que la membrana tiene mucha afinidad por las protinas y que se puede producir un background, es decir, una unin inespecfica de los anticuerpos a la membrana ( lo que puedo dar falsos positivos) se utiliz un agente bloqueante. Este agente (leche en polvo en este caso) se une a la mambrana en los lugares donde no hay protenas evitando que los anticuerpos se peguen en esos lugares. La cantidad de bloqueante depende de lo especfico que sea el anticuerpo y debe lavarse el excedente para que no interceda en la unin de los anticuerpos. Al revelarse la membrana se pudieron observar las distintas bandas con intensidades diferentes que indican la presencia de las secuencias de 50KD de las protenas. La intensidad de las bandas dan una idea de la concentracin de las mismas, es decir que las bandas ms intensas son las de mayor concentracin. Puede verse en la imagen siguiente ( donde se encuentran las cuatro calles en la misma placa (sin cortar ) como va disminuyendo la intensidad a medida que disminuye la concentracin de la protena. En este caso puedo compararse por que el tiempo de exposicin de las calles fue el mismo. Sin embargo en las calles cortadas y reveladas individualmente no se puede realizar esta comparacin por que el tiempo de exposicin puede modificar la intensidad de las bandas.

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Conclusin
Las desviaciones en la extrapolacin de la curva de calibracin pudieron deberse a factores que no necesariamente alteran a la ley de Lambert Beer, sino que directamente afectan en la concentracin de la muestra (como otros equilibrios qumicos en disolucin).

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Igualmente el error obtenido en el clculo de la concentracin de la protena engloba, tambin, otros factores ajenos al grupo 6 ya que la ecuacin utilizada fue hecha con el promedio de las absorbancias de todos los grupos. Lo ideal es tener en cuenta que las protenas pueden estar formando complejos con otro tipo de molculas, o bien puede tener modificaciones postraduccionales, influyendo en el tamao de la misma y por lo tanto, en su peso molecular. Por lo que, los pesos moleculares obtenidos con la comparacin con el ladder pueden estar ms alejados del peso molecular real. Por ejemplo algunas protenas son glucosiladas luego de la traduccin y como el azcar no es teido por el colorante coomassie blue, el peso molecular calculado es menor que el real; ya que el mismo solo refleja el peso molecular de los residuos aminoacdicos. Los resultados obtenidos en la experiencia con coomassie blue no fueron reproducibles por algn error experimental. En el momento de realizar el homogeneizado es bueno considerar la accin de las proteasas en por eso que es recomendable ubicar las muestra en hielo. Esto podra haber evitado el chorreado que se gener y por el cual no se puedo efectuar la lectura de las bandas. Adems otro error pudo haber sido la deficiencia en la colocacin de las cantidades de los reactivos adecuados para la preparacin de la muestra a sembrar. Aunque el Rojo Ponceau tiene menor sensibilidad de deteccin que el colorante Coomassie blue, es un mtodo que permite una deteccin rpida; adems, el rojo Ponceau al contrario que el coomassie blue, tiene la capacidad de teir reversiblemente las protenas; es decir, a medida que se lava con agua, el tinte va desapareciendo, dejando ver paulatnamente las bandas, y si se contina lavando volvera a quedar todo blanco. Es necesario llevar un control positivo y otro negativo para saber si lo que muestra el revelado es o no la protena de inters. Por otro lado, la tcnica de Western blot es mucho ms sensible que la tincin con Rojo Ponceau, debido a la especificidad antgeno-anticuerpo que aumenta la capacidad de detectar concentraciones menores de la protena presente en la membrana. Comparando la imagen del ponceau con la del revelado se puede ver esta diferencia de sensibilidades, ya que en el Western se ven bandas correspondiente al volumen de 2ul de protena que en la de ponceau no se ve. Dicha banda en el

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ponceau deberan estar a ambos lados de la calle del ladder ( calle con bandas azules).

Bibliografa:
Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Damell J.
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Smih y Wood, Molculas Biolgicas, 1998, Pearson Education. Rodney F. Boyer, Modern Experimenal Biochemistry, 1993, second edition,
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Blanco Antonio, Qumica Biolgica, 1994, Sexta edicin, Editorial El Ateneo. Gua de informes entregados por los profesores. Kuchel, Philip W, Bioqumica General, 1994, Ed. Mc Graw Hill.

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Anexo:
Ecuacin de la recta de calibracin hecha a partir de los promedios de las absorbancias de todos los grupos: Y= 1.1196x - 0.0368

Por lo tanto la concentracin de protenas obtenidas es: 100x (0.621 - 0.0368) / 1.1196= 48.85 ug/ul La ecuacin se multiplic por 100 por que la muestra fue diluida 1/100 antes de llevar ala espectrofotmetro. Calculos del volumen de muestra a sembrar para obtener 80ug/ul: Concentracin de la muestra calculada con la curva de calibracin: 48.85ug/ul 48.85ug 2453ug 1ul 50ul

Se agregaron los 50ul de la muestra en 250ul de Ripa logrando as una dilucin 1/7. Y 20ul del buffer de siembra. Por lo tanto: 2453ug 80ug 320ul 10.5ul.

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