Produccion de Invertasa Por A (1) .Niger en Fermentacion

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
Casa abiertaal tiempo
Produccin de lnvertasa por A,spergillus niger en Fermentacin Lquida y Fermentaci6n Slida
TESIS Que para obtener grado de el Doctor en Ciencias Biolgicas PRESENTA
Sergio de Jess Romero Gmez
Abril de 2001
El jurado designado por las Divisiones de Ciencias Biolgicalsy de la Salud de las Unidades lztapalapay Xochimilco aprob la tesis que present
Sergio de Jess Romero Gmez
El da 02 de Abril de 2001
Comit Tutorial:
Tutor: Dr. Gustavo Viniegra Gonzlez
Asesor: Dra. Amelia Farrs Gonzlez-Sarabia cI;&.L,
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Asesor: Dr. Christopher Augur
Sinodal: Dr. Ernesto Favela Torres
Sinodal: Dr. Sergio Huerta O &
El jurado designado por las Divisiones de CienciasBiolgicas y de la Salud de las Unidades lztapalapa y Xochimilco aprob la tesis que present
Sergio de Jess RomeroIGmez
El da 02 de Abril de 2001
Comit Tutorial:
Tutor: Dr. Gustavo Viniegra Gonzlez
Asesor: Dra. Amelia Farrs Gonzlez-Sarabia
Asesor: Dr. Christopher Augur
Sinodal: Dr. Ernesto Favela Torres
Sinodal: Dr. Sergio Huerta Ochoa
El Doctorado en Ciencias Biolgicas de la Universidad Autnoma Metropolitana est incluido en el Padrn de Posgrados de Excelencia del CONACyT y adems cuenta con apoyo del mismo Consejo, con el convenio PFP-20-93.
" . . "
"
."
A las mujeres demi vida en estricto orden de aparicin: Mi madre, mi ta Ruth, Georgina, Tatiana y mi pequea Ruth Guadalupe
lndice lndice
...........................................................................................
Resumen....................................................................................... Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Introduccin................................................................................
Ill VI 1 1
4
Hongos filamentosos ........................................................................
Aspergillus niger.............................................................................
Regulacin de lasntesis de enzimas en hongos filamentosos................. Metabolismo aerbico...................................................................... Transferencia de oxgeno ................................................................. Fermentacin lquida ....................................................................... Fermentacin slida ........................................................................ Diferencias entre fermentacin slida fermentacibn lquida.................... y Poliuretano .................................................................................... Sacarosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Invertasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 11 16 18 21 23
25 26
29
30 34 36
Proteasas ...................................................................................... Antecedentes................................................................................. Justificacin ................................................................................... Objetivos ........................................................................................
Hiptesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 . Material y Mtodos.......................................................................

3. Resultados .................................................................................
37
38
45
Efecto de
la concentracin inicial de sacarosa sobre
la produccin de
45
invertasa por Aspergillus niger en fermentacin sliday lquida ................ Estudio de la produccin de invertasa por 3 cepas de Aspergillus niger en fermentacin slida y lquida con 100 gll desacarosa inicial..................... Estudio de la secrecin de invertasa por
Aspergillus niger C28B25 en
70
fermentacin slida y lquida con 100 g/l de sacarosa inicial..................... Estudio de la morfologa de crecimiento de Aspergillus niger en fermentacin slida y lquida .............................................................
4 . Discusin general ........................................................................
76
90
99
5 . Conclusiones ..............................................................................
107 108 111 124
Propuestas ......................................................................................
6 . Bibliografa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7 Anexo 1
Resumen En este estudiose compar la produccin de la enzima invertasa(sacarasa o 13 fructo-furanosidasa EC3.2.1.26) por una cepa silvestre de Aspergillus niger C28825 usando medio lquido y slido. Se utiliz espuma de poliuretano como soporte inerte para fermentacin slida y se propone corno un sistema modelo para el estudio de las diferencias entre fermentacin slida y lquida. evaluacin del efecto de
El objetivo principal fue
la que
la adicin de cantidades crecientes sacarosa de
actuase, simultneamente como inductor de sta enzima y nica fuente de carbono. Se midieron los siguientes parmetros fisiolgicos: la velocidad especfica de
crecimiento del organismo (p), el nivel mximo de la biomasa () X ,
el rendimiento
de biomasa por gramo de substrato consumido (VX/S), el rendimiento enzimtico por gramo de biomasa producida (Yux) y la productividad de la enzima enzimtica (P).
Con la comparacin de estos
indices se pretende demostrar la si
mayor
productividad enzimtica del medio slido se debe la mayor produccin de biomasa o a una mayor produccinenzimticapor relacionar con forma la fermentacin.
LOS resultados obtenidos indicaron que,
gramo1 de biomasa y siestose
puede medio de
de crecimiento micelio del dentro cada de
en fermentacin slida,
la biomasa
producida fue mayor que en fermentacin lquida, aunque el consumo de substrat0 fuemuysimilar en ambosmedios.Estofuem& notable cuandoseusaron altos
niveles de sacarosa (SO 50 g/L). Es decir, los valores de YNs, corno funcin de So, > fueron mayores para la fermentacin slida que para la liquida con todos 10s niveles
111
"
"
de sacarosa. Adems, las tendencias de la p fueron diferentes entre los dos tipos de fermentacin (mayorpara el medio slido).Losnivelesmximos de la invertasa
fueron mucho mayores en fermentacin slida
que los obtenidos por fermentacin
lquida, con sacarosa inicial mayor a 25 g/l. La productividad de la enzima pas de ser casi igual con 6.25 gll de sacarosa inicial para ambos tipos de cultivo, a ser
5
veces mayor en fermentacin slida, cuando se aiiadieron 100 gll de sacarosa inicial.
El rendimiento de la enzima por gramo de biomasa (Yvx) fue mayor en medio slido
que en medio lquido. Todas estas diferencias fisiolgicas se acentuaron cuando niveles de sacarosa fueron altos.
AI estudiarse la composicin azcares de
los
del caldo de cultivo con
100 g/l de
sacarosa inicial, se encontr que en el medio lquido se acumulaban ms la glucosa y la fructosa, que en el medio slido. Esto indica una velocidad de hidrlisis mayor a la capacidad de produccinde biomasa en el medio lquido durante las primeras horas del cultivo. Por otra parte, se midieron los niveles de actividad de proteasa para comparar el efecto del sistema cultivo de sobre la estabilidad de la invertasa, actividad la enla fermentacin
proteoltica fue 6.5 veces menor en la fermentacin slida que lquida.
Los cultivos de Aspergillus niger en medio lquido produjeron agregados esfricos o pelotitas (pellets) queson la formamacroscpicacaracterstica Pero enmedio en este medio.
slido, este organismo creci en forma de un micelio disperso
adherido en parte a las trabeculas del polmero y c m parte en forma de micelio areo en contacto directo con la fase gaseosa. La observacin microscpica de poliuretano
IV
mezclado con el medio lquido mostr que Sta formaba meniscos con un espesor cercano a 60 vm. y que esta medida corresponde ;a la dispersin de 25 ml de agua en un gramo de poliuretano, en una superficie de aproximadamente 4,000 cm2. Es decir que el cocientede la superficiesobre el volumenfue de AN =160 cm2/cm3. En
cambio, la medicin del rea de contacto del medio en matraces Erlenmeyer de 125 ml con 25 ml de medio indic una relacin AN = 1.O cm2/cm3. Es decir, la superficie de transferencia de gases en el medio slido fue dos rdenes de magnitud mayor que en el medio lquido. De acuerdo con estos resultados, es posible apoy<ar las siguientes conclusiones:
l.Aspergillus niger crece ms rpidamente, con una mayor biomasa mxima y con
un mayor rendimiento de
biomasa por gramo substrato de
consumido en
fermentacin slida que en fermentacin lquida. 2. La produccin de invertasa est al menos parcialmente asociada a la produccin de biomasa en ambos tipos de cultivo. Por lo tanto, la mayor productividad de los cultivos de fermentacin slida se debe, a la mayor y ms rpida produccin de biomasa en este tipo de fermentacin.
3. Los cultivos de fermentacin slida

forma de micelio disperso
en poliuretano, presentan
crecimiento en
con un gran espacio areo mayor clue en lquido.
y una superficie de
intercambio gaseoso 160 veces
los cultivos de
fermentacin lquida presentan pellets con centros muy densos. De manera que las condiciones de cultivo y el tipo de crecimliento favorecen la transferencia oxgeno interior al de fermentacin lquida. la biomasa en fermentacin slida de
y la dificultan en
4. ABSTRACT:
The purpose of thepresentstudywasto
compare the productivity of a fungal
enzyme, invertase (sucrase o 13 fructo-furanosidase EC3.2.1.26) Aspergillus niger of grown in solid state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF).
Poliurethane foam was used as inert support in SSF experiments. One of the objectives was to evaluate the effect of increasing initial sucrose and sole carbon source. The following
concentrations as invertase inducer
physiological parameters were evaluated: specific: growth rate (p.), maximal biomass
(, X ) )Y ,(
biomass yields per substrate gram and culture productivity
(YWS), enzyme yields per gram biomass and submerged fermentations. A higher
(P) from solid
comparison of the above parameters was done toevaluatewhetherthe
productivity of SSF cultures is related to one or several of the growth and production parameters. The obtained results shown that in solid fermentation, biomass production was much higher than in liquid fermentation even when subsltrate consumption was comparable in both fermentation systems. This result was much more notable for higher substrate concentrations (higher than 50 g/l). Biomass yie1d.s were much higher in solid than in liquid state fermentation with a decreasing tendency as was increased. Specific speed growth the substrate concentration liquid
(p.) was higher than to solid in
fermentation at all sucrose concentrations tested. Invertase titers were higher in SSF than in SmF as well. At low sucroseconcentrations (between 6.25 to 25 g/!) invertase productivitywas comparable in bothfermentationsystems.However, at high initial
sucrose concentration (100 g/) invertase productivity was 5 times higher in SSF than
in SmF. Enzyme yield per gram of biomass (YEM) was much higher in SSF than in
SmF. When sugarcomposition of the culture broth wasanalyzed,glucoseandfructose were found to accumulate at higher concentrations in SmF than in SSF cultures. This can be related to slower growth in SmF cultures. Extracellular protease levels were measured in ordertoassert its effect on the stability of invertaseactivity in the
cultures. Proteolytic activity was 6.5 times lower in SSF than in SmF. However these differences could directly not related differencesinvertase to in stability cultures. In liquid cultures, Aspergillus niger grew In the form of pellets. In SSF Aspergillus
niger grew as disperse mycelia adhering part the in to polyurethane foam
in the
and
growing in partas
airea1mycelia.Microscopicobservation
of liquidmediawithin
polyurethane cubes showed a liquid layer with thickness of 60 pm within the holes of polyurethane cubes. Knowing that the amount of liquid added per gram of
polyurethane was 25 mi, a surface area of 4000 crn2 could be calculated. This means thatin SSF the surfacevolumerelationwas
160 cm2/cm3, meanwhile in SmF this
relation was 1.O cm2/cm3. This represents a surface interchange 300 times bigger for SSF than for SmF cultures. According to these results, the following conclusions were supported:
1. Aspergillus niger grows faster, with higher biornass
maximal and higher biomass
yields in SSF than SmF.
2. Invertase production is at least partially associated to biomass production In both
culture systems. Therefore the higher enzyme productlvlty of SSF IS related to the higher and faster biomass production.
3. SSF cultures on PUF grows as dispersed mycelia with a big air space and a gas
interchange space 160 times bigger in SSF thlan in SmF, meanwhlle SmF cultures grows as pellets with very dense center. Therefore culture a conditions and growth type uphold and difficult oxygen transferin SSF and SmF respectlvely
LII I
Introduccin
El mercado de enzimas utilizadas en procesos industriales representa alrededor de
mtl mlllones de dlares anuales y los hongos filamentosos contribuyen con el 40% del total, se tratadeunmercadoenexpansi6n,sobre nuevos procesosqueutilizanenzimasconocidas todo por el desarrollo de
y porlaaplicacindeenzimas
nuevas en procesos conocidos (Archery Peberdy, 1997). Lamayorade las enzimasutilizadasenprocesosindustrialesseproducen
por
fermentacin liquida (FL), pero en los ltimos aos se han desarrollando sistemas alternativos para la produccin enzimas hongos de por filamentosos, fermentacinslida (FS). Estesistemadecultivoesmsproductivoquela como la
FL, e
Imparte caractersticas interesantes al cultivo y a las enzimas producidas (Pandey y col., 1999). Enestetrabajosetrata de aclararaqu se debeque
los cultivosdehongos
para la
Oeuteromicetos(mohos)por
FS tengan,usualmiente,mayorproductividad
sntesis de enzimas excretadas medio que los cultivos de FL al
Hongos filamentosos
Los hongossonorganismoseucariontes,que
se caracterizanporser
inmviles,
presentar talos, que pueden ser estructuras ramificadas llamadas micelios cuerpos o
ms compactosdenominadosbasidiocarpos,en
lugar de tejidos. Los hongos no
realizan la fotosntesis pues son hetertrofos que viven a partir de la materia orgnica produclda por otros organismos. Pueden reproducirse por esporaso por medio de la
ramificacin de estructuras tubulares y arborescentes llamadas hifas. Una hifa es una estructura cilndrica que consta de una pared celular que recubre a una membrana
en cuyo interior pueden existir uno o varios ncleos. Adems, pueden tener septos que son paredes internas que cortan la continuidad del citoplasma dentro de la hifay en algunos casos estos septos pueden presentar poros citoplasma, incluyendo que permiten el paso del
a sus organelos, estableciendo as, continuidad la
citoplsmica dentro de la hifa. Las hifas crecen por extensin apical de las puntas y o se multiplican por ramificacin. En los extremos de estas clulas es donde se lleva a cabo la asimilacin de nutrientes del medio y la excrecin de las hidrolasas que son enzimas extracelularesnecesariasparaladegradacin
1990). substratos complejos (Herrera y Ulloa,
de una granvariedad
de
Los hongos filamentosos comnmente son conocidos como
el crecimiento que
aparece frecuentemente sobre las frutas y los aliimentos donde se les da el nombre de moho El trmino moho es un nombre camn que carece significacin de organismos
taxonmica y seaplica a una variedaddehongosquecrecencomo
semi-microscpicos, cuyo micelio tiende formar una red suelta en lugar de un tejido a denso. Es en esto en que los mohos u hongos filamentosos se distinguen grandes hongos carnosos, como setas las comestibles mohos pueden pertenecer cualquier a clase de los
o los championes.Los
la mayora de
de! hongo, pero
las
especies son Ficomicetos u hongos imperfectos (Deuteromicetos). comunes pertenecen a las especies de Aspergillus o Penicillium. Los hongos filamentosos se reproducen por esporas
Los mohos ms
o conidias y se distinguen por
las caractersticas de los tallos que soportan las esporas y los conidiforos. En los
2
Aspergilli el conidiforo se eleva a partir de una clula micelio vegetativo, llamada del
clula pie, que tiene una pared ms gruesa que la del micelio vegetativo, y cuando las esporasseesparcencomnmentesemantienevaco,esdecir no contiene
protoplasma. El tallo del conidiforo no est septado y termina en una parte hinchada llamada la vescula. A partir de esta expansin las conidias se forman en cadenas de esporas cuyo segmento inicial se denomina sfwigmata. En ocasiones la sterigmata est ramificada
y las esporas se que alzanpartir a
de las ramificaciones se maduras se dispersan en el
denominan sterigmata secundarias. esporas Las
ambiente y en condiciones adecuadas dan origen a otra colonia de hongos (Herrera

y Ulloa, 1990).
Taxonmicamente los hongosestnagrupados dentro del reino
en el reinoFungi,la
clasificacin
es complicada y se basa principalmente
en el tipo de estructuras
reproductoras que se forman tanto en los ciclos sexuales como asexuales. En forma ms precisa: lapresenciadeciclosexual,
el tipodeestructurasreproductoras,
el
nmero de grupos de complementacin y la preslencia o ausencia de septos, son los principales caracteres para clasificar a los hongos en tres grandes grupos, a saber:
Myxomycota (hongos mucilaginosos),
umycota (hongos verdaderos)
y Lichens
(hongos simbiontes). El grupo Eumycota se divide a suvez en cuatro grupos que son
Ascomicetos, Basidiomicetos, Ficomicetos y Deuferomicetos (Herrera y Ulloa, 1990).
Los Deuteromicetos y los Ascomicetossonhongosfilamentosos,de
los cuales el
gnero ms abundante es
Aspergillus. En su mayora
no forman cuerpos
fructificantes o basidiocarpos, sino que crecen exclusivamente en forma de micelios. Han sido considerados por largo tiempo organismos ideales para el estudio de las
caractersticas fisiolgicas y genticas de los eucariontes debido a manipulacin enlaboratorio, definidos de bajo costo
SU facd
su capacidadparacrecerenmediosqumicamente
que permite obtener vanas
y a su rapidez de crecimiento
generaciones en poco tiempo. Adems de que, tradicionalmente, se han utlllzado a algunos de estos microorganismos para fermentar alimentos y como productores de antibiticos y entimas hidrolticas (Wessels, 1999).
Aspergillus niger
Las especies de Aspergillus estn distribuidas a escala mundial. Se encuentran en el suelo y entre la materia vegetal, siendo Aspergillus niger la especie ms comn. Este organismo es el contaminante ms frecuente en los laboratorios de microbiologia Es un hongo filamentoso perteneciente al grupo de
los Deuteromicetos, famllla
Eurotium, y se caracteriza por presentar: hifas septadas, esporas asexuales llamadas
conidiosporas, las cuales.se encuentran en una estructura llamada conidiforo que al llegar a la madurez adquiere la forma de un hisopo, aspersor o regadera, la cual origina el nombre del gnero. Este organismo no presenta ciclo sexual, lo que se por le incluye entre los llamados hongos imperfectos junto con otros Aspergilli y algunas especies de los gneros Mucor y Penicillium. La forma vegetativa o micello de A
niger es de color blanco o amarillento, al llegar a la madurez producen estructuras se
reproductoras llamadas conidiforos que dan origen, en negras, lo que da el nombre de
el tipo silvestre, a esporas
la especie. Cuando a algn representante de este
grupo se le observa ciclo sexual se le traslada al grupo Ascomiceto y el nombre se cambiade

Aspergillus a Emericela. Tal es el caso de Aspergillus nidulans que
presenta c~clo sexual por lo que sera ms adecuado llamarle Ernericela nidulans. Sin embargo, la mayoria de las personas lo conocer) y citan con su primer nombrepor lo cual se ha conservado (Henera y Ulloa, 1990). La clasificacin del genero Aspergillus es complicadaprincipalmente requisitos que debecumplir un hongoparaserconsideradocomo porque los
un Aspergillus
niger son vagos presentar esporas de color negro, no tener ciclo sexual conocido y
no pertenecer a otro gnero Este sistema de clasificacin deja muchos organismos parecidos dentro de especie, obligatoriamente misma la sin que ltimarnente. se ha desarrollado nueva una serie sistemas de de lo sean. clasificacin
molecular por medlo de analisls de fragmentos de restriccin o expresin de genes especficos. La clasificacin de
Aspergillus nigrer, es por lo tanto propia
de un
los
complejo taxonomlcoms que deuna
especie,porejemplo:deacuerdocon
ltimos hallazgos se debe utilcar el nombre Aspergillus niger variedad awamori en lugar deidentificaralaespecie
1990).
Aspergillus awamori (Kuster-vanSomeren y col.,
Se denomina aspergillosis a una serie de enfermedades causadas por
Aspergillus
o, niger, A. flavus y A . fumrgatus y que resultan en reacciones de tipo alrgico para el

caso de personas deficiencias con inmunitarias, verdaderas infecciones,
pues
generalmente el sistema lnmunltario puede combatir la invasin por Aspergilli.
Regulacin de la sntesis de enzimas por hongos

Los hongos flamentosos como A. niger sonorganismossaprfitos,por
lo que
secretan una gran variedad de enzimas que les permiten la asimilacin de polmeros complejos de tejidos animales y vegetales, que! utilizan como fuentes de carbono y nitrgeno.Sinembargo no seraeficienteparaunhongosintetizarcontinuamente
todas las enzimas hidrolticas de que es capaz. En cambio los hongos filamentosos sintetizan y secretan en grandes cantidades slo las enzimas hidrolticas necesarias para degradar el medio en el cual se desarrollan, a esta caracterstica se control de la expresin gentica (MacKenzie y col.,1993;Ruijter Ronne, 1995). El esquema actualde la regulacin de lasntesisdeprotenasenhongos,est le llama
y Visser,1997;
basado en tres elementos genticos bsicos:
a) Gen regulador. Gen que puede localizarse antes o despus del gen estructural,
as como en alguna otra regin de DNA, y codifica para un producto que regula la
transcripcin del gen estructural. b) Promotor. Es un sitio de fijacin de represores o activadores, es donde inicia lectura del gen estructural.Estaformadoporvariassecuenciascomo la
son lacaja
TATA, CAT, CG,las cuales son responsables de los niveles basales de transcripcin de los genes. La unin del represor al operador evita la transcripcin de
los genes
estructurales, mientras que la unin de un activad'or aumenta la transcripcindel gen estructural.
c) Gen estructural Es la regin de DNA que codiifica para una macromolcula (tRNA, funcin1 estructural o cataltica. mRNA o proteina) y que puede tener una
REGULAC16N NEGATIVA: En condiciones normales,. la unin continua del represor con el promotorimplde la transcripcin del gen estructural,cuandoelinductor halla presente se une al represor, impidindolequeseunaalpromotor, permite la transcnpcln de se
lo que
los genes estrulcturales. Solo algunos genes de
Aspergillus se han reportado coneste sistema de regulacin (Mackenzie col. 1993). y
REGULAC16NPOSITIVA:Se
han localizado vaariasprotenasque seunen
a los
promotores en presencia del inductor aumentando los niveles de transcripcin del gen estructural Estas protenas denominan se factores transcripcin. de Varias hiptesisse han formuladopara primeraseproponequelapresencia explicar laregulacindeestasprotenas:En la
del inductor modifica estructuralmente a las hiptesis
proteinas habllitndolas para unirse a la regin del promotor, la segunda
propone que la presencia de glucosa promueve la fosforilacin de los factores de transcrlpcln permltiendo la unin de estasprotenas aumentando la transcripcin a las regionespromotoras se han localizado
del gen estructural. Tambin
promotores senslbles a nitrgeno, azufre y fsforo, incluso el gen pacc de nidulans A. el cual modlfica la expresin gentica positiva o negativamente dependiendo del pH extracelular (Mackenzle y col., 1993; Ronne, 1995). En el caso de los hongos filamentosos la regulacin de la sntesis proteica se realiza a diferentes ntveles (MacKenzie y col., 1993; Ronne, 1995).
7
a) Secuencias promotoras en la regin reguladlora de
cada uno de los genes. Este
tipo de regulacin de la expresin gentica en los hongos filamentosos se realiza por la actuacin de varias secuencias nucleotdicas, anteriores al gen estructural, que
regulan la transcripcin del gen al que pertenecen. Se piensa que estas secuencias son responsables delos niveles basalesde la expresin enzimtica. b) Secuencias deDNAresponsables secuenciasesdondeseunen del controlgenticoporinduccin. A estas
las protenasrepresoras
o activadoras,lascuales
actan como reguladores de la respuesta de induccin y represin. c) Retroalimentacin de una ruta metablica especfica. Dentro de la regulacin por retroalimentacin se ha identificado una serie de protenas activadoras que se unen al DNA en regiones de control. Adems, se ido encontrando un nmero creciente han derepresores.Estosactivadores
o represoresactan no slo sobreungen,sino
sobre un grupo de genes involucrados en una ruta metablica, como es el caso del gen a/c de A. nidulans que promueve la expresir\ delos genes inducibles alcA, alcR, aldAinvolucradosen Visser, 1997). d) Regulacin global que depende el metabolismodeletanol(Kulmburg
y col., 1992; Ruijter y
de los niveles de carbono, nitrgeno, fsforo
oxgeno. La expresin de muchos genes regulada esta adems por globales,queson
controles
mediados porunnmerorelativamentepequeodeprotenas que los niveles de carbono,nitrgeno,fsforo,oxgeno

o
reguladoras,demodo
azufre, detienen o aumentan la expresin de algunasenzimas o de vas metablicas completas. Se ha encontrado las que protenas responsables de
la regulacin
enzimticasonfrecuentementesimilaresentregrupos 1993; Ruijter y Visser, 1997).
afines (Mackenzle y col
Es de especial inters la regulacin catablica por carbonoen la cual la expreslnde

un determinado grupo enzimtico no slo est dictado por la
presencia
del Inductor,
sino principalmente por la ausenciade glucosa o de algn otro azircar de aslmllacion sencilla en cantidades apreciables. En
A. niclulans se han
localcado 3 genes
involucrados en la represin catablica por carbono llamados: creA. cre6 y creC El gene creA es un inhibidor que acta unindose al DNA en mltiples zonas capaces de aceptarlo.Este gene se ha identificado en A. nidulans. Neurospora crassa y
Trichodenna viridae. La delecin o mutacin de los sitios de union a creA en el DNA

impide
la represin por glucosa del gen en cueslin, sin afectar la regulacin de los
la mutacin del gen
CEA
dems, pero
produce mutantes catablicamente
desreprimidas para la sntesis de una amplia variedad de enzlmas (Mackenzie y col., 1993).
La evidencia acumulada sugiere que los sitios de regulacln por unln de protenas
adyacentes disponibles pueden sobreponerse o ser competencia porunin al DNA, detalmodo unos a otroslndlcandouna
clue la expresln una de protena
especfica sera el resultado de la suma de efectos causados por esta competencia (Mackenzie y col., 1993). Otra regulacin se localiza a nlvel postranscrlpclonal en el lumen del retculoendoplsmico; donde semodifican las protenas a secretarse
principalmentepor el procesodeglucosilacin. expresin enzimtica en manera:
De estemodo la regulacln de la
la siguiente
hongos filamentosos queda ordenada de
Las enzimas semantienenexpresndose,demaneraconstitutiva basalesmuypequeas;debidoa
en cantidades en las
la presenciadesecuenciaspromotoras
inmediaciones del gen estructural. Adems, en presencia del inductor, el represor se une a ste y libera el sitio de unindelgenregulador,peroen concentraciones altas de glucosa inhibidores de tipo la presencia de
los sitios de unin a protena son ocupados por

de glucosa en el medio se
creA. AI disminuir la concentracin
inicia la liberacin de los sitios de regulacin, unin, es sustituido por factores especficos
al separarse el inhibidor del sitio de de transcripcin, de tal modo que, las
enzimas empiezan a secretarse dando origen ams inductor llevando entonces a un control por retroalimentacin con el subatrato. condiciones Adems las en las
prevalecientes en el mediopromuevenmodificacionespostranscripcionales
protenas (MacKenzie y c o l . , 1993; Acua-Argelles y col., 1995; Minjares-Carranco y col., 1997). Dentro de las modificaciones postranlscripcionales ms importantes, haestudiado la glucosilacindelasprotenas secrecin en el caso delaquimosinaen Coleman y col., 1991). en relacinconlaeficiencia
se
de la
Aspergi//us niger var. awamori (Dunn-
Metabolismo aerbico
En base a sus requerimientos o sensibilidad al oxgeno los microorganismos pueden ser clasificados como anaerobios, aerobios estrictos aerobios facultativos. y Para los microorganismos aerbicos, la presencia del oxgeno juega importante en la regulacin de sus actividades metablicas. un papel muy
10
Los microorganismos aerbicos necesitan oxigeno para obtener
la energa de los papel de
alimentos, y la concentracin del oxigeno en el medio decultivojuegaun central en la regulacin metabllca

Por ello. en el cultlvoeste de tipo
microorganismos, el aire debe ser drstnbuldo al Intenor del liquido de fermentacin para pasar al interiorde las clulaspor dlfusloln slmple.trasestodebecruzar el
citoplasma hasta el lumen mitocondnal De este modo. el oxigeno consumido por los microorganismos debe pasar a traves de varias barreras antes de alcanzar la matriz mitocondrial dondeseusar
como aceptordeprotonesal
final de la fosforilacicjn
2 oxidativa. La concentracin de0 que es ligeramente superior al21% en el aire llega

a ser casi nula en la matriz de la mltocondna. el proceso de transferencia de oxgeno se debe a su gradiente de concentracin entre las dlferentes fases del cultivo. La
concentracin y la velocidad de transporte del oxigeno del aire a la biomasa puede modificar de manera importante el comportamlento del mrcroorganismo en el cultivo al controlar la produccin de ATP y con ello todo la produccin energtica de los microorganismos (Pirt, 1975; Righelato. 1975).
Transferencia de oxgeno
Existen variosmodelosparaexpltcarlatransferencia microorganismos,unode estacionaria deliquidoque
del oxgeno del airea
los
los ms sencillos y completoseslateorade
pelcula
se presentaenlafigura
1,
segun el cual la principal
resistencia al transporte del oxgeno entre las fasesgas-liquldo-biomasa se presenta
en la pelcula estacionaria de liquido que se encuentra el limite entre las diferentes en fases. velocidad difusin La de del oxgeno entre las fases directamente es de concentracin
proporcional a la superficie del rea de intercarnbio, del gradiente
del oxgeno y del grosor dela capa estacionaria de lquidoque rodea a la biomasa.
En un reactor la resistencia Pelcula a la transferencia de masa(O2) se da por esta pelcula
estacionaria
/
I
I \
\
\
\
Durante el crecimiento en pellets el proceso puede estar controlado por difusin del O2en el interior del agregado
I
I
,
/
" " " "
Burbuja
Clula
Figura 1: Representacin grfica de la modificado de Pirt (1975).
teora de pelcula estacionaria,
En un diseo de reactor dado, el grosor de la capa estacionaria de lquido
en el
cultivo que puede ser disminuida por medio de la agitacin del medio de cultivo, lo que permite un mejor crecimiento del hongo. Lasotrasfuerzas
que rigen la transferencia oxgeno cultivos de en
lquidos se
describen en una serie de ecuaciones leyes que se presentan a continuacin. y
12
La solubilidad del oxgeno en el medio acuoso es de slo 7 mgL" a una atmsfera de presin y 2OOC. Esto es pococomparadoconlacantidaddeoxgenoquepuede consumir un cultivo. Como se ver ms adelante, un cultivo denso puede necesitar hasta 50 g de oxgeno L" h-', equivalentes a cerca de L de aire porL de lquido por 3 minuto (WM). Por lo tanto esnecesariorenovareloxgenodisueltotransfiriendo oxgeno desde el aireal medio lquido. En general, si volumen del lquido est muy el extendido, y por ello, forma una lmina delgada, el gradiente de difusin ser ms
elevado pues este proceso est gobernado por la ley de Fick que sigue la siguiente ecuacin emprica.
Flujo Total = -AD(Ce - Ci)/h
Dnde, A (cm2), es el rea de la interface; D (cm2h"), soluto; Ce ( g ~ m - ~ ) , la concentracin externa; Ci
la constante de difusin del la concentracin interna y, h
(cm), el espesor de la lmina de la interfase. De esa forma, el flujo total de oxgeno ser ms grande cuando la lmina sea muy extensa (A, muy grande) y muy delgada
(h, muy pequea).
En los cultivos en matrazagitado,desarrolladoporKluyer
y Perkin, (1933), se
aumenta el rea de la interfase y se promueve el transporte de oxgeno en el seno del liquido, mediante el movimientodelmismo,pero
se siguedependiendodela
se recomienda usar
relacin r = AN (cm2 de superficie/cm3 de volumen). Por eso
volmenes pequeos de lquido dentro de ese tipo de matraces, de forma que se extienda en la parte baja ancha del recipiente, y
ste
Como un cultivoaerbicoestreguladopor
el balanceentrelatransferencia
de
oxgeno y su consumo o Demanda Biolgica de Oxgeno (DBO), este proceso.puede describirse por el siguiente balance de0 2 .
El coeficiente %a se puede medir

transferenciadeloxgenoa
en forma sencilla, viendodinmica la
de
un recipienteagitado.Susunidadessonhora,pues
corresponden a un coeficiente que, multiplicado por las diferencias de concentracin del oxgeno, resulta en la velocidad de neta ,transferencia del 0 al 2 lquido.
El
segundotrmino,correspondealavelocidadde est regulada por el coeficiente, YOVS
consumo deoxgeno (DBO) que la demanda
(gOz/gS), correspondiente a
unitaria de oxgeno por el metabolismo, que en el caso de la respiracin aerbica es de 1.O5 gO2/gS, segn se puede derivar de la estequiometra del proceso. Y, por la ecuacin de Monod, segn se indica a continuacin.
9s = (ClrnaxNws) S/(&; + S)
Siendo:
pmax
(hora-),la velocidad especfica mxima de crecimiento, YX/S (gX/gS), el

en furrcindelsubstratoconsumido;
S
coeficiente de rendimientodelabiomasa
(gS/L), la concentracin del substrato y, k ,la constante de saturacin del proceso. Segn, (Righelato, 1975) un cultivo de A. niger, tiene en medio lquido una velocidad
de crecimiento mximo cercana a,
pmax
= 0.3h, un & = 50 mgL y YX/S O 4 gXgS =
. Por lo tanto, para que el cultivo pueda crecer a esa velocidad, requlere satlsfacer
una DBO calculada como sigue.
Cuando la densidad de la biomasa es alta (60 SIL), el consumo neto de aire (DBO). con 21% de oxgeno, a una presin de 1 atm, y a la temperatura de2 5 O C. equwale a por lo menos a 2.9 W M (litros de aire porlitrodelquidoporminuto). pero la
demanda bruta (sin descontar las prdidas de aire) depender de la capactdad de transferencia de oxgeno al lquido (kLa) y este factor a su vez, depender del dlseo
y de las condiciones de operacin del reactor. En consecuencia. cuando la
concentracin del substrato es alta, la DBO esta,r gobernada por la densldad de la biomasa, X, y sta, a su vez, estar controlada por el valor de kLa.Por lo tanto, el
crecimiento de la biomasa depender crucialmente del coeficiente de transferencta del oxgeno al medio de cultivo.
Los valores de, kLa pueden ser obtenidos de l a literatura para diferentes ttpos de
dispositivos. En la tabla 1 se muestran algunos datos conocidos que comparan como varia este coeficiente con la geometra del reactor. Los matracesErlenmeyer sln deflectores (bafles) son los ms utilizados para experimentos de laboratorio, tiene valores de &a ms bajos normalmente inferiores a 200, estoproducirquela
concentracin de
IC
biomasa en cultivos dentro de este tipo de matraces est limitada. Este antecedente tcnico es de gran lrnportancla para comparar
10 datos de cultivos de A. niger en 1s
matraces agitados y en un medlo slldo poroso (Henzlery Schedel, 1991).
Fermentador
KLa (h")
80-200
agltado
Fermentador Columna con burbujeo Reactor con cclo de presin Filtro de burbujeo de Reactor
Alr lift
325-2650
140
400
350 350
.c 1000
cortede platoReactor de Reactor con cuchillas
1O00
Tabla l. Valoresde KLa experimentalesreportadosparadiferentes reactor (Mavituna y Sinclair, 1985). Fermentacin lquida
tipos de
Sepuededefiniralafermentacinlquida(FL)
o sumergida(abreviadaen
ingls
como SmF) corno un cultivo de celulas microbianas dispersas en forma homognea en un recipiente agitado que puede no ser aireado por medios mecnicos. La forma o defermentacinliquidamsutilizadaen
los laboratorios investigacin de
es el
matraz agitado El desarrollo de esta tcnica ha sido importante porque ha permitido el cultivo de organismos aeroblcos en condiciones homogneas con una densidad
16
moderada debiomasa la organismos. A su vez,
y ha simplificadoestudio la el defisiologa
de los
el cultivode
suspensiiones de clulas fermentadores en no es raro verfermentadores con
agitadoshaevolucionadoagranescala,pues
compuestos volmenes superiores a 10 mil litros, en los cuales se producen todo tipo derivadosdelmetabolismomicrobiano.Enestossistemas,laagitacin permite aumentar la transferencia del Dispersa el gasenburbujas mecnica
gas a la biomasa de tres formas bsicas: I) interfase
ms pequeasincrementando el reade
gas-lquido. 2) Incrementa el tiempo de contacto de lquido con las burbujas de gas.

3) Disminuye el grueso de la capa estacionaria del lquido al aumentar la turbulencia
del cultivo. Adems, la agitacin mezcla el cultivo mantenindolo homogneo. Esto es particularmente importante para la dispersin de la biomasa y la transferencia de
calor (Henzler y Schedel, 1991). Los productos metablicos y el calor se dispersan

fcilmente, lo por que, no son un limitante factor para el crecimiento del
microorganismo.Labarreraprincipaldetransferenciadel solubilidaden el agua y, al hacersemayor
O enla FL, essubaja 2
la capa de agua que debecruzar,
aumenta la dificultad para que llegue a la clula. Gran parte del gasto energtico que debe realizarse en la FL est relacionado con la necesidad de satisfacer la demanda de oxgeno en el crecimiento de los microorganismos, esto es muy claro en el caso de Aspergillus niger, que es un organismo aerbico estricto y necesita una alta tasa de transferencia de oxgeno para mantener su crecimientoy producir muchos de los metabolitos de inters (Righelato, 1975; Solomon, 1975; Raimbault, 1998).
17
Fermentacin slida.
Lafermentacinslidapuedeserdefinidacorno
un cultivodemicroorganismos
adheridos a un soporte slido poroso y humedecido en el cual el medio lquido est extendido en una capa muy fina en contacto con una interfase area. Las bacterias, levaduras y hongos slida, pero
son los microorganismos que
pueden crecer en fermentacin cabo con hongos
la mayora las de investigaciones llevan se a
filamentosos. El crecimiento en forma de micelio y su tolerancia a bajas actividades de agua y condiciones de alta osmolaridad hacen que los hongos sean la microflora natural ms adecuada para la fermentacin slida. El modelo de crecimiento miceliar da una ventaja adicional los hongos filamentosos a sobre los microorganismos unicelulares en la colonizacin de la matriz slida y en la utilizacin de los nutrientes del medio de cultivo. If1 modelo bsico de crecimiento de
los hongos es una combinacin del crecimiento apical con la generacin de nuevas
hifas por ramificacin. Mientras que el crecimiento apical se lleva a cabo de manera lineal, la ramificacin se lleva a logra una alta velocidad cabo de manera exponencial y como resultado se de cubrir
de crecimiento y una capacidad gran
eficientemente la superficie de cultivo. La estructura de la pared celular unida al crecimientopor las puntas y la ramificacin da a los hongos una estructura slida y firme que les permite penetrar en el interior de la matriz slida. Las enzimas hidrolticas son excretadas por las puntas de las hace la
hifas sin que se diluyan como en el caso de la fermentacin lquida lo que
accin de las enzimas hidrolticas muy eficiente y les permite penetrar en la mayora
18
de los substratosslidos,
lo que aumenta laclisponibilidadde
los nutrientes del
interior de los substratos (Raimbault, 1998) Existe un graninters enla utilizacin de A. niger para transformar desechos de la
agroindustriales en productos bioqumicos valor de comercial, medio por
fermentacin slida (FS), porque se ha encontrado que durantela FS se manifiestan caractersticas fisiolgicas diferentes en los microiorganismos en comparacin con la
FL. Entre los productos comerciales importantes, encuentran ms se algunas
enzimas que sonexcretadas al medioycuyaproduccinpor forma muy disminuida debido a
FL sepresenta en
los fenmenos de represin catablica (Ramesh y
Lonsane, 1991a; Sols-Pereira y col., 1993). A veces, las enzimas producidas por FS tienen caractersticas modificadas, como aumento su un en menores tiempos de produccin y mayor actividad (Hesseltine,1972; temorresistencia, Moo-Young y
y
col., 1983; Tengerdy, 1985; Grajek y Gervais, 1987; Pandey, 1992; Shankaranand col., 1992; Sols-Pereira y col., 1996; Acua-Argelles y col., 1995).
Los efectos que se derivan de la utilizacin de FS sobre los microorganismos son mltiples como modificaciones en el transporte cle azcares, la composicin de la pared,lamembranacelulary en laactividadenzimtica(Grajek
y Gervais,1987;
Pandey, 1992). Mientras que las bacterias y las levaduras requieren de alta actividad de agua (A, > 0.98), los hongos filamentosos pueden crecer con valores de
Aw tan
bajos como 0.85, y por esta razn, son microorganismos muy bien adaptados para la fermentacin slida. Pandey (1992) sugiere incluso queun bajo nivel de Awfavorece lagerminacin y el crecimientomiceliarde 1998)
los hongos(Pandey,1992;Raimbault,
De acuerdo con Raimbault (1998) el soporte de la fermentacin slida debe cumpllr con varios requerimientos como son: Poseer una matriz porosa que puede ser biodegradable o inerte, y requlere presentar una gran superficie de rea por volumen dentro del rango de lo3 o lo6 cm2/cm3que permita el crecimiento microbiano en la interfase slido-lquido. Debe absorber agua en una o variasvecessupropio peso conunaactividad de aguarelatrvamente de los
grande en la interfase slido-lquido para poder permitir una alta velocldad procesos bioqumicos.
La mezcla de oxgeno con otros gases y aerosoles deben pasar a traves del cultrvo conrelativafacilidad, la superficie slido-lquido debe ser un buen hbltatpara
permitir el crecimiento de microorganismos quec6ecen rpidamente como bacteriasy hongos. La matriz slida debe resistir la compresitjny un mezclado suave que podria requerir cada tipo de fermentacin. Esto requiere particulas pequeas que no tiendan a unirseunas a otras. La matriz slida debe estar libre de contaminantes y de inhibidores del creclmiento
y granulosas
de los microorganismos y debe ser capaz de absorber o contener substratos para el crecimiento microbiano como carbohidratos, fuentes nitrgeno y sales minerales de Estas condiciones son cumplidas por la mayora de los soportes naturales utilizados en la fermentacin slida como el bagazo de caa, el salvado de trigo. etc Existen tambin soportes inertes que cumplencon estos requenmlentos y que se han utilizado para poliuretano. la fermentacin como slida
la amberlita y, especialmente. el
Diferencias entre fermentacidn slida y fermentacin lquida.

A partir del conoctmiento de las diferencias fsicas existentes entre ambos sistemas
de fermentacin. es poslble definir algunas diferencias entre ambos tipos de cultivo y

SU
papel sobre la fisiologa de crecimiento de Aspergillus niger. muy diferentes entre
a) Los coeficientesdifusin de efectivos pueden ser
fermentactn liquida y fermentacin slida, porque la relacin rea/volumen del medio liquldo generalmenteesvariosrdenesdemagnitudmenorqueen
la
delgada capa de agua extendida en soporte poroso se da en la fermentacin que soltda En un matraz Erlenmeyer de
125 ml con 25 ml de lquido, la relacin a/v
en la interfase es del orden de 1 cm2/cm3.En cambio si tal lquido se extiende en una capa delgada y uniforme de un espesor cercanoa las 50 micras, el cociente
a/v= 200 cm2/cm3. Debidoaque
el transportedeoxgenodepende
de este
cociente. se puede Inferir que ser ms rpido para para la fermentaan lquida. b) Los tlempos de mezclado sern mucho menores en liquldo agitado.Enformatpica, tendr un tlempo de mezclado
la fermentacin slida que
el medio lquido que en el

200 r.p.m.
un matrazErlenmeyeragitadoa de unos pocos segundos, mientras que
en una
lmina de lquido no agitado, el tiempo de mezclado depende de la difusin de

los solutos y tipicamente est dada por el cociente, L2/D~20, siendo L la distancia
promedio. entre los cmulos de esporas sembradas, que en el medio de cultivo podran estar separadas en forma tpica, por distancias aproximadas
1000 mlcras. El coeficientededifusindelaglucosaenaguaes
de 100 a
D= 6*106
cm2/seg. El tiempo de mezclado resultante estara en
el intervalo de I O * a l o 3
21
seg. Esta diferencia fsica indica que sera
ms fcil formar microgradientes de
solutos en la FS que en la FL, como, por ejemplo, gradientes de concentracin de substratos, productos, enzimas excretadas al medio. Esta propiedad es muy
usada para medir la potencia de excrecin de productos en pruebas de halos de inhibicin por antibiticosy halos de actividad enzimtica. c) forma La de crecimiento tpica para cada sistema de fermentacin muy es
diferente en FL y
FS.En forma tpica Aspergillus niger produce pellets cuando se
cultiva en FL con substratos de fcil asimilacin, en cambio, en FS, tpicamente crece como micelio disperso con una apreciable proporcin de la biomasa tipo de areo. Estas diferencias, conocidas desde hace mucho, sugieren que fisiologa la de crecimiento y metabolismo entre fermentacin slida lquida puedenser muy y grandes para cada uno de los sistemas de cultivo. Adems, pelletsdevarios activadebido es sabido que los biomasa
mm de dimetroslotienenunadelgadacapade
a los problemasdifusionalesensuinterior(Pirt,
1975), lo que
podra resultar en an mayores diferencias fisiolgicas entre ambos sistemas de cultivo.
Por lo tanto, en este estudio comparativo de produccin de enzimas de Aspergillus la

niger entre FL y FS deben de tomarseencuentaestasdiferenciaspara poder
analizar y en su caso, explicar las posibles variaciones de productividad enzimtica en cada medio de cultivo, y es importante estudiar dichas diferencias fisiolgicas, usando coeficientescinticosdecomparacinrelacionndolos microscpicas del crecimiento del micelio. con observaciones
22
Poliuretano
Un novedoso mtodo fermentacin estado de en sohdo se ha desarrollando
utilizando espumas de poliuretano (PUF) como soporte Inerte Impregnando sobre I un mediodecultivo lquido sinttico, donde sesimula la cornposicion nutricional y
condiciones de cultivo que anteriormente se llevaba a cabo en salvado de tngo. Con este sistema, la biomasa, que es un parmetro limportante para la evaluacin de la
fermentacin en estado slido puede ser medido directamente (Zhu y c o l . . 1994). El PUF anteriormente fue utilizado por Fujishima1972. en En1994Zhu para la produccin
y c o l . . utlllzaron PUF para
enzimtica de varias especies de hongos.
producir nucleasa P1 de Penicillium citrinium. Desde entonces
el PUF ha sido
utilizado ms como un proceso de inmovilizacin celular que como un proceso limpio de produccin enzimtica para la bsqueda de dliseo de (inmovilizacin, detoxificacin, obtencinde metabolitos). La composicindelmediodecultivoesfactorimportanteyaqueinfluye diversidad y la calidad de las enzimas. La produccin de enzimas en medio con medios de cultivo sintticos impregnados sob're soporte Inerte, permite elcomportamientode mediodecultivo, sobre la slido estudiar reactores ms eficientes
los hongosfilamentososconrelaclna
la composicin del
la influenciadelaactividaddelagua,
la Ilberacin de calor, as
como la influencia de la transferencia de gases. L.a recuperaan de metabolitos en stas condiciones obtener un se realiza por prensado lo qlue permlte producto
concentrado. En cultivos slidos en los cuales el soporte es tamblen el substrata, es dificil evaluar la influencia un de
solo factor sobre el comportamiento un de
microorganismo ya que en gran parte, estos substratos son muy complejos y dada SU
23
composicin se dificulta la determinacin de en cultivos slidos (Orioly col., 1988). Lacomposicindelpoliuretanoloconvierte
los diferentes parmetros importantes
en unmedio ideal para el cultivo de
hongos al permitir el crecimiento del hongo sobre las trabeculas que se forman en la espuma, adems el poliuretano no atrapa el agua, por lo que no disminuye la Aw del medio de cultivo y no compite conel organismo por el agua libre. La espuma atrapa una gran cantidad de aire
lo que permite al hongo crecer en un
medlo rico en oxgeno. A no serbiodegradablenoproduceefectossecundarios I sobre la induccin o secrecinde
las enzimas y permitedeterminarde
manera
adecuada la biomasa producida por el microorganismo. Nosotrosusamospoliuretanocomosoporteinertea realmenteestpasandodurante el cultivode fin de poder medir
lo que
Aspergillus niger enfermentacin
este permite regular perfectamentepresencia la slida. El uso de soporte inductores que determinanproduccin enzimas. ventaja la de Otra poliuretano es no biodegradable, lo que permite llevar a es que
de el
cabo la determinacin del
peso seco real del hongo por gravimetra. La tercera ventaja est en la porosidad del material, que permiteque fcilmente utilizado el por hongo
los espaciosdelpoliuretanosellenen
de aire que es
y que cumple todas requerimientos con los
estipulados Raimbault 998) por (1 como necesarios un para soporte inerte fermentacin slida. Este trabajo representa estudio un sobre filamentoso en soporte slido inerte.
la metodologia cultivo de
de
de hongos
24
Sacarosa
La sacarosa, comnmente conocida como azcar mesa, un de es disacrido compuesto por molculas de a-[>-glucosa y p-D-fructosa unidas por enlaces a-l,4glucosdico. Cuando este enlacees roto, mediante una reaccin hidroltica, se liberan cantidadesequimolaresdeglucosa y fructosa.Esta mezcla demonosacridosse
llamaazcarinvertida,estosederivadelhechoquelasacarosadesvalaluz polarizada hacia la derecha (dextrorrotatorio) + 6 . 1 ,mientras que los productos de 6.5' hidrlisisrotan la luzpolarizadahacialaizquierda(levorrotacin)
- 0 ' parala 21
mezcla (52.1' paralaD(+)glucosa
y 92.1' paralaD(-)fructosa).Otrosdisacridos
comunes son la maltosa y la lactosa. La sacarosa es hidrolizada por
la enzima invertasa o sacarasa de acuerdo con la
reaccin que se presenta a continuacin.
Sacarosa + H20 ---> glucosa + fructosa.
Esta reaccin es de gran inters para las industrias de bebidas y confites, porque el azcar invertido es ms dulceque la sacarosa, adems, no se cristaliza y por ello es posible usarlo como jarabes concentrados estables, que de paso, tienen el doble de osmolaridad que los jarabes obtenidos como soluciones de sacarosa.Por esa razn, lahidrlisis de la sacarosa ha sido estudiada desde hace mucho tiempo
y en
especial, desde principios del siglo XIX, ha sewido como modelode mediada por la enzima sacarasa, o ms comnmente, invertasa.
la catlisis
25
lnvertasa El nombre oficial de la invertasa es S-fructofuranosidasa (EC3.2.1.26). Esto implica
que la reaccin catalizada por esta enzima es la hidrlisis de residuos terminales no reductores fructofuranosidos de p-fructofuranosidols. Esta reaccin es compartida por la a-D-glucosidasa, adems sacarosa la puede intewencin de la invertasa. La invertasa se utiliza principalmente en la indust.ria de alimentos (confitera) donde
la fructosa es preferible a la glucosa debido a quie es ms dulce y
hidrolizarse en medio cido
sin
no cristaliza tan
que la glucosa
fcil. Sin embargo uso el de
la invertasa limitado es debido a
isomerasa puede ser utilizada para convertir directamente la glucosa fructosa a un en costo ms bajo. Para el uso dela invertasa en alirnentos se requiere de una protena altamente purificada, afin de no alterar el sabor y preservar la salud de las personas. La invertasa es producida por una gran variedad de organismos que pueden utilizar la sacarosa como fuente de carbono. En el mbito comercial la invertasa se produce principalmente por de cepas levaduras cornlo Saccharomyces cerevisiae o mismo cultivo de invertasa pesa
Saccharomyces carlsbergensis (Carlson,1987).Andentrodel
levaduras existen diferentes especies invertasa. ejemplo, de Por la intracelular tiene un peso de 135 KDa, mientras que la invertasa extracelular
270 KDa (Gascon y col., 1968; Gascon y Lampen, 1968; Carlson y Botstein, 1982).
Contrariamentealamayorade
las enzimas,lainvertasa
es muy tolerantea
los
cambios de pH, presentando una actividad relativamente alta entre pH
de 3.5 a 5.5
con el mximo a pH 4.5. La actividad mxima se alcanza a 55OC. Los valores de Km
26
varan mucho de una especie a otra pero la mayora se encuentran entre 2 mM a 5 mM, con un valor tpico de 3 mM parala enzima libre (Boddy y col. ,1993; Chen-Tien y col., 1994; Chen y Lui, 1996). La invertasa es una enzima que es producida por plantas y microorganismos,en los ltimos aos esta enzima ha recibido mucha atencin como un buen modelo para el estudio de enzimas glucosiladas secretadas por levaduras y hongos filamentosos que tienen como inductores de la sntesis de esta enzima alos azcares, sacarosa y la rafinosa
los cuales tambin funcionan substratos la corno para invertasa
extracelular de Aspergillus niger (Mukherjee y Sengupta, 1985; Quiroga y col., 1995; Perez y col., 1996). Se ha estudiado recientemente la produccin
Aspergillus nidulans en los siguientes reportes:
de! invertasa por Aspergillus niger y
Andres y Peberdy (1974) encontraron que la invertasa de Aspergillus nidulans fue localizada el enmedio cultivo de
y en la1 fraccin micelio de
lavado. La
comparacin de sus constantes cinticas les permiti determinar que se trata de la misma enzima.AI parecer la enzima est IocAizada en el espacio intramural, al igual que en Neurospora crassa. La glucosa presenta un importante papel en la represin de la produccin invertasa en A. niclulans. El micelio crecido en medio con glucosa present represin catablica y produjo 6 veces menos invertasa que
el micelio crecido en sacarosa. Altas concentraciones de glucosa produjeron una
dilacin en el tiempo de produccin de la invertasa, pero al disminuir la cantidad de glucosa en el medio de cultivo se inicila produccin de la invertasa.
27
Vainstein y Peberdy (1990)encontraron
qule aproximadamente el 50% de la
invertasa total producida por Aspergillus nidukms en FL est asociada al micelio y parece estar localizada en el espaclo penplsmlco. De sta, aproximadamente el 60% puede ser liberada por tratamiento mecnlco del mismo. El resto se libera
por accin de qumicos comoel DTT y la proteasa K. La liberacin de la invertasa por accin mecnica, por la accin de agentes reductores o por la proteasa K, les permite suponer la que invertasa fsi(camente esta confinada periplsmico en lugar de estar asociada a la piared celular. Boddy y col. (1 993) purificaron la invertasa de Aspergillus niger y localizaron dos genes de expresin de esta enzima. Encontraron que la actividad ptima de la en el espacio
invertasa se lleva a cabo a un pH de 5.5, y 5OOC. Su peso molecular fue de 115 KDa, mientras que el peso nativo fue de 225 KDa, AI parecer el 50% de la masa molecular est formada por hidratos de carbono. Chen y col. (1996) purificaron dos invertasas de Aspergillus nidulans producidas
por fermentacin lquida. Estas invertasasse sintetizan al parecer del mismo gen. Las invertasas presentaron caractersticas muy parecidas y se diferenciaron por presentar un patrn de corrimiento en electroforesismuydiferente.Una pesa
alrededor de 135 KDa y la otra alrededor de 250 KDa. AI parecer, la diferencia en el peso se debe la presencia de una gran cantidad de glucosilacin uno de los en tipos moleculares. Wallis y col. (1997) reportaron que Aspergillus niger produce dos invertasas que Se Secretan y quepresentancaractersticas muy semejantes, an cuandoson
sintetizadas a partir de dos genes diferentes. Se les diferencia por la cantidad de

28
glucosilacin que contienen, aunque, no queda claro responden a diferentes condiciones de cultivo.
si se trata de genes que
Proteasas
Los hongos filamentosos son
capaces de secrletar cantidades muy la degradacin stas de por grandes de las proteasas
protenas al medio de cultivo, pero
secretadas al mediodecultivodisminuyeengran cultivos (Archer, 1994). Se han buscado variosmtodosparadisminuir cultivos de hongos filamentosos.Unodeellos utilizadaparadisminuir
medida el rendimiento de los
la secrecindeproteasasen
es la inmovilizacin,que
los
ha sido
la produccindeproteaslasporLiu
y col. (1998), quienes
demostraron que al cultivar Aspergi//us niger sobre partculas metlicas recubiertas con ltex se secretaron menores cantidades de proteasas y mayores cantidades de glucoamilasa. Desde 1993, RamamurthyyKothari,mostraronquealcultivar superficie produjeron se menos proteasas que lquida.Porotraparte,
los trabajosdeAguilar Rhizopus sp,
en
en los cultivos fermentacin en

y Diaz-Godnez(comunicaciones
personales), dado han indicaciones que de
al cultivar a
Aspergillus niger en
fermentacinslidasesecretaronmenorescantidadesdeproteasasal cultivo.
medio de
Antecedentes.
A continuacin se presenta un resumen de los trabajos que comparan la produccin
de metabolitos en fermentacin slida y liqulda y que se han publicado durante los ltimos aos: Ramesh y Lonsane, (1991a) cultivaron Bacillus lichenifomis en fermentacin lquida
y slida para producir a-amilasa y compararonambos tipos de cultivo. En FL se
produjeron 480 U/ml de extracto a las 60 horas de cultivo y al aadir 1YO de glucosa al medio de cultivo solo se obtuvieron 30 U/ml. Mientras que en fermentacin slida se produjeron 13860 U/ml de extracto a las borlas de cultivo. 48
El anlisis de la concentracin de glucosa libre en ambos medio dio un 0.2% en FL

contra un 8.5% de glucosa libre en el salvado de trigo donde se llevo a cabo la FS, esto es una concentracin 42 veces mas alta de glucosalibre en FS comparada con
FL.
La presencia de 1% deglucosaen
el mediodecultivodisminuy
en un 84
OO /
la
produccin de a-amilasa en FL. La produccin de a-amilasa fue 29 veces mas alta que en FL, la productividad enzimtica de la fue 36 veces ms altaque en la FL. FS
La presencia de una alta concentracin de substrato sin represin catablica,permite
la produccin de altos niveles de enzima productividad del medio slido
y por lo tanto es la responsable de la alta
Posteriormente Ramesh y Lonsane, (1991b) estudiaron el efecto del tipo de cultivo sobre represin la catablica de
lichenifomis. Encontraron que
la produccin de a-amilasa
la presencia mas de
por Bacillus
de 1% de glucosa
inhibi
30
225707
totalmente la sntesis de a-amilasa en FL, mientras que al aadir un 15% de glucosa se incremento en un 50% la produccin de amilasa de la FS. en FS no se observ efecto de represin, y esta cantidad de glucosa acort el tiempo de produccin de 71 a 48 horas. Formulan la hiptesis que en la FS s8 forman gradientes en la vecindad del organismo debido a la falta de mezclado, dle tal manera que la concentracin
local de substrato es menor ala real. Por lo que el organismo puede desarrollarse sin
represin catablica. Sols-Pereira y c o l . (1993) compararon la produccin de pectinasas por Aspergillus

niger enfermentacinslida
y lquida.Aadieronconcentraciones
3.5 a 10% de
sacarosa, glucosa y cido galacturnico al medio de carbono. Con adicin de 3.5% la de monosacridos se inhibi la produccin de endopectinasa, pero en fermentacin slida la adicin de hasta un produccin de pectinasas exopectinasas queenla
10% de monosacridos result en el incremento de la
19 veces endopectinasas mas
y 4.9 veces mas
FS controlsinmonosacridos.Seacumularonazucares de en el
reductores en FL, pero no se acumularon en FS, encontraron que la produccin pectinasas estarelacionada con la concentraci6ndeazcaresreductores
medio de cultivo.Atribuyeronestasdiferencias
a lafalta de mezcladoen FS y a
problemas de difusin de los nutrientes en FL, un papel importante a la presencia de altos niveles de azcares reductores que producenrepresin catablica en FL y que
no estn presentes en FS.
Antier y col. (1993) obtuvieroncepasde
Aspergillus niger sobreproductorasde

y fermentacin liquida. Las
pectinasas especializadas fermentacin para s6lida
31
cepas sobreproductoras en fermentacin slida resultaron productoras mediocres en fermentacinlquida y viceversa. Esto sugiere l idea de lapresenciadegrupos a genes bajo regulacin pleiotrpica que le permiten a las cepas presentar resistencia 2DG a y una menor represin catablica en la produccin de pectinasa
especializadas para FS yFL . Lekha y Lonsane (1994) compararon la produccitjn de tanasa por
Aspergillus niger
en FS sobre bagazo de caa,FL, fermentacin lquida superficial. Encontraron quela produccin de tanasa en FS fue de 150 U/ml a las 96 h de cultivo, mientras que en FL obtuvieron 50 Ulml a las 144 h de cultivo, la produccin de tanasa fue cerca de 3 veces ms grande en FS que en FL, y se necesito menor tiempo para obtener la
produccin mxima, por lo que la productividad de FS fue 5 veces mayor que la de FL. La tanasa producida en fermentacin slida fue totalmente extracelular, mientras que fue totalmente intracelular en FL durante las primeras 48 horas de cultivo. La
tanasa obtenida por FS present una mayor estabilidad a temperaturay pH extremo que las producida por FL. Atribuyeron estas diferencias a cambios en la expresin y conformacin de las protenas, as como a una secrecin activa la tanasa en FS. de Acua-Argelles y col., (1995) compararon la produccin de pectinasas por A. niger en fermentacinlquida y fermentacinslidasobre bagazo decaa.Losttulos
enzimticos fueron 3 a20 veces ms altosy se obtuvieron entre 24 y 72 horas y ms rpido en FS que en FL, la FS result ser entre 6 y 51 veces ms productiva que la
FL, dependiendo del tipo de enzima. Atribuyen estas diferencias a
la presencia de
altas cantidades de azcares reductores en la FL, no se acumulanen la FS y por clue
32
ende suponen la existencia de represin catablica en lquido que no se presenta en slido. Lapadatescu yBonnarme, (1999) compararon la1 produccindearomatizantespor
Bjaerkandera adusta
en fermentacin lquida
y slida sobre salvado trigo. de
Obtuvieron la mxima produccin con 0.34 @Kg de materia hmeda a los 4 idas en FS y 0.04 g/l de medio a los 8 das en FL. La prloduccin result ser casi 10 veces mayor en FS y la productividad de los cultivos de fue 27 veces ms altaque la de IFS
los cultivos de FL. Atribuyeron el buen comportamiento del hongo en FS a que las
condiciones de cultivo son muy parecidas a las de su habitat natural. De los trabajos anteriores se puede extraer siguiente informacin relevante: la FS 5. La produccin de metabolitos en es mayor y los picos se obtienenen menores tiempos de cultivo. Por lo tanto los cultivos de FS son mas productivos que los de FL, pero las razones de esto son desconocidas.
6. La menor represin catablica en FS se asociia con la mayor productividad este
tipo de fermentacin.Aunquesedesconoceelnivel resultado.

7. La presencia
de participacin en este
de azcares reductores en
FI- y su ausencia en
FS ha sido
en la
relacionada varios por autores
con las diferencias que se presentan
represin catablica de ambos sistemas de cultivo.

8 . La formulacin de la hiptesis de que las diferencias entre FS y FL podran estar
relacionadas con las formacin de gradientes en FS.
33
9. El que todos estos trabajos sido han llevados sobre cabo soportes a blodegradables. Esto impedido ha crectmlento y produccln enzimtica. la obtencin parmetros de cinticos de
Justificacibn Las cttas antenores reportan muchas ventajas de la
FS sobre la FL, pero se dan
tambten una serte muy amplia de posibles explicaciones. De acuerdo con Pandey y col. (1999). es clara la ventajade la FS sobre la FL, pero hasta el momento se ignora cul es la razn exacta de esta mayor productividad de la FS. Esta diferencia puede deberse mayor a una productividad la de biomasa, mayor a un rendimiento enzlmatlco porgramo de biomasa,aunamenordesrepresincatablica
o a la
combmactn de vanos de estos factores. Saber cul
es el origen de las diferencias
ms Importantes entre ambos sistemas de cultivo puede ser de gran inters para el diseo, operacin y mejoramiento de la produccicin, pero la falta de estudios bsicos de la
FS, comounadeterminacindirectade
los parmetrosdecrecimiento
produccin enzimtica ha impedido que se determine de manera clara cuales son las razones de la mayor produccin enzimtica en este sistema de cultivo. Por esto en este trabajo nos proponemos responder a cual 'de estas posibles razones
principales para explicarlas diferencias reportadas entre y FL. FS
son las
La seleccln del sistema modelo de la produccin de invertasa por Aspergillus niger, para el estudio de las diferencias existentes entre FL y FS, se bas en los siguientes
hechos
34
" "
Aspergillus niger esunhongofilamentosoqueseempleaampliamentepara

obtencin de enzimasycidoctrico
la
a nivelindustrial.Ademhs,
es unorganlsrno
modelo muy utilizado para e estudio del crecimiento y la secrecin de enzlmas por l hongos filamentosos. La invertasa es una enzima modelo muy adecuada para el estudio de la produccln y secrecin enzimtica. Ha sido estudiada a fondo durante los ltimos aos. se conoce la secuenciacompletade
los dos genesdeinvertasade
Aspergillus mger y se
conoce que en condiciones normales solo se expresa uno de estos genes.
Objetivos
Describir y comparar el crecimiento, produccin enzimtica substrato en
y consumo de
Aspergillus niger durante su cultivo en fermentacin liquida y
fermentacin slida. Documentar y comparar el tipo y las condicioines de cultivo de Aspergillus niger crecidos en fermentacin lquiday fermentacin slida.
36
Hiptesis
Se supone que
la mayor productividadla de fermentacin slida
sobre la
fermentacin lquida, es debida principalmente una mayor y ms rpida produccin a de biomasa en fermentacin slida, dando como resultado acumulacin de enzimas hidrolticas en medio dle cultivo. el un mayor y mas rpida
37
Material y Mtodos
Microorganismos:Seutilizarontrescepasde
Aspergillus nlger. C28825 que fue
y recolectada de un cafetal de Chiapas seleccionada como productora de pectinasas
por Boccas y col. 1994); Aa20 proveniente del cepario UAM-IRD y la cepa sllvestre N402, ampliamente utilizada como modelo cepa para estudlar la genetica de
Aspergi//us niger (80s y col., 1988). Todas las cepas fueron mantenidas en wales de
resiembra con medio PDA a 4 C y se resembraron cada 4 meses. Los cultlvos para O inculo se cultivaron en PDA durante las 72 horas previas a las fermentaclones
Medios de cultivo: Se formul el medio de cultivo en (Pontecorvo y col.1953)modificadode
base al medlo de Pontecorvo
la siguientemanera, NaN03 15.0, KHzP04
1.76, KC1 0.76, MgS04 0.76, FeC12 0.001, CuSO, 0.001, MnCl 0.001, ZnCl 0.001 en g/l. El pH del medio se ajust a
4.5 y se aadieron 100 g/l de sacarosa, el medio
completo se utiliz diluido hasta ajustar la concentracin iniclal de sacarosa a 6.25, 12.5, 25, 50 y 100 g/l. el medio se esteriliz a 1O PSI por 15 mlnutos La inoculacin se realiz con 2 x
lo7 esporas por gramo de fuente
de carbono. El mismo medio
inoculado se reparti enlos cultivos lquido y slido.
Fermentacin Lquida: La fermentacin lquida se realiz en matraces Erlenmeyer de 125 ml de capacidad, llenos con 25 ml de medio ya inoculado Se incubaron a 3OoC en una incubadora orbitala 200 r.p.m. por el tiempo requerido
38
" "
FermentacinSlida:
25 ml medio de inoculado mezclaron se con
1 gramo de
poliuretano estril preparado como se describe adelante dentro de un matraz de miis Erlenmeyerde cosecharlos.
250 mi. Seincubarona 3OoC por el tiemporequeridoantes
de
Preparacin del Poliuretano: La espuma de poliuretano con una densidad media de

17 Kg/m3, se comprde un proveedor comercial, se cort en cubos de 5mm por lado
y se lav dos veces con agua caliente. El poliuretano ya lavado se escurri se sec y
en un horno a 70 C durante toda la noche. Posteriormente, se introdujo 1 gramo de poliuretano seco en cada de uno los matraces Erlenmeyerse y esteriliz en
autoclave a 15 psi por 15 minutos.
Determinacin de la Biomasa en Fermentacin Lquida: Los cultivos de fermentacin lquida se retiraron en los tiempos adecuados y se filtraron a travs de papel filtro
Whatman No. 1; la biomasa retenida se lav con 1O m de agua destilada y se sec 0 1 en el horno a 7OoC, ocasionalmente una cuarta parte utilizparadeterminar de la biomasa se retir y se
la actividad de invertasaintracelular, en estos cultivos la medio de la fraccin usada para la determinacin de la
biomasa se determin por biomasa seca.
Determinacin de la Biomasa de Fermentacin Slida: El poliuretano utilizado para el crecimiento del hongo se extrajo del matraz y se presion para obtener el extracto de
39
fermentacinslida;estepoliuretanolavado fraccin de pesosecopertenecientea gramo en pesofresco
SE! seca
7OoC, paradeterminarla
la biomlasa. Ocasionalmentese utiliz un

y se
del poliuretanoparadeterminaractividadintracelular
procedi igual que enFL.
Determinacin de la Evaporacin del Medio de Cultivo en fermentacin slida: Se prepararon 4 matraces de peso seco conocido con un gramo de poliuretano estril,
se les aadieron 25 ml de medio estril a dos de ellos y 25 ml medio inoculado a otros dos. Se determin el peso total al inicio y c;Bda 24 horas hasta las 72 horas de cultivo. Al final se extrajo el poliuretano, se lav con
50 ml de agua destilada y se
determin la cantidad de biomasa producida.A partir de estos datos se determin la y cantidad de agua evaporadaen los matraces con sin micelio.
Extraccin de Enzimas: Los extractos de fermentacin lquida se filtraron a travs

No. 1. El filtradoseensayfrescoparadeterminar
de papel filtro Whatman
la actividad de invertasa. La
enzima de FS se extrajo por presin suave del polliuretano. lquido se filtr a travs El de papel filtro WhatmanNo. 1. El filtrado se utiliz fresco para determinar actividad la de invertasa.
ExtractosIntracelulares:
Los extractosintracelularesseobtuvieron
congelando el
micelio o el micelio ms el poliuretano y molindolo en un mortero fro hasta obtener un polvo fino que se resuspendi en buffer fro de acetatos
0.1 M (pH 5 4 , la parte
40
soluble se separ por filtracin se ensay en menos de horas. A la parte insoluble y 6 se le determinlaactividaddeinvertasasinencontraractividadsignificativa ninguno de los dos sistemas de cultivo. en
Ensayos Enzimticos: Laactividaddeinvertasasedeterminpormedio reductores, los cuales se determinaron por de la liberacindeazcares DNS (Miller, 1959). Las condiciones de
ensayo fueron 30 minutos a 3OoC, , 0.1 M de sacarosa 0.35 ml, buffer de acetatos O.?
M con pH 5.5, 0.5 ml y se utilizaron 0.15 ml de extracto enzimtico diluido
de ser
necesario. Una unidad enzimtica se defini como la cantidad de enzima necesaria para liberar un micromol de azcares reductores por minuto.
Aspartato-amino-transferasa: La
Aspartato-amino-transferasa se determin por

como
medio de un kitenzimtico de Manhiem Boherinlger. Estaenzimaseutiliz marcador de protenas intracelulares en medio extracelular. el
Determinacin de Actividad de Proteasas: Las proteasas se determinaron acuerdo de con el mtodo de Chavira y col. (1984) por medio de la liberacin del grupo azo del azocoll (Sigma, USA) se incub a
3OoC por 15 minutos en un mililitro de buffer de
acetatos 0.1 M pH 4.5 y 50 microlitro de azocoll con 200 microlitros de extracto, una unidad se define como la proteasa necesaria para incrementar la absorbancia de la mezcla de reaccin en0.01
Determinacin de Azcares Residuales: Se utili26 un
kit enzimtico de Boehringer-
Mannheim, No 716-260 para poder determinar los niveles de sacarosa, glucosa y fructosa en los extractos de fermentacin.
Clculo de Variables de Crecimiento: La velocidad de crecimiento(p) se estim por medio de ecuacin logstica: la
X =X 1 [ / ,
+ C*exp (-@)I
Donde, C = (X,,,-X,)/X,,
siendo X, el valor puntual de la biomasa, X (gX/I), el valor .
inicial de biomasa en (gX/I), Xmax el valor mximo de biomasa (gX/I), p, la velocidad especfica de crecimiento (l/h) y t el tiempo de cultivo(h). Para estimar el valor de 1.1 se ajustaron los datos experimentales por la minimizacin de la sumade
los errorescuadradosusandounalgoritmoNewton-Raphson
de
optimizacin presenteen el programa E c l de Ofifice Microsoft. xe
El rendimiento de enzima por gramo de biomasa producida (YEM=u/gx), se estim
considerando a YWX AUAX. Donde, E es la produccin enzimtica en U/I y X es la = produccin de biomasa en gX/I. Se ajust una recta a los datos experimentales por el mtodo de mnimos cuadrados.Solo se consideraron adecuados los ajustes con una
R2 mayor a 0.85.
La productividad enzimtica (P=U/lh). fue estlmacla en termino del lquido empleado en el valor pico de producci6n enzlmtlca en ambos tipos de cultivo cada una de para las cepas.
El rendimientodebiomasa
por gramodesubstrato
consumido (Yxls=gX/gS),se la cantidad de substrato
calcul dividiendo biomasa la maxlma obtenlda entre consumido por el hongo durante lafermentaaon.
La tasa especfica de consumo de substrato (qs=gS/gXh), se calcul al de dividir el valor de lap entre YXJS para cada unode los cultlvosanalizados.
La tasa especfica de produccion enzimtica
q p (U/gXh), se calcul por el producto
de el valor de la p por el valorde la YE/Xpara cada uno delos cultivos analizados.
Los resultados presentados en la tabla 3.2.3 se compararon por anlisis de varianza

de una sola va ( prueba de F) con dos nlveles dle significancia estadstica pc0.01 ** muy significativa (**)( y ~ ~ 0 . 0 5 slgnlficatlva (.). consideraron no significativas. El resto de las diferencias se
Microfotografas: Las microfotografias se obtuvieron por medio de unfotomicroscopio

NIKON modeloHFX-DX,dotadodeIluminacinporcampoclaro,
interferencia de
fasesiluminacln e Indirecta fibra por ptica. fotografas tomaron Las se ampliaciones de SOX a 400X. tal como se indica en cada imagen.
con
44
. "
1 _ _ 1
" .
.-
3 Resultados y discusin 3.1 Efectodelaconcentracininicial desacarosasobre la produccinde invertasa por Aspergi//us niger en fermentacin slida y lquida.
Se compar el efecto de la cantidad inicial de substrato sobre el crecimiento y la produccin de invertasa por Aspergillus niger en fermentacin slida y fermentacin
Iqu ida
Lafigura
3.1.1 sepresenta
la produccindebiomasa
por la cepa C28825 con

en fermentacin
concentracionesquevande liquida.
6.25 a 100 g/l de sacarosainicial
O
I
12
24
36 Horas
48 72
60
Figura 3.1.1 Biomasa producida por Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida diferentes con concentraciones de substrato inicial, los valores experimentales se representan como smbolos y los valores ajustados por la ecuacin logstica se representan como lneas continuas.
El cultivo con 6.25 g/l de sacarosa alcanz un valor de 1.6 g/l de biomasa mxima;
con 12.5 g/l de sacarosa inicial la biomasa se acumul hasta los 2.7 g/l; al aadir 25
g/l de sacarosa el cultwo acumul biomasa hasta 6.9
g/l; durante las primeras 60
horas de cultlvo, con 50 gA se observ que la biolmasa se acumul hasta un mximo de 11.3 g/l. con 100 g/l se obtuvieron 13 gll de biomasa. La biomasa seacumulentrelas24horas y las 60 horas en la mayora de los
cultivos y no se observaron diferencias delos tiempos de fermentacin, a pesar de la utilizac~n altas cantidades de sacarosa inicial como seria de esperar. Esto ya ha de sido reportado por Favela-Torresy c o l , 1996, quienes encontraron que al utilizar 50 o
100 g/l de glucosa inlclal en cultivos de Aspergillus niger no hay efecto sobre
los
tiempos de germlnacln por la alta concentracin de glucosa y solo los cultivos con 200 g/l de glucosa mostraronun retraso en los tiempos de germinacin. La figura 3.1.2 muestra la produccinbiomasala C28B25 de de cepa en
fermentacin slida con concentraciones de 6.25 100 g/l de sacarosa inicial. a Se obtuvieron 2.7, 4.7, 8.7, 14 y 33 g/l de biomasa mxima con 6.25, 12.5 25, 50 y 100 g/l de sacarosa inicial respectivamente. Los tiemposde fermentacin necesarios para alcanzar la biomasa mxima con todas las concentraciones sacarosa fueron de menores en FS (alrededor de las 42 horas) que en FL (alrededor de las 60 horas). Estos tiempos son parecidos a los reportados por Favela-Torres col, 1996, quienes y observaron que son necesarias 40 horas de cul1:ivo en la fermentacin slida y 60
horas en la fermentacin liquida para llegar a la mxima acumulacin de biomasa de
los cultivos utlltzando 50 y 100 gil de glucosa. Las curvas de crecimiento sontambin
muy pareadas a las reportadas en ese trabajo.
46
-.
35
30
h
-2 3
m
25
20
15
cn
O .-
m 10
O
O
12 24
Horas
Figura 3.1.2 Biomasa producida por Aspergi//us niger C28B25 en fermentacin los valores slida con diferentes concentraciones de substrato inicial, experimentales se representan como smbolos y los valores ajustados por la ecuacin logstica se representancomo lneas continuas.
36
48
En la figura 3.1.3 se presenta la produccin de irlvertasa por 6.25 a 100 g/l de sacarosa inicial.
Aspergillus niger, con
La actividad mxima de 215 U/I de invertasa se alcanzaron en el cultivo con 6.25 g/l de sacarosa inicial, con 12.5 g/l. Se obtuvieron 244 U/1, con 25 g/l se obtuvieron 350
U/I. AI utilizar 50 g/l de sacarosa se alcanzaron 500 U/I de invertasa y el cultivo con
1O0 g/l de sacarosa inicial produjo 1380U/I. El incremento con 1O0 g/l no corresponde
a lo esperado con la hiptesis de que una alta cantidad de sacarosa en el substrato inicial debe resultar una produccin en baja enzimtica debida a catablica.
la represin
O
!
12.
24
Horas
36
48
60
72
Figura 3.1.3 Produccininvertasa de por Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida con diferentes cantidades de sacarosa inicial. AI comparar esta figura con la de crecimiento se puede observar que el aumento en
la produccin de invertasa con 100 g/l es mayor al aumento
de la biomasa de los
mismos cultivos. De hecho parece que puede dividirse en dos grupos con el de 100 gll de sacarosacomouncultivo
sui generis, quenoparecepresentarrepresin
catablica, pero, si muestra limitaciones en la biomasa producida por el cultivo. Esto puedeexplicarsedeacuerdoconXu
y col.(1989) y Kubicek-Pranz y col. (1990)
quienes afirman que la presencia de 50 gramos o ms de una fuente de carbono de fcil asimilacin sacarosa como o glucosa la induce sntesis alta de una
la velocidaddela
concentracindeFru-6P.LaconcentracindeFru-6Pregula
gluclisis, lo que a su vez modifica la concentraclin de piruvato resultante, afecta la velocidad del ciclo de Krebs medio la por de regulacin de sintetasa.Cuandolaconcentracindepiruvato
ES
el cual la citrato
muyalta,
la Fru-6Pse
desvia
hacia el ciclo de las pentosas, y provoca la substitucin del ciclo de Krebs por el ciclo anaplertico del citrato, en el cual no se produce NADH. Todo utilizar a la gluclisis como fuente principalde lo anterior obliga a un mayor
ATP, lo queobligaa
consumo de glucosa y fructosa. Lo que de acuerdo con Nielsen, (1992) podra ser responsable de una produccin aumentada de invertasa en cultivos lquidos con alta concentracin de sacarosa o glucosa. En la figura 3.1.4 se presentan las curvas de produccinde invertasa por Aspergillus
niger C28625 conconcentraciones crecientes de s8acarosa inicial.
5000
n
4000
"m 0 0 0 3
u?
c1
2000
1 O00
S -
>
O
O
12
24 Horas
36
-_
48
Figura 3.1.4 Produccin de invertasa por Aspergi//us niger C28825 en fermentacin slida con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
Los cultivos con 6.25 g/l de sacarosa produjeron 220 U/I de invertasa, con 12.5gil de
sacarosa la produccin mxima de invertasa se alcanz con 713 U/I, en los cultivos con 25 g/l de sacarosa la invertasa lleg hasta 2128 U/I, con 50 g/l de sacarosa se
alcanzaron las 3460 U/I, al aadir 100 g/l de sacarosa inicial al cultivo se obtuvieron
4650 U/I de invertasa.
La figura 3.1.5 muestra la concentracindeazucares lquida.
residuales en fermentaen
. "
+6.25 "12.5 +25
* "IO
g 9 g
12
24
36 Horas
48
60
72
Figura 3.1.5 Concentracindeazcaresresiduales (Az Res)en cultivos de Aspergillus niger C28825 en fermentacin lquida con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
En la figura 3.1.5 se observa que durante la fase die adaptacin de los cultivos (24 h) elconsumo de sacarosafuemuybajo.Despusde consumida de manera continua
y se agot entre
este tiempo, la sacarosa fue las 60 y las 72 horas de

cas1
fermentacin.Esdeespecialintersindicarquelasacarosafueconsumida
totalmente en todos los cultivos, hasta en aquello:; con 100 g/l de sacarosa, ya que
en este cultivo el consumo de la substrato resulta muy alto dada la baja cantidad de biomasa que se produjo. En la figura 3.1.6 se muestra la concentracin fermentacin slida. de azcares residuales en
+6.25 gi -4- 12.5 gi
20 10
O O
12
24 Horas
36
48
Figura 3.1.6 Concentracindeazcares residuales (Az Res) en cultivos de Aspergillus niger C28B25 en fermentacin slida con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
El consumo de sacarosa en fermentacin slida se inici tras 12 horas, lo que podra

corresponder con el tiempo de germinacin de los cultivos. La sacarosa se agot alrededorde las 42 alas
48 horas en todos
los niveles desacarosa inicial. El
consumo total de sacarosa se llevo en menor tiempo en fermentacin slida que en fermentacin lquida y esto se correlaciona con 10s resultados presentados en esta seccin,donde
los cultivosslidos tienen unamayorvelocidad
de crecimiento y
51
mayores rendimientos de biomasa por fermentacin lquida. La figura
g de substrato
ms altos que en la
3.1.7 muestra los perfiles de pH cultivo de
de Aspergi//u niger en
fermentacin lquida con cantidades crecientes de sacarosa inicial.
7
I
i
I
4.5 4
ix
'
) a
3.5
3
~
i
I I
~
2.5
12
24
36
Horas
48
60
72
Figura 3.1.7 Perfil de pH de cultivos de Aspergilhs niger C28825 en fermentacin lquida con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
Puede observarse que todos los cultivos presentaron un descenso en el valor de pH durante el tiempo de cultivo, y esta disminucin es; mayor al aumentar de la cantidad desacarosainicial.Enespecial
os cultivoscon 50 y 100 g/l desacarosa

los tiempos finales
inicial de
mostraron una mayor disminucin durante del pH
fermentacin. Este comportamiento, unido a la baja produccin de biomasa, podra atribuirse a la produccin de cidos orgnicosy polioles liberadosal medio de cultivo.
52
En la figura 3.1.8 puede observarse quelos cultivos siguieron perfilesde disminucin de pH muy parecidos entre s y que el cultivo de 6.52 g/l en medio slido mostr un pequeo ascenso del pH al final de la fermentacidm, mientras que el cultivo de 100 g/I desacarosapresent
los valores ms bajos de pH detodos.
Los valoresde pH
fueron en casi todos los casos general mayores que los obtenidos en fermentacin lquida. Lo que indica una menor produccin de cidos orgnicos en fermentacin slida
5.5
I
I
!
s
4.5
4
1
j
/I, I 1
1
3.5
1 I i
3
2.5
12
24
Horas
36
4E
Figura 3.1.8 Perfil de pH de cultivos de Aspergillus niger C28825 en fermentacin slida con diferentes cantidades cle sacarosa inicial.
En la tabla 3.1.9 se muestran los valores obtenidos para los parmetros cinticos de
Aspergillus niger en fermentacin slida y liquida con concentraciones crecientes de
sacarosa inicial, como fuente carbono. de

Tabla 3.1.9 Parmetros calculados para slida y lquida.
qP
Aspergillus niger en fermentacin
Lquido Slido
22.14
15.66
14.30 27.35
7.33 70.04
5.49
41.36
11.77 33.25
Se muestran los valoresobtenidos de los ajustesdela
p,la Y m , junto con los .
valores de correlacin de los valores experimentales y los valores calculados para ambos parmetros. Los valores de correlacin de los ajustes son altos para ambos parmetros
Es de especial importancia comentar los altos valores de correlacin de los ajustes
de la YE/Xlo que nos permite afirmar que la produccin de invertasa esta al menos parcialmente relacionada con la produccin de biomasa en ambos tipos de cultivo,
54
. .. "
. "
.-
sin embargo el nivel de anlisis de este trabajo impide determinar el nivel exacto de relacin entre ambas. Las tendencias de los valores se presentany anallizan en las paginas siguientes. La figura 3.1.10 muestra los valores de p obtenidos para los cultivos de fermentacin lquida y fermentacin slida de Aspergillus niger con concentraciones crecientes de sacarosa inicial.
0.3
~
0.25
n
0.2
t 0.15
i
o. 1
0.0 5
Figura 3.1.10 Velocidad especfica de crecimiento (p) de Aspergillus niger C28625 condiferentesconcentracionesde substrato inicial en fermentacin lquida (O) y fermentaci6n s6lida (O).
Los cultivos de fermentacin lquida presentan valores
de p entre 0.1 a 0.14 con un
mximo de O. 17 a los 12.5 g/l de sacarosa inicial. Los cultivos de fermentacin slida estn entre 0.15 a 0.22, con un mximo de 0.26 con 25 g/l de sacarosa inicial. coeficiente de correlacin (
E l
?) entre los valores experimentales y los ajustados por la
ecuacin logstica fueron superiores a 0.98 en todos los casos. Las curvas de p en lquido siguen tendencias slido y en muy parecidas aunque
los valores de
55
fermentacinslidasonmayoresque
los de felrmentacln
liquidaparatodos
los
valores de sacarosa inicial, las diferencias no son muy grandes. En lafigura 3.1.11 se muestran los valores de biomasa mxima obtenidos en cultivos de fermentacin slida y lquida.
'2
'
30
20
10
'
X
O O
25
50
75
.
1O0
. "" " ~ ~
~
so W )
Figura 3.1.11 Biomasa mxima (Xmax) producida por Aspergillus niger C28B25 con diferentes concentraciones de substrato inicialen fermentacibn lquida (O) y fermentacin slida (O). Enestafigurasepuedeobservarqueen
FL, la biomasaseacumulde
manera
proporcional al aumento de la sacarosa inicial de 6 25 hasta 25 g/l; pero al aumentar
la sacarosa, la biomasa mxima aumenten menor medida. Los valores de biomasa

mxima obtenidos en FS aumentaron con la concsntracrn de sacarosa inicial todas las concentraciones iniciales de sacarosa.
Los valores obtenidos para las concentraciones
para
die 50 y 100 g/l de sacarosa en FL
son parecidos a los reportados por Favela-Torres y col. (1996 y 1998), en donde se
reportaron valores de alrededor de 15 gA de biomasa al cultivarA. niger con 50 y 1O0 g/l de sacarosa como fuente de carbono. Lo obtenida en fermentacinslida
mismo
pasa con el valor de biomasa
con 100 g/l de sacarosa, de 32 g/l,valormuy y col. (1996, 1998)
parecido al reportado en ambos trabajos Favela-Torres de
cultivando A. niger en amberlita con 100 g de glucosa como fuente de carbono. Sin A embargo, los valores reportados en 50 gil de glucosa son de 33 g/l, mientras que en este trabajo se obtuvieron 14 g/l. Es difcil explicar esta diferencia en los valores de
50 g/l de sacarosa inicial y de hecho los valores reportados por Favela-Torres y col.
(1996, 1998) estn por arriba de los valores normales reportados para esta cantidad de carbono (alrededor de 209/1). Esta diferencia puede estar relacionado al hecho de que en esos trabajos la biomasa no se determin de manera directa, sino por medio de la determinacin de las protenas presentes en el cultivo, de manera que si por alguna causa se sobreproducen protenas los valores dela biomasa que se obtienen seran mayores a la biomasa real obtenida. La diferencia en la biomasa mxima se acentu al aumentar la concentracin inicial de sacarosa inicial. Esto ha sido atribuido a la limitacin en la capacidad de
crecimiento de Aspergillus niger en FL conaltasconcentraciones
de fuente de
carbono. En este caso el factor limitante obvio paIra el crecimiento de A . niger es la disponibilidad de oxgeno debido a la baja solubilidad del oxgeno en el medio de
cultivo, lo que ya ha sido postulado en el trabajo de Righelato (1975), quien reporta que la limitacin de la cantidad de oxigeno en el medio de cultivo limitael crecimiento de los hongos filamentosos. A pesardeserorganismosaerbicosestrictos son
57
capaces de crecer con concentraciones de oxgeno muy bajas, pero requieren
de
altas concentraciones de oxgeno enel medio para alcanzar crecimiento mximo. su Mavituna y Sinclair, (1985) puntualizaron esta limitacin de la fermentacin lquida
con la siguiente frase: Es posible suplementar fiiicilmente altas concentraciones de substratosa
los cultivoslquidos,peroalgunosslidos
no solubles,lquidos
que
forman fases o gases poco solubles como el metano1 y el oxgeno, representan un problema importante para este tipo defermentacidin, de todos estos, esel oxgeno el ms importante, de hechola mayora de los procesos microbianosque se realizan en fermentacin sumergida estn limitados por oxgenlo. En la figura 3.1 . I 2 se muestra el perfil de rendimiento de biomasa por gramo substrato consumido (YWS) fermentacin slida y lquida. en
de
I m~
m0.4
! m
0.1
25
50 so (g/I)
75
100 1
Figura 3.1.12 Rendimiento debiomasa por gramo de substrato consumido (YNs) por Aspergillus niger (28625 en fermentacin lquida (O) y fermentacin slida (U) con diferentes cantidades de substrato inicial.
58
__
En fermentacin lquida puede observarse que el
YX/Saumenta hasta 25 g/l con un
valor mximo 0.27. AI aumentar la concentracin inlcial de sacarosa hasta 100 g/l se observauna cada importanteenelrendimientodelcultivo,hasta0.15.En
FS se
observa una disminucin del rendimiento del culttvo al aumentar la sacarosa de a 6.2
25 g/l de 0.45 a 0.36, mientras que al incrementar la sacarosa de 50 a 100 g/l la YwS
se mantiene alrededor de 0.3, por lo que no se observan diferencias importantes en el rendimiento de la fermentacin slida con altas concentraciones de sacarosa. Aun cuando los valores de YNS de fermentacin lquida son menores los reportados a por Favela-Torres y col. (1996) para la fermentaclln lqulda. Los valores de biomasa obtenidasonmuyparecidosenamboscultivos.Por
lo cual, la diferenciaenlos
valores de la YX/Spuede deberse a quelos cultivos de este trabajo consumieron ms substrato.Ladisminucindel YX/S en los cultivoslquidosconaltaconcentracin
inicial de sacarosa podra estar relacionado con la baja velocidad de transferencia de oxgeno en este tipo de fermentacin, puesto que es bien sabido que los matraces en agitacin (FL) no permiten una buena transferencia de masa cuando la demanda de oxgeno es alta (Pirt, 1975). desviacin metabolismo del Deacuerdocon la literatura esto podra resultar en la
haca la sntesiscidos de orgnicos
y polioles.
Provocando una menor conversin del carbonodel substrato en biomasa (Righelato, 1975). otra Por parte en fermentacin slida la transferencia oxigeno de podra
realizarsemsrpidamentedebidoaque
existe solounadelgadacapadeagua
entre el aire y la biomasa, lo que puede permitir un metabolismo aerbico con alto rendimiento de biomasa.
De acuerdoconRighelato(1975)yFavela-Torres
y col.(1998),elcrecimientode
Aspergillus niger enfermentacinlquidaestlimitadopor
la concentracin de en el medio de cultivo.
oxgeno en los cultivos debido a la baja solubilidlad de este
Esto est de acuerdo con Berry y col. (1977) quien afirma que la baja tensin de oxgeno en los medios de cultivo induce rutas metablicas disminuyen que produccindebiomasayprotena la
en los cultivos lquidos de Aspergillus sp. De
acuerdo con Mukhopadhyay y Ghose (1976), en muchas fermentaciones aerbicas, el crecimiento celular vara con niveles de oxgeno la capacidad de aireacin del sistema. Cuando
los
el
en el medio de cultivo se vuelven limitantes para
microorganismo, la fosforilacin oxidativa se desacelera y
la gluclisis se convierte
en la fuente principal de ATP. De tal manera que, una disminucin importante en la cantidad de oxgeno disponible representa disminucin grande una muy de la
cantidad de energa disponible para la clula y, por lo tanto, para su crecimiento. Se requierenexperimentosadicionalesparaprobardemaneradirectaestaidea, cuales se enumeran la seccin de propuestas. La figura 3.1.1 muestra 3 la tasa especfica de consumo de substrato
(qs) de
los
Aspergillus niger en fermentacin slida y liquida, con concentraciones crecientes de
sacarosa inicial. La tasa especfica de consumode substrato en fermentacin slida es muy parecida a la de fermentacin lquida para las concentraciones de sacarosa inicial estudiadas.
El valorquepresentadiferenciasmsgrandesson
los de 100 g/I,con 0.7 para
fermentacin slida y 0.94 para fermentacin lqui'da. Los cercano de los valores de
debe a que en lquido hay una menor cantidad de biomasa, substrato a una tasa mas alta.
pero esta consumi el
0.75
m
Figura3.1.13Tasa especfica deconsumode substrato (qs) de cultivos de Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida (O) y fermentacin slida (O) con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
Los resultados presentados en esta figura coinciden con los resultados presentados con anterioridad en esta seccin y muestran de manera congruente que los cultivos defermentacinslidaparecennecesitarunamenor crecer en fermentacin slida en que ferment'acin cantidad de substratopara lquida. Esto podria estar
relacionado con un metabolismo aerbico de alta eficiencia en fermentacin slida y el metabolismo micro o anaerbico en fermentacin lquida. Este metabolismo
requiere de un mayor consumo de substrato que no es completamente oxidado y por

lo tanto rinde unamenorcantidadde
ATP. Esto junto con la induccin derutas

los cultivos lquidos,
61
metablicas de formacin productos de secundarios en
disminuye la cantidaddecarbonoquepuedeserasimiladoparalaformacin biomasa. Estos procesos pueden representados ser siguiente esquema, adaptado de (1975): Pirt De acuerdo al balance propuesto por (1975): Pirt de manera simple
de por el
Carbono total = Biomasa + C05 + Productos.
La cantidad de biomasa , C02 y productos suman el total de carbono consumido por el hongo y el destino final del carbono consumido depende de las condiciones cultivo, lacarenciadeoxigenoaumentara secundariosreduciendolasntesisde el flujo carbono de haca de
productos
ATP y poir ende la formacinde biomasa,
disminuyendo el valor de YNS,tal como se explic con anterioridad.
GLUCOSA
P,RODUCTOS SECUNDARIOS
Figura 2: Diagramasimplificadode hongos filamentosos.
la asimilacin y destino del carbono en
En la figura 3. l . 14 se muestran los valores de rendimiento de enzima de gramo de biomasa producida porAspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida slida. y
25
so
50
75
1O0
Figura 3.1.14 Rendimiento de enzima por gramode biomasa producida ( ) Y , de lquida (O) y cultivos de Aspergi//us niger C28B25 en fermentacin fermentacin slida (O) con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
La FS mostr un mximo de rendimiento por gramo biomasa producida con 25g/l de de sacarosa (270 UIgX). La Y w disminuy al (aumentar los nivelesdesacarosa inicial en el cultivo a 148 U/gX con 1 O0 g/l de sacarosa inicial. En la FL la actividad especifica de los cultivos disminuy al aumentar la concentracin inicial de sacarosa en el medio hasta los 50 g/l (44 U/gX). AI incrementarse la sacarosa a 100 g/l la YEX del cultivo aument a 86 U/gX. Este aumento parece estar relacionado con la
utilizacin de la gluclisis como fuente principal de ATP en los cultivos lquidos con altas concentraciones de sacarosa inicial, como sle explico anteriormente (Xu y col..
1989; Kubicek-Pranz y col., 1990; Nielsen, 1992) . Esto obliga a aumentar la sntesis de invertasa a fin de cubrir la mayor necesidad de glucosa como fuente de carbono para la produccin de ATP. El valor de la YVX se calcul por el ajuste lineal de los datos experimentales de la parte ascendente de la produccin enzimtica contra la produccin de biomasa para cada una de las condiciones estudiadas, los valores de correlacin entre los datos experimentales y las lneas ajustadas son muy altos, solo el de lquido con 6.25 g/l de sacarosa estuvo por debajo de 0.9. Esta alta correlacin
nos indica que la produccin enzimtica esta al menos parcialmente asociada la con
produccindebiomasaenambossistemas de fermentacin,aunquedebido al
mtodo de clculo no es posible.determinar el grado de asociacin que existe. Esto
nos permite afirmar que la mayor produccin de biomasa

mayor produccin enzimtica en fermentacin slida.
es la responsable de la
En la figura 3. l. se muestran los valores de productividad enzimtica de cultivos 15 de Aspergillus niger en fermentacin slida lquida. y
Figura 3.1.15 Productividad (P) de cultivos de Aspergi//usniger C28B25 en fermentacibn lquida (O) y fermentacin slida (O) con diferentes cantidades de sacarosa inicial.
La productividad aumento en ambos tipos de cultivo, pero pas de ser igual con 6.25
g/l de sacarosa inicial a ser mas de 5 veces mayor en FS (121 U/lh) que el valor de
FL (21 U/lh) con 100 gll desacarosa inicial. Estasdiferencias en los valores de
productividad comparativa de FS contra FL han sido reportadas antes
por diversos
grupos. Acua-Argelles y col (1995) reportan que la FS result ser entre 6 y 51 veces ms productiva que la FL dependiendo del tipo de enzima medida. Lekha y
Lonsane. (1994) reportaron que la productividad del medio slido para la produccin de tanasa fue 5 veces mayor en FS queen FL.
En este caso la mayor productividad delos cultivos de FS es el resultado combinado
de la mayor velocidad de crecimiento, mayor valor de YNSy el mayor valor de YUX el
de los cultivo de fermentacin slida comparados con la fermentacin liquida.
La figura 3.l. 16 muestra los valores de la tasa especfica de produccin enzimtica

qp (U/gXh) obtenidos para cultivos de
Aspergillus niger en fermentacin lquida y
slida con diferentes concentracionesde sacarosa.
75
Figura 3.1.16 Tasaespecficadeproduccinenzimtica (qp) en cultivos de Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida (O) y fermentacin slida (O) con diferentes cantidades de sacarosa inicial. Las lneas punteadas muestran la tendencia de los puntos .
Como puede observarse en la figura 3.1.16, los cultivos de fermentacin lquida, en la tasa especfica de produccin enzimtica qp de FL disminuye hasta un valor de
5.5 U/gXh con 50 g/l de sacarosa inicial y aumenta hasta 11.2U/gXh con 100 g/l de
sacarosa inicial. Mientras que en FS el mximo se alcanzo con 70 WgXh con 25 g/l de sacarosa inicia y disminuy hasta 31 con 100 g/l de sacarosa inicial. Estas diferencias en metablicosparacada qp podran relacionadas diferentes estar con estados uno de los sistemasdefermentacin.Deacuerdo con los
66
"s ".
." . " . "I
resultados previos la diferencia
en la qp esta relacionada con la mayor velocidad
especifica de crecimiento y la mayor Y ~ de los cultivos de FS. x Una explcaan posible para el comportamiento de los cultivos de FL con respecto a la transferenciadeoxgenopodraestaren observ que la cantidad
los trabajosde
Sols (1969). Quien
de oxgenoel de en mediocultivo parece regular y bas en ellounmodeloderegulacinde
mdlrectamentelasntesisdeglu-6-P,
transporte de carbohidratos y metabolismoenlevaduras.Proponequeeloxgeno regula de manera indirecta la acumulacin de citrato al regular la velocidad de la fosfonlacin oxidativa, al cual a su vez controla la actividad de glucblisis, debido a la concentracin limitante oxgeno, de
la hexocinasa en la
el metabolismo sera
desvlado haca la gluclisis y haca la fermentacin en las levaduras. Esto resulta en

y el efecto Pasteur que se observa como una mayor produccin de hidrolasas mayor
consumo de substrato con bajo crecimiento. An cuando Nielsen (1992) puntualiz que los hongos no presentanel efecto Pasteur como tal, debido a que son aerbicos estrictos y no pueden generar suficiente energa para crecer por medio de la
conversin de piruvato en etanol, acetato lactato. Durante el cultivo lquido con baja o cantidad de oxgeno disuelto la fosforilacin oxidativa se convierte botella con la acumulacin de etanol, acetato, lactato en un cuello de
o intermediarios del ciclo de

y col. (1 989) y por
Krebs por ejemplo cido ctrico, esto ha sido observado por Xu Kubcek-Pranz y col. (1990)
en Aspergillus niger, quienes observaron o glucosa por arriba de
que al
aumentar la concentracin de sacarosa
50 gll se satura la
fosfori~acinoxidativa y se acumula citrato como una manera
de poder desviar el
exceso de glucosa utilizada en la gluclisis. Carter y Bull (1 969) encontraron que la

67
disminucin de la concentracinoxgeno de disuelto resulta distribucin de glucosa
en una mayor
en la ruta de las pentosas, y debido a que el rendimiento
energtico de la ruta de las pentosas es bajo, sera necesario aumentar el consumo de glucosa cuando una mayor parte de la glucosa se Todo lo anterior explica el aumento metabolita por ese medlo
y como
en el consumosubstrato de
consecuencia el bajo rendimiento de biomasa por gramode substrato consumldo de

los cultivos de FL y por ultimo el por que cultivos de 100 g/l no parecen presentar los
represin catablica. Los resultados parecen confirmar que el hongo se encuentra limitadoporoxgeno inicial.
El aumento en la concentracin inicial de sacarosa tuvo efectos diferentes entre la FL
en FL cuandosepresentaunagrancantidaddesubstrato
y la FS. Mientras, que en FS la ,,X , manera significativa por
aument y el rendimiento no seafect
de
el aumento la enconcentracin substrato de
inicial. las pesar de
indicando que no existe una limitante obvia para tipo cultivo este de bajo condiciones estudiadas. En FL la biomasa mxima (Xmax) est limitada, a
que se use una mayor cantidad de substrato inicial. Por lo cual, el rendimiento de la biomasa disminuy de manera significativa aumentar la concentracin de substrato al inicial.Ambosresultadosindican aumentarlaconcentracin
la presenciadeunalimitantequeseagudizaal
del substratoinicial y tal como seindici, en el prrafo
anterior esta limitante podra ser la cantidad de oxgeno en el medio de cultivo. Otro aspectointeresantedelasdiferenciasencontradasesladispersin del medio de
Cultivo sobre la superficie de cultivo de la fermentacin slida, Esto podria hacer que el Cultivo se Compode como un lote alimentado donde la concentracin de substrato
68
se mantiene baja a pesar de
la existencia de una alta

y
concentracin de substrato Lonsane (19916). Este
final, tal como ha postulado Ramesh sido por comportamiento ha sido reproducido
en fermentacin lquida por Aguilar y Huitrn
(1987), quienes aadieron pequeas cantidades de cido galacturnico y glucosa a
cultivos de Aspergillus niger durante la produccin de pectinasas con pectina como
I fuente de carbono. A mantenerbajalaconcentracintemporal
de los represores
stos produjeron un efecto de estimulacin para la produccin enzimtica en lugar de la represin esperada. La explicacin de
los autores es que bajas concentraciones
de glucosa o del represor adecuadoen realidad sirven como inductores de la sntesis de la hidrolasa correspondiente.
Los altos valores de correlacin de los ajustes de YUX permiten afirmar que la mayor
productividad de los cultivos de FS se debe a la combinacin del mayor rendimiento de biomasa porgramodesubstratoconsumido slidos. El aumento en
y a la mayor YVX de los cultivos
la cantidad biomasa de con
los niveles superiores
de
sacarosa fue suficiente para mantener una mayor
productividad enzimtica de los
cultivos de fermentacin slida, a pesar de la disminucin de valores de la YEIX. los Todos estos resultados apoyan la idea de alta disponibilidad que en la fermentacin slida existe una niger mantener un
de oxgeno que permite a Aspergillus
metabolismo aerbico que resultaen una alta velocidad de crecimiento y por lo tanto una mayor velocidad de consumo de substrato.
3.2 Estudio de la produccin de invertasa por 3 cepas Aspergillus niger en de fermentacin slida y lquida con 100 g/l de sacarosa inicial.
Se compar el crecimiento y la produccin de invertasa tres cepas deAspergillus por

niger en fermentacin lquida y slida a fin de probar que las diferencias reportadas
de FS y FL con altas concentraciones de sacarosa inicial, son resultado del sistema de cultivo y no variaciones atribuibles a una sola cepa. La figura 3.2.1muestra el perfil de crecimiento de tres cepas de Aspergi//usniger en cultivo FL y FS.
i
I
40
30
' 0 W
10
O 12 24 36 48 60 72' Horas
11
O 12 24 3648 60 72
II L
O 12 24 36 48 60 72: Horas Horas !
Figura 3.2.1Crecimiento de las cepasAa20(A), N402 (B) y C28B25 (C) en fermentacin lquida (O) y slida(0) con 100 g/l de sacarosa inicial. Los valores experimentales se representan como smbolos y los valores ajustados se representan como lneas continuas.
El crecimiento de las cepas Aa20, N402 y C28825 en FL es muy parecido entre s.
Las cepas presentan un tiempo de germinacin de entre 12 a 24 horas, despus de eso sepresentaunafasedecrecimientocontinuoquepuededurarhasta las 60
70
horas, En la FS las cepas mostraron perfiles de creclmlento pareados entre si. con un periodo de adaptacin de alrededor de
12 horas, alcanzando la
produccin
mxima a las 48 horas. Comparando las curvas de creamlento (Flg 3 2 1A. B y C) se observa que todas las cepas crecieron ms rpido y acumularon mayor cantldad de biomasa en fermentacinslidaqueen fermentaaon liqulda Los indlces de
y X ,,
crecimiento especfico (p) fueronmayoresenslido
fuetresveces
mas
elevada en FS (34.5 g/l vs. 11.04g/1) comparado con FL. La X , es estadsticamente significativa ( ~ ~ 0 . 0y1muestra claramente que A. nrger )
es capaz de crecer mucho ms en un soporte slido que en un matraz en agltacln cuando el nivel de substrato es alto. En ambos sistemas de cultlvo la parecida entre las cepas. Un examen microscpico de los cubosde
PUF (seccln 3.4). mostrun
X,,
es muy
mlcelio
enredado en la red de poliuretano con grandes espaclos
llenos de are. As pues,
parece razonable la propuesta de que el cultivo en FS funclona como un cultivo en superficie para el hongo, el cual por lo tanto no est limltado por la transferencia de oxgeno como en el caso del sistema de fermentacin liqulda.
Los cultivos de fermentacin mostraron lquida pellets
con un centro
muy
densamente agregado lo que seguramente aumentalos problemas relaclonados con la transferencia de oxgeno al interior de la biomasa.
y podria ser un lndlcaclon del
metabolismo de tipo microaerbico anaerbico en la FL o Lafigura

3.2.2 (A, 6 , y
C),muestran los tiempos de evoluclonde los titulos de
invertasa para cada cepa.
71
"
_ _ I
B 5000
4000
S h
m
69
3000
5 3000
S -
m 'Ic
~
4000
E 2000 al > c -
5 2000 >
1O00
m 69 m
1 O00
O
O 1 2 243648 6072 Horas
O O 12243648607211 Horas I/ O 122436486072 Horas
Figura 3.2.2 Produccin de invertasa por las cepas Aa20 (A), N402 (B) y C28B25
(C) en fermentacin lquida (O) y slida(U).
Los crculos corresponden a los ttulos medidos en experimentos con FL mostrando
un valor pico alrededor de
las 60 horas y decreciendomastarde,lamediade

(Emax)fue de 1179
f
la
produccin mxima enzimtica
138 U/I. Los cuadrados
corresponden a los ttulos de invertasa medidos en experimentos con el sistema FS,
la media de la ,E ,,
es de 3663 228 UII, ms del doble que en FL.
En el cultivo lquido de las tres cepas de AspergillusnigerAa20, N402 y C28625, hay una fase debajaproduccin a 24 horas,trasestolaactividaddeinvertasase
acumula de manera continua durante todo el tiempo de fermentacin hasta alcanzar

el mximo a las 60 horas, tras este mximo la actividad
de invertasa disminuye en
las trescepas.Laproduccindeinvertasaenfermentacinlquidapareceserla misma independientemente cada de cepa. esto En pueden intervenir factores
72
relativos a las limitaciones del medio y en el caso de producidapor

Aspergi//us niger seadependient:ede
que la cantidad de invertasa la cantidaddebiomasa
se
explicara el parecido por la limitacin del crecimiento por sistema de cultivo. el La produccin de invertasa por las tres cepas de Aspergi//us niger en fermentacin slida presenta un periodo de baja produccin alrededor de las
24 horas, tras este
periodo la produccin de invertasa se incremental de manera exponencial hasta las
36 horas y 48 horas de cultivo. Tras este periodo la actividad de invertasa tiende a

disminuir pero parece hacerlo a un ritmo diferente para cada cepa. Las diferencias que se presentan en fermentacin no slida parece relacionada estar con limitaciones intrnsecas del medioo sistema de cultivo y en el que las limitaciones de produccin que se observan son las relativas a cada cepa. En la tabla 3.2.3 se muestran los resultados obtenlidos a partir del crecimiento de las cepas AA20, N402 y C28B25 en fermentacin lquida y slida. Los resultados
obtenidos se compararon por anlisis estadstico ANOVA de una sola va. de

No seencontrdiferenciaestadstica
en el rendimientodeenzimapor
gramo de
biomasa producida entre los experimentos FL y FS. Mientras que las cepas C28B25
y Aa20 mostraron valores de Y a ms altos en
FS que en FL, la cepa N402 mostr
un valor de YVX ms alto en FL que en FS, an wando los valores para cada cepa
en FL y FS fueron cercanos.
La productividad enzimtica (P=U/hl) se estim en trmino volumtrico, debido a que
se utiliz elmismovolumen produccin mxima
en ambossistemasldecultivo.Setomelvalorde
y todas las cepas mostraron una
de cada cepa
mayor
productividad en FS que en FL, tal como ha sido previamente reportado por
Sols
73
. "
.. .
"
Pereira y c o l . (1993); Lekha y Lonsane (1994) y Acua-Argelles y col, (1995), estos autores reportaron que los cultivos por FS produjeron niveles enzimtica ms altay en menortiempoquelosqueenFL,yatribuyeron de produccin este
comportamiento principalmente a diferencias en la induccin y represin enzimticas (Sols-Pereira y col. , 1993); o a diferencias en la calidad de las enzimas producidas en cada sistema de cultivo (Lekha y Lonsane, 19941; Acua-Argelles y col., 1995).
Tabla 3.2.3 Biomasa, produccin enzimhtica, velocidad de crecimiento, productividad volumtrica y productividad por gramode biomasa de tres cepas de Aspergillus niger en fermentacin liquiday sllida.
-xiz++F
N402 C28B25
Parametros Lquido Slido
Lquido I S6lido )Lquido~:S6lido~Lquido~Slido~Lquido/Slido 1 1261 I 3 4 1 1 10.12 0.99 1O20 3089 0.1 1 0.97 1258 4487 0.14 I I 10.99 0.99 1180 13662 1 0.12 138 732 0.004 33.29 10.161 79 0.99 0.88 0.86
II
9-5 12.6
I1
31.9 30.3
Desv std Pr>F prom

F
0.002 49.85
I 10.17 I
0.99 0.21
98
21
71
0.93 0.90 0.93 10.87 93 I 119 18 28 0.24 1.91 ns
19.7
I I
1
1
I
86.7
0.02 10.04 0.08'6

5.1 5
2.30 33.05 0.025 12.28
**
ns
Nuestros resultados muestran que no solo existe una mayor produccin de biomasa en FS comparada con la FL, si no que la velocidad de crecimiento en FS es tambin mayor que en FL, esto resulta en mayores cantidades de biomasa acumuladaen FS enmenortiempo.Debidoaquenoencontramosdiferenciassignificativa en los
valores de YOX entre fermentacin slida y fermentacin lquida y a que los valores
de correlacin obtenidos en el calculo de la YUX son altos, podemos pensar que la produccin de invertasa est ligada al menos parcialmente de manera directa a la
produccin de biomasaen ambos sistemas de cultivo con 100 g/l de sacarosa inicial.
Y por lo tanto, la produccin enzimtica quedara1 determinada por la capacidad del
cultivo para acumular biomasa. AI ser mayory mfis rpida la produccin de biomasa en fermentacin slida esto podra explicar tanto los mayores niveles de produccin como la mayor productividadde los cultivos slidos.
Las diferencias observadas en este experimento podran ser inherentes a las cepas
utilizadas y dependerdelorigen de cadaunade las cepas. Este resultado es adaptadas
consistente con la propuesta de que ciertas cepas parecen estar mejor para alguno de los sistemasdecultivo(Shankaranand
y col., 1992;Antier y col.,
1993). El hallazgo ms importante de esta seccin del trabajo es la confirmacin de
que las diferencias encontradas entre fermentaciijn slida parecen dependientes ser de la cepa de
y fermentacin lquida no
Aspergillus niger utilizada, sino
que
dependen del sistema de cultivo. Estos resultados se publicaron enel trabajo titulado Invertase production by Aspergillus niger in submerged and solid-state fermentation, que se incluye en el anexo 1.
3.3 Estudio de lasecrecindeinvertasa par Aspergillus niger fermentacin slida y lquida con 100 g/lde sacarosa inicial. Se cultiv Aspergillus niger C28825 con 100 gramos de sacarosa como carbono,afindeanalizarla
C28825 en
fuente de
produccin Intra y extracelular de la invertasa.La
produccin de proteasas se comparo entre ambos sistemas de cultivo. Se
compar
la acumulacin y el consumo de monosacndos en los cultivos de ambos sistemas de cultivo En la figura 3.3.1 se muestra la acumulacln de! biomasade la cepa C28B25 en fermentacin lquida y slida con 100 g de sacarosa como fuente de carbono. A
:O E i 10
O
"
20
12
.
24
36
Horas
48
60
~
72
.~.
"~
"_
Figura 3.3.1 Biomasa producida por Aspergillus niger C28B25 en fermentacin lquida (O) y fermentacin s6lida (O) con 100 lgll de sacarosa como fuente de carbono.
Se observa que en fermentacln liquida la blomasa presenta una fase de adaptacin larga con un aumento de la biomasa muy pronunclado entre las 48 y las 60 horas, la
76
biomasa acumulada pasa de aproximadamente 4 lg/l hasta 11 g/l en solo 12 horas y es a las 60 horas cuando se Inicia la esporulacin de los pellets del cultivo, posterior a este momento la acumulaan de biomasa disminuye llegando a 12 horas. Los resultados de fermentacin slida presentan un g/l a las 72
perfil parecido a los de
fermentacin lquida; la fasede adaptacin es ms corta, aproximadamente 18 horas

y la fase de crecimiento exponenclal llega hasta las
42 horas momento en que se
inicia la esporulacin en el cultlvo, es8 para momento
se han acumulado
aproximadamente 32 gll de biomasa, valor que se incrementa muy poco para el final de la fermentacin 33 g/l a las 48 horas. An cuandolos dos cultivos presentan una curva clsica de creclmiento formada la porfase de adaptacin, crecimiento
exponencial y fase estaaonaria. los tiempos y relaciones entre ellos son diferentes. Andres y Peberdy (1974) observaron altas que concentraciones glucosa de sacarosa en elmediodecultivoenfermentacinlquidaresultaronenun o retraso
importante en los tiempos de crecimiento y produccin de invertasa por Aspergillus

nidulans en fermentacin lquida. De acuerdo con IVielsen (1 992) este retraso podra
estar relacionado con la alta concentracin de sacarosa el medio, que acta como en inhibidor de la germinaciny alarga el tiempo de adaptacin. La figura 3.3.2 presenta los perfiles de secrecin de invettasa por Aspergillus niger
C28B25 cultivada en fermentacln lquida slida con 100 g/l de sacarosa. y
En la curva de produccin de rnvertasa de fermentacin lquida se pueden observar

lo que parecen ser dos fases de produccin, la primera alcanza
un mximo de 400
U/I a las 36 horas y la segunda. que se inicia a las 48 horas y alcanza el mximo de
77
1500 U/I a las 60 horas. La produmn de invertasa en fermentacin slida se inicia
lentamente durante las primeras 24 horas con s610 500 U/I y presenta un aumento importante entre las 24 y las 36 horas. Tras ese tiempola velocidad de produccin de invertasa disminuye para alcanzar un mximo de 4600 U/I a las 42 horas. Tras ese tiempo la actividad de los extractos disminuye.
\ 33000 m
v,
4000
-E 2000 al
>
S
- 1000
O
O 12
24
36 Horas
48 1
60
72
Figura 3.3.2 Produccin de invertasa extracelular por Aspergillus niger C26B25 en fermentacin lquida (O) y fermentacin slida (O) con 100 g/l de sacarosa.
Los perfiles deproduccin de invertasa en ambossistemasdecultivosiguen perfiles crecimiento de presentados en la figulra 3.3.1, lo que ratifica la que
los
produccin de invertasa est ligada al crecimiento de la biomasa en ambos medios de cultivo. En la figura
3.3.3 puede observarse que la invertasa intracelular seacumula
ms
rpidamente en el cultivo y representa a la mayora de la actividad de invertasa en durante todo el tiempo de cultivo.
3000
I I
12
24
36 Horas
60
Figura 3.3.3 Comparaci6n de la actividad intra (O), extracelular (+) y total de invertasa por Aspergillus niger C28B25 en fermentacin liquida. La invertasa total se representa como una lnea punteada, ya que se obtuvo por la suma de las otras dos.
(o)
La invertasa intracelular presenta valor un mximo produccin de aproximadamente es que el mismo mximo valor obtenido para
de 1500 U/I la invertasa cultivo se eleva a
extracelular, con esto la produccin real de inverl:asa para este
cerca de 2700 U/I. En el momento de mxima produccin intracelular se tienen 1500

U/I deinvertasa y 500 U/I deinvertasaextracelular,
lo que daunafraccin
intra-
extracelular 75/25%, lo que coincide con lo reportadoporPeberdy afirma que Aspergillus niger presenta el 70% de la invertasa total como intracelular. Por otra parte, Vainstein y
(1994) quien
invertasa
Peberdy (1990) observaron que,
aproximadamente el 50% de la invertasa total producida por Aspergillus nidulans en fermentacin liquida est asociada al micelio y parece estar localizada en el espacio
79
periplsmico,aproximadamente
el 60% de estainvertasaintracelular
puede ser
liberada por accin de qumicos como el liberar por accin mecnica.
DTT y la proteasa K, y el resto se puede
El hecho de que la invertasa intracelular se acumule
antes que la invertasaextracelularcorrespondecon
la ideade que la invertasa
extracelular es el resultado delpaso invertasa intracelularat medio de cultivo.

La figura 3.3.4 muestra los perfiles de produccin de invertasa intray extracelular de
Aspergillus niger C28625 en fermentacin slida.
7000
n
3 so00 Z: 4000 a
d
6000
al
3000
1O00
2 2000
O O
"
12
24
Horas
36
,
Figura 3.3.4 Comparacin de la actividad intra (O), extracelular (+) y total (O) de invertasa por Aspergillus niger C28625 en fermentacin slida. La invertasa total se representa como una linea punteada, ya que se obtuvo por la suma de las otras dos.
Durante primeras las horas fermentacin de
los extractos intra y extracelulares
presentan niveles de produccin que resultan equivalentes y a partir de las 24 horas

la invertasa intracelular pasa a representar un fraccin cada vez ms pequea de la
80
actividadextracelular.Estaseincrementa
al tiempoquelaactividadintracelular
36 horas con cerca de 6800
disminuye. La actividad total mxima se alcanza a las Ull.
Los resultadospresentados
en esas figuras correspondencon
los hallazgos de
Lekha y Lonsane (1994), quienes encontraron que
la tanasa producida por
Aspergillus niger en fermentacin slida fue totalmente extracelular, mientras que en
fermentacin lquida
y en fermentacin en superficie totalmente fue intracelular
durante las primeras 48 horas de cultivo. Tras ese tiempo se secret tanasa en fermentacin lquida
el 83% de la
y el 51% en fermentacinsuperficie. en
El
(1994) como
crecimiento en forma de micelio disperso ha sido reportado por Archer una forma de crecimiento favorable la ms para secrecin enzimtica crecimiento en forma pellet de obtenidos. Estadiferenciaen la proporcindesecrecindeenzimas
Neurosporacrassa quepresenta
que el
lo que podra ayudarexplicar a
los resultados
se haobservado para
el 100% de la invertasa el 90% de la
variasespecies,como
intracelular, pero en cepas mutantes que no sintetizan pared celular invertasa es extracelular. se reportado Esto ha tambin protoplastos para de
Aspergillus niger (Sorensen y col., 1996), lo que inldica que la pared celular juega un
papel importante en la secrecin de las enzimas al medio de cultivo. De acuerdo con

los modelos conocidos las enzimas se secretan hacia la punta de las hifas que es el
mismo lugar donde se sintetiza la pared celular, de tal manera que mezclan con los componentes de la pared celular
las enzimas se
y difunden a traves de la pared
81
inmadura que presenta poros muy grandes, lo que permite la secrecin de enzimas de hasta 300 KDa, mientras que los poros de la pared madura solo permiten el paso de enzimas de 20 KDa (Peberdy, 1994). Este proceso dedifusinatravsdelaparedcelularpuedeexplicartambin mayor secrecih de la invertasa en los cultivos de fermentacin slida comparados con los de fermentacin lquida. En fermentacin slida, la invertasa puede difundir la
libremente al mediode cultivo, mientrasque e 1 fermentacinlquida la invertasa n tender a quedar atrapada al interior del pellet, dando como resultado una menor
liberacin al medio de cultivo,el proceso de secrecin se esquematiza la figura 2. en
Figura 2: Esquemadesecrecindehidrolasasporhongosfilamentosos a travs de la punta de una hifa, 1) Retculo endoplsmico, 2) Aparato de Golgi, 3) Vesculas de secrecidn, 4) pared celular, 5) Espacio periplhsmico, 6) Medio de cultivo. Modificado de Peberdy, 1994,
De acuerdo Peberdy con
(1 994) y Archer y Peberdy (1997), protenas las
de
secrecin sesintetizan en los ribosomasasociados al retculoendoplsmico (RE) rugoso y al mismo tiempose insertan dentro dela membrana del RE, esta membrana
82
se separa y se une al aparato de Golgi, donde se lleva a cabo la maduracin de las protenas por medio de modificaciones postranscripcionales como la fosforilacin, la las gluclisis y la protelisis. Una vez maduradas las protenas, vesiculas se separan
y se dirige hacia uncumulodevesculas
de secrecinllamadoocasionalmente de secrecin y en donde se
SPITZENKORPER, el cual parece dirigir la dinmica
mezclan con vesculas de secrecin de componentesde la pared, de ah se dirigen a la membrana celular,dondesonliberadaspor membranacelular.Unavez la fusin de las vesculas con la difunden al
en el espacioperplsmico,lasprotenas
espacio extracelular, est difusin depende del tamao
de la protena, del grado de
maduracin de la pared y de la afinidad de la protena por pared (Archer y Peberdy, 1997). Enlafigura
los componentes de la
3.3.5 semuestraelperfildeconsumodeazucaresenfermentacin
lquida. Se observa la disminucin continua de la sacarosa durante las primeras 36 horas de fermentacin. disminucin Esta correspondi glucosa y fructosaquealcanzaronsumximo
con la acumulacin
de
a mismo tiempo.Lafructosase l
acumul en mayor cantidad que la glucosa. AI finalde la fermentacin, la glucosa fue consumida casi en su totalidad, mientras que la fructosa qued como remanente (9
g/O.
Esta diferencia en el transporte de monosacridos hacia interior del hongoha sido en ampliamente estudiada en Aspergillus niger y Saclcharornycescerevisiae por Torres
y col. (1996); De Wnde y col. (1996);Walsh
y col. (1996);Reinferberger
y col.
(1997); Ye y col. (1999) quienes
han establecido que la presencia
de altas
83
concentraciones de glucosa intracelular regula
la induccin y expresin de
transportadores especficos de otros monosacridos de tal manera que al aumentar la concentracin intracelular de la glucosa se inhiibe la formacin de transportadores de otros azcares
y se impide
el ingreso de monosacridos resultantes
de la
hidrlisis de polisacridos presentes en el medio cultivo. cle
1O0
n
80
O
O 24 12
36
Horas
48
60
72
Figura 3.3.5 Perfil de consumo de azcares por Aspergillus niger C2885 en fermentacin lfquida con 100 g/l de sacarosa. Glucosa (O), fructosa ( b ) , sacarosa (+) y azcares residuales (O).
De estamaneraseimpide
laexpresindeotrashidrolasasporlapresencia
de
cantidades significativas de inductores debidos la presencia de sus substratos en el a medio. KO y col. (1 994) y Goel y col. (1999) han llevado esta idea ms all y han
relacionado la concentracin intracelular de la glucosa con el control metablico por

la F6P e indirectamente la con concentraci'n de piruvato, pues
una alta
concentracin de piruvato unida a una alta concentracin de glucosa parece inducir
84
la utilizacin de vas metablicas de fermentacin en Saccharomyces la sntesis de y cidos orgnicos enhongos filamentosos. Tal como se explicaen la seccin 3.1. En la figura 3.3.6 se muestra el perfil de consumlo de azucares por Aspergillus nrger en fermentacin slida con 100 g/l de sacarosa iniicial.
"
. .
"
12
24 Horas
36
48
Figura 3.3.6 Perfil de consumo de azcares por Aspergillusniger C2865 en fermentaci6n s6lida con 100 g/l de sacarosa. Glucosa (O), fructosa (o), sacarosa (O) y azcares residuales (O).
En esta figura se observa que el consumo de sacarosa fue continuo durante todo el tiempo de la fermentacin y a las 36 horas desapareci del cultivo. Durante el tiempo de cultivo se acumularon pequeas cantidades de fructosa y glucosa, la fructosa se acumul en mayor medida que la glucosa,28 g/l y 17 g/] respectivamente. A final de I la fermentacin la glucosaseconsumitotalmente,mientrasque
los nivelesde
fructosa se mantuvieron establesdesde las 30 horas hasta el final del cultivo.
En las figurasanterioressepresentaron
los perfiles de consumo de azcares en
fermentacin lquida y slida respectivamente. Calmo puede observarse los azcares
se consumen completamente en cultivo slido, mientras que en cultivo lquido
los
azcares remanentes representan el 10% del valor inicial. Otro detalle importante es quemientras que laglucosa es totalmenteconsumidahacia el finaldeambas
fermentaciones, la fructosa representa entre 60 y 90% de los azcares remanentes el totales. En ambos casos la esporulacincorrespondeconelagotamientode sacarosa en el cultivo y la acumulacin milxima de monosacridos parece corresponder con el mismo momento metablicoen ambos cultivos. Debido a que el consumo de carbohidratos est normalmente limitado al ingreso de monosacridos, los disacridos deben ser degradados por enzimas extracelulares secretadas por el hongo antes de ser ingresadas al interior de la clula. Esto apunta a la posibilidad de que la invertasa intracelular de FL en realidad este en el espacio periplsmico y por lo tanto en contacto con el medio de cultivo, lo que explicara la degradacin de la sacarosa cuando los niveles de invertasa extracelular en el medio de cultivo son bajos En los hongos filamentosos la regulacin de la sntesis de invertasa se lleva a cabo por medio de laregulacin normales, del gen suc2. En (condiciones cuando la la
concentracin de ATP es baja, la presencia de glucosa estimula la sntesis de una serie de hidrolasas entre las cuales encuentra invertasa; se la al aumentar la
concentracin de glucosa productode la actividad de invertasa sobre el substrat0 del cultivo, aumentan los niveles intracelulares de ATP y se activa el inhibidor creA, el cual se une a los genes estructurales de las hidrolasas y se lleva a cabo la represin
86
catablica. En et caso de la fermentacin slida los niveles de glucosa no aumentan

lo suficientecomoparasobrepasar
el nivel umlbral paraproducirlarespuesta
de
represin, pero si para estimular el crecimiento y mantener la estimulacin de los genes suc2, lo que explicara la sntesis aumentada de hidrolasas por la adicin de glucosa, tal como en los experimentos Aguilar de anteriormente. En el caso de la fermentacin lquida con altas concentraciones de sacarosa, lo que se tiene es un cuadro metablicos donde la concentracin inicial de la glucosa acta como estimulante de la sntesis de la invertasa, pero los niveles extracelulares de glucosa aumentan rpidamente como resultado de la hidrlisis de la sacarosa. Esto debera producir la represin catablica la de invertasa, pero debido a la baja
y Huitrn (1987) explicados
concentracin del oxgenoen el medio de cultivola concentracin intracelularde ATP es baja, por
lo que no se activa el represor creA y como resultado la invertasa no
slo no deja producirse, que estimula produccin gramo de sino se su por de
biomasa. Esto aumenta la concentracin de la glucosa en el interior de la clula y junto con el cuello de botella de la fosforilacin oxidativa termina produciendo una
desviacin del metabolismo hacia la produccin de cidos orgnicos intermediarios delciclo de Krebs,especficamentelaproducciclndecidoctrico
Aspergillus niger. Estecomportamiento hasidoreportado
en el caso de la
y aprovechadopara
produccin de cido ctrico por Aspergillus niger (Carlson, 1987; Barford, 1990; KO y col., 1994; Torres y col., 1996; Goel, 1999). Todos estos resultados indican que la alta produccin de biomass es favorecida por la una mayor disponibilidad de oxgeno. distribucin La mejor de altas
87
concentraciones de substrato es un elemento clave parauna mayor productlvldad de la
FS.El tipo de crecimiento en forma miceliar podra ser la razn de que se secrete
una mayor cantidad de invertasa extracelular en tiempo del cultivo. el En la figura 3.3.7 sepresentalaproduccindeproteasapor
C28B25 en fermentacin lquida
(O) y fermentacin slida
Aspergrllus nrger
(O) con 100 gA de
sacarosa como fuente de carbono.
!
I
12
24
36
Horas
48
__
~
60
~. .
~~ ~
72
~~.
Figura 3.3.7 Produccin de proteasa extracelular por Aspergillus niger C28B25 en fermentaci6n lquida (O) y fermentacin slida (O) con 100 gA de sacarosa como fuente de carbono.
En figura esta puede observarse que
en la fermentacin lquida secretan se

y durante los ltimos tiempos
proteasas al medio de cultivo durante la germinacin
de la fermentacin, mientras la que fermentacin no slida presenta significativos de proteasas en el extracto del medio de cultivo durante el tlempo
nlveles de
fermentacin. comportamiento sido Este ha hallado
en repetidas ocasiones
en
trabajos relacionados con el presente (Aguilar y col, 2000; Diat-Godines y c o l . , 2000 Comunicaciones personales) y ha sidoreportado
1998),
en la literaturapor
(Liu y col., medio que
lo que podrallevarapensarquelafermentacinslidaesun
resulta favorable para la estabilidad de las hidrolasas producidas. Esto no ocurre en
los datos este de trabajo, dondeinvertasa la

fermentacin slida que en la fermentacin llquida,
no resulta estable ms ni en el trabajo de
en la otros
investigadores, quienes han llegadoa utilizar la fermentacin slida como un sistema muy eficiente para la sntesis de proteasas (Tao y col., 1997). Por lo que la falta de en fermentacin slida1 parecemsrelacionada con las
produccindeproteasas
condiciones de cultivo que con el tipo de cultivo. AIanalizar
los tiempos de produccin de proteasas con los perfilesde actividad

no parece existir efecto de las proteasas sobre la
enzimtica observa se que
estabilidad enzimtica de los cultivos. Por ejemplo),la fermentaci6n lquida no parece presentar disminucin una de la actividad invertasa de como resultado de la en
presencia de las proteasas en el cultivo, mientras que las enzimas producidas
fermentacin slida no parecen ser ms establesclue las de los cultivos lquidos. Una posibleexplicacin es que el mtododedeterminacindeproteasas determinarlaactividad real de proteasas en los cultivos,seapor no permite lafalta de un
mtodo que nos permita medir todas las proteasas' presentes en cultivos o debido los a que lascondicionesde
los cultivos no seanpropiciaspara
la hidrlisis de la
invertasa por estas proteasas.
3.4 Estudio de la morfologa de crecimientlo de fermentacin sliday lquida.
Aspergillus niger
en
Se tomaron microfotografas para realizar la comparacin del tipo de crecimiento en ambos sistemas de cultivo. Se realizaron medidas de cultivos slidos. los Enlafigura
3.4.1 semuestranlasmicrofotografas
del crecimientode Aspergillus
niger en fermentacin lquidacon 100 g/l de sacarosa inicial.
Figura3.4.1Microfotografasdeldesarrollode Aspergillusniger C28B25 en fermentacin lquida con 100 g/l de sacarosa inicial. A) Micelio con 12 horas de crecimiento (IOOX). B) Pellet con 24 horas de crecimiento (IOOX). C) Pellet con 48 horas de crecimiento(IOOX). D) Pellet con 60 horas de crecimiento (50X).
AI principio del cultivo lquido observa crecimiento se un
en forma micelio de
disperso. A las 24 horasseobservalaformacindeunazonapigmentadacon
90
micelio altamente compactado que sirve como centrode crecimlento para Aspergillus
niger en etapas posteriores crecimiento. de Tras
48 horas de cultivo puede
observarse formacin la
de dos zonas dentro
del pellet: el centro con micelio de la mayor
altamente compactado y una zona de micelio joven sin compactacin. AI final fermentacin se observa que la zona de micelio entrecruzado representa la parte del micelio total pigmentacin obscura. Esta del cultivo y el centro pellet del ha sido reportada un como paso
ague presentando una inlclal de la
esporulacin en cultivo superficial, pero en fermentacln liqulda est6 presente desde tiempos tempranos del ciclo de vida.
Es en momento este cuando
empieza a
observarse esporulacin en zonas de micelio por arrlba
de la linea de flotacin del la matriz liquida del
micelio, pero la esporulacin no serealiza en el intenorde cultivo. Mientras en cultivo superficial la mayora de
los hongos filamentosos. incluyendo a
los del genero Aspergillus, desarrollan hifas superficiales, sumergidas o areas, en

cultivo sumergido el crecimientode las hifas e!s tridimensional, lo queda como
resultado una gran variedad de formas de cultivo de
las cuales el crecimiento en
forma de pellet esfrico es la ms comn. La formacin de los pellets est regulada por la agregacin de las esporas, los tubos germinatlvos y el micelio suelto y la baja concentracin de
O2 que parece estar relacionadauna a mayor
velocidad de
ramificacin (Berry y col., 1977; Cocker y Greenshiel. 1977). En microbiologa industrial se acepta de manera general que la forma de crecimtento ms adecuado
para la FL es en forma de pellet esfrico debido a que .facilita la filtracin. Pero, an cuando los pellets mejoran las propiedades de transferencia de oxigeno al interior del
91
hongo comparada con el miceliodisperso,producen crecimiento aerbico se realiza solamente
un centroanaerbicoy
el
en la periferia del pellet y el centro del otras rutas metablicas que
pellet se forma una zona anaerobia donde se inducen
disminuyen el rendimiento de la biomasa y las protenas (Solomon, 1975; Pirt, 1972). Se ha sugerido que el crecimiento en forma de micelio se da como respuesta autotropismonegativo,debidoalaacumulacindetoxinas esporas, pero existe otra hiptesis de que de
en la vecindad de las es una
el tipo de crecimiento miceliar
respuesta quimiotrpica a los gradientes de oxgeno y nutrientes del medio y como un mtodo ms eficiente para cubrir todo el substrato rpidamente. El mezclado en fermentacinlquidaimpide la formacindegradientes
lo que podraexplicar el
crecimiento en forma de pellets (Laukevics y col.,11985). Una observacin muy interesante de las microfotografas es la tincin diferencial que se observa entre las puntas de las hifas y el micelio compacto. Estas diferencias
podran estar relacionadas con dos fenmenos: e azul de metileno es un colorante l especfico de pared de hongos filamentosos y parece tener una mayor afinidad la por glucosamina altamente entrecruzada, de esta manera las paredes ms viejas del
cultivo al teneruna mayor concentracin de glucosaminasentrecruzadastendrn ms afinidad por el colorante. El segundo evento es el entrecruzamiento de las hifas que puede resultar en un menor lavado del colorante en preparacin y contribuir a la dar un color ms obscuro en fotografas (Johansen, 1940). las En lafigura
3.4.2 se muestran las microfotografasdecrecimientode
Aspergi//us
niger sobre espumade poliuretano.
Figura 3.4.2 Microfotografas de Aspergillus nigcer crecidos sobre poliuretano A) miceliotras6horasdecrecimiento (IOOX). B) Detalledemiceliocon 12 horas de crecimiento (400X). C) micelio con 36 horas de crecimiento (IOOX). D) micelio con 42 horas de crecimiento X). (100
Puede observarse (A) la presencia de centros de crecimiento miceliar filamentosoen las trabeculasdelpoliuretano,enlapartederechasepuedeobservar el PUF tal
como es antes de crecimiento del micelio mostrando las trabeculas limpiascon una y delgada capa de agua. Puede observarse
(B)que Aspergi//us niger forma puentes

de las
entre las trabeculas poliuretano, del usando est.as mismas soporte como crecimiento. AI crecer en forma de zarcillo trabeculas y seanclasobre el micelio se adhiere alrededor de
el poliuretano.Puedeapreciarse
(C) la formacinde
redes de micelio que empiezan a llenar
los espacios areo del poliuretano. Puede

espaciloareodelpoliuretano
observarse (D) que el micelio ocupa todo el
lo cual
93
seguramente favorece un ambiente anaerobio y julnto con el agotamiento de la fuente de carbono se induce la esporulacin. En la tabla 3.4.3se muestran los valores obtenido's a partir de la medicin directa de las fotografas de fermentacin slida.
Tabla 3.4.3: Medidas obtenidas en poliuretano.
los cultivos de Aspergillus niger
sobre
Trabecula de Capa
agua
Mnimo
I
Mximo Promedio Desviacin Standard

No. de muestras
2200
787
260 20 1
70
62
9 50
1
I
355
1O0
1
15
1O0
Los valores mostrados en la tabla 3.4.3se utilizaron para obtener el valor crudo de relacin a/v y la superficie de cultivo, valores que podran explicar algunas de las
diferencias encontradas entre fermentacin slida y fermentacin lquida. Dado que el grosor de la capa de agua es muy pequeo, la transferencia de oxgeno debe ser muy alta de acuerdo con la ley de Fick. Esto junto con la relacin de a/v de 161
cm2/cm3y el valor de rea total de cultivo de superficiedeintercambiodeoxgeno,queayudaraa oxgenonecesarioparacubrir
4032 cm2, que representa una gran
mantener el suministro de de lafermentacin
los requerimientolsdeoxgeno
slida con altas concentraciones de sacarosa.
Las fotografas reproducenlos eventos de crecimiento reportados por Auria y col., en 1990y1993,quienescrecieron las microfotografasobtenidas crecimiento: 1: Germinacin, observa se crecimiento (0-6horas). 2. Crecimiento vegetativo: la elongacin de las hilas ocupa el espacio libre presente en el poliuretano (12 a36 horas).
3. Fasedelimitacindelcrecimiento:noseobservamscrecimientodel
Aspergillus niger en amberlita como substrato. inerte,
I
en estetrabajomuestran
las siguientes fases de
la formacin de centros germinacin de
c o n poco
micelio
vegetativo, en este momento se ha agotado aproximadamente el 95% del substrato, se inicia la formacin de las conidias. (42 a 48 horas).
4. Esporulacin: forman se
las conidias en la punta de las hifas areas y las
cleistotecias y las conidias maduran (48 h). Los tiempos y el tipo de crecimiento definidos por nosotros y por Auria y col. (1993) son muy parecidos a que obtenemos nosotros. los La diferencia principal entre estos dos sistemas de crecimientoque en amberlita el es crecimiento se lleva a cabo por medio del crecimiento superficial y en el poliuretano se lleva acabo al interiordel substrato. Laramificacintpicade
los hongos filamentososresultaenmiceliosuelto,
que
termina llenando el espacio areo y el espacio disponible. Esto resulta ser la mayor limitante para la capacidad mxima decrecimieintode
los hongos en el substrat0
slido (Laukevics y col., 1985).
Al calcular la densidad de crecimiento por volumen de reactor en lugar de volumen de medio, se obtuvieron en promedio 13.6 gramos de biomasa por litro de reactor, este valor esta muy lejano los 80 g/l de biomasa que de pueden llegar a obtenerse en fermentacin lquida bajolas mejores condiciones. Laukevics y col. (1 985) reportaron densidades de biomasa por litro de reactor en fermentacin slida de entre
5 y 20
gramos de biomasa por litro de cultivo para diversos cultivos, mientras que Auria y col. (1 995) encontraron densidades de cultivo de limitacinsedebe 15 g/l de reactor, al parecer esta en este
al llenado del espacio areo delsoporte;auncuando
trabajo no encontramos esta limitacin, al revisar las fotografas puede observarse que el espacio areo del poliuretano encontraba al se llenomomento de la
esporulacin, lo que indica que nos encontramos (cerca de la saturacin del sistema. Segn Laukevics
y col. (1985),
la saturacin espacio del areo el en soporte
empacado, es la mayor limitacin para el desarrollo de la fermentacin slida, pero esto, no impide que la fermentacin slida tenga una mayor productividad fermentacin lquida. Estasobservaciones pueden ser de intersparacaracterizardiversossoportes que la
slidos en funcin del rea de contacto con la atmsfera y del volumen intersticial o del tamao del porodel material.
Figura 3: Esquema de crecimiento de Aspergilh niger en fermentacibn s6lida sobre espuma poliuretano, de concebidapartir a de las fotografas y las mediciones realizadas.
En la FS puede observarse que la capa de agua que rodea poliuretano esdelgada, al esto es debido a la superficie por unidad de volumen del poliuretano. Esto facilita
enormemente la transferencia de oxgenoentre el aire y el hongo, tal como se muestra en la figura 3. Adems, el hongo se desarrolla hacia en espacio areo del poliuretano. Lo que facilita aun ms la transferencia de oxigeno hacia la biomasa.Se debe puntualizar que la transferencia grandes espacios areos como de oxgeno slo es efectiva en cultivos con
el poliuretano, que ya
los cultivos que
utilizan
desechos agroindustriales como la pulpa de cafel bagazo de caa el salvado de 10 o trigo estn obligados a ser aireados de manera forzosa para permitir el crecimiento de organismos aerbicos(Ikasari y Mitchell, 1998).
Tomasini y col. (1997), demostraron que el policrretano no es un soporte adecuado para la produccin cido de giberlico, mientras que agroindustrial. comoelbagazodecaa produccin y biomasa.
Lo anterior indica que
los soportes de
origen
les permitieronobtener altos niveles de
se debe cuidadosos ser al un elegir substrato para
fermentacin slida y cumplir con las normas estipuladas por Raimbault(1998) y por Pandey y col. (1999), quienes afirman queuno de los pasos claves para la obtencin de un cultivo slido es la eleccin de un soporte adecuado para el organismo y para
el proceso.
98
Discusin general:
En los aos 70s hubo un gran entusiasmo de que la fermentacin slida sera una alternativa viable a la fermentacin lquida convencional, puesto que muchos
metabolitos de alto costo como enzimas, metabolitos primariossecundarios pueden y ser producidos por ste mtodo de cultivo, ademds se pensaba que la fermentacin slida podra ser una tecnologa importante para
los pases en vas de desarrollo

es
debido a que la inversininicial que se requiereesbaja,elmediodecultivo la cantidad agua de utilizada normalmente barato y simple de preparar,baja normalmente reduce el riesgo de contaminacin del cultivo, la fermentacin slida
ofrece condiciones de cultivo que son muy parecidas a las que existen en el hbitat natural del hongo ( Viniegra, 1988; Raimbault, 1998). Sin embargo, estas ventajas no han podido explotarse a gran escala, debido a que hace falta un mayor conocimiento que permita la utilizacin de la fermentacin slida
con substratos locales de bajo
costo y la produccin de metabolitos con procesos de baja tecnologa. Hasta la fecha existe una falta importante de conocimiento bsico y de ingeniera
relacionados con la fermentacin slida. Mucho del trabajo que emprico o cualitativo,por lo quefaltandatoscluantitativos Pandey y col. en 1999 resumieronestaproblemticacon
se ha realizado es
y fisiolgicosbsicos.
la siguientefrase: esta
bien establecido que la fermentacin slida es un sistema de cultivo ms productivo quela fermentacinlquida,perohasta la fecha ha no podido establecerse de
manera claraa que se debe este fenmeno.
Uno de los problemasprincipalespara
el estudiode la fermentacinslida es la
dificultad de medir la biomasa .producida por mtodos directos. Esto se debe
a que
en la fermentacin slida el micelio se desarrollade manera intima con el soporte y lo invade. Adems, cuando
se utilizan soportes biodegradables
el hongo crece a
expensas del soporte impidiendodeterminacin la
de la cantidad de carbono
consumido por el hongo y dificultando la obtencin de un balance de carbono fiable. Los intentos de determinar la biomasa producida en fermentacin slida por medio de la medicin de las cantidades de componentes' de la pared, protenas o DNA, no han sido fructferas y en su mayora son inexactas o sufren de interferencias debidas al substrato. La utilizacin de soportes inertes ha tropezado con la modificacin de
las condiciones de cultivo porla presencia del soporte, como en el caso del uso de la amberlita (Desgrandes y col., 1991; Roche y col.., 1993;Auria y col., 1990,1993, 1995; Raimbault, 1998).
El uso de soportes biodegradables ha dificultado tambin el estudio de la represin

catablica en fermentacinslida,debidoaque
los soportesslidosdeorigen
vegetal inducen la sntesis de enzimas no deseadas, la co-induccin de las enzimas de inters o lainterferencia del soporteconladeterminacin enzimticas de inters. Uno de los problemas que se enfrentado han hasta comparaciones entre la fermentacin slida realizadoutilizando el da hoy de es que las han de de lasactividades
y la fermentacin lquida se
medios de cultivo diferentes,
donde el medio decultivo
fermentacin slida es normalmente mucho ms riico que el medio de fermentacin lquida.

1O0
.. .
"111
La utilizacin
de matraces agitados
en este trabajo, cuando an se
sabe
ampliamente que se trata de slstemas que estn llmltados por la baja transferencia de oxgeno del aire al medio de cultlvo. obedece a quesetrata de los sistemas
normales de cultivo en laboratono y a que se trata del mtodo de cultivo utilizadopor todos los investigadores que han realtzado comparaclones entre fermentacin slida
y fermentacin liquida (Henzler y Schedel, 1991).
La fermentacin slida cuenta tamblen con una serle de limitantes importantes antes de desarrollarse poder como una altematlva gran vlable escala a la hmitacin crecimiento del por para la la
fermentacin liquida. La importante ms es saturacindelespacioareo, debido a que es inherente
limitaan que es fundamentalen al soporte. Un soporte,parapoderactuar
el medio slido como tal en
fermentacin slida, debe ser un medio con una (gran superficie de crecimiento por unidad de volumen, usualmente con lo3 a
lo6 cm,*/cm3,al aumentar esta superficie,
el espacio areo disponible para el crecimiento disminuir, por lo que es importante encontrarelequilibrio refiere a adecuado para el organismodeinters. Otra limitacin se un
la utilizacin soportes propiedades de con mecnicas adecuadas:
soporte que tienda a desmoronarse perder su espacio areo ende tendr poco y por crecimiento, si el soporte no absorbe suficiente agula no podr soportar el crecimiento del microorganismo y si absorbe demasiada agua disminuir la actividad del agua lo que inhibir el crecimiento, lo antenor nos da una Indicacin de que la bsqueda de un substrato adecuado para la fermentacin slida que se requiere es otra rea estudio que merece ser tomada en cuenta (Raimbault. Adems, la utilizacin substratos origen de de vegetal de
1998; Pandey y col., 1999).
en fermentacin slida
1o3
enfrenta problemas de difusin de oxgeno y de dispersin de calor tal como lo han afirmado Viniegra
(1996), lkasari y Mitchell, (1998) y Marsh y col., (1998) lo que
dificulta el escalamiento de lafermentacin slida hasta niveles de inters industrial. La utilizacin de altas concentraciones de fuente de carbono aumenta diferencias las observadas entre fermentacin slida y fermentacih lquida probablemente debido a que podra agudizar los problemas de transporte en la fermentacin liquiday explotar la alta capacidad de crecimiento del hongo en FS,, y representa una de las mayores ventajas de la fermentacin slida en la degradacin de substratos agroindustriales (Viniegra, 1996).
Los resultados de este trabajo y los reportados en la literatura son muy consistentes
al demostrar que en laFLsepresentaunaacumulacinimportantede azcares
reductores, mientras que en FS no existe tal, lo que podra explicar por que no se presenta inhibicin para el crecimiento o fenmenos de represin catablica. Estos fenmenos afectan la velocidad de crecimiento y, muy probablemente, la capacidad de produccin enzimtica fermentacin en lquida. efecto Este puede derivarse
tambin de que en fermentacin slida el medio de cultivo se esparce sobre toda la superficie de cultivo, que en el poliuretano est enel orden de l*lO3 cm2 por gramo, lo que disminuye la concentracin local de fuente de carbono y restringe la accin de las hidrolasas liberadas porel microorganismo a la vecindad del micelio.
Es de inters particular en este trabajo la falta de represin catablica en Aspergillus
niger al utilizar altas concentraciones de sacarosa
como fuentedecarbono.
Est
fenmeno que no se presenta con otras fuentes de carbono ha sido aprovechado en
mltiples ocasiones para aumentar
la produccin de f3 fructo-furanosidasas por
Aspergillus japonicum (Chen y Liu, 1996), y que tieneun efecto muy importanteen el rendimiento de biomasa en la fermentacin lquida por arriba de 50 g/l de sacarosa como fuente de carbono (Nielsen, 1992;KO y col., 1994,Torres y col., 1996). Se demostr que estos fenmenos estn ligados al tipo cultivo de
y no al
comportamiento de la cepa utilizada, al usar y encontrar el mismo comportamiento para varias cepas deAspergillus niger. La documentacin del tipodecrecimiento en fermentacinslida y fermentacin
lquida permiti mostrar la dinmicade crecimiento inherente a cada tipo de cultivo y muestra de manera directa algunas de la diferencias importantes entre fermentacin slida y fermentacin lquida, es importante mostrar quela morfologa de crecimiento de Aspergillus niger en fermentacin slida es igual a que podraexplicardemanerasimple fermentacin slida. La utilizacin de poliuretano puede resultar en un avance significativo en el estudio la de crecimiento silvestre lo de la
el porqu1 de lamayorproductividad
de Aspergillus niger en fermentacin slida. Se trata de un medio limpio que permite
el estudio directo de la formacin de la biomasa y la sintesis de hidrolasas, adems,

es un medio que permite la comparacin directa de la fermentacin slida y lquida,
ya que la nica diferencia entre la FL y la FS
en este trabajo es la presentacin de
medio con y sin el poliuretano, es decir, como un lquido o como medio esun soporte slido. Al no existir absorcindel medio por el poliuretano se afect la actividad no de agua del medio de cultivo. Una consideracinextraalusodelpoliuretanocomo
1O5
".
" " l _
" .
.. .
_ I "_ u
soporte parafermentactn la solida
es el problema que puede representar la el tlempo de fermentacin, lo que es este trabajo se el tiempo de la en
evaporacin del mediodeculttvodurante
especialmente importante en cultivos con alreacin forzada. En determin experimentalmente la evaporacln agua de durante fermentacin slida sobre
el polluretano con y sin micelio, tal comoseexplica
materiales y mtodos. Los resultadosIndicaron ulna prdida del 10% del agua del cultivo sin micelio y de slo el 4 % con mlcelio. La presencia del micelio disminuy la cantidad del mediode cultivo que puede recuperarse, dados
los experimentos de
evaporacin, podra pensarse que la menor recuperacin de medio de cultivo slidos, puede deberse a que el micelio es higroscpicoy rletiene agua. Entre los siguientestrabajosadesarrollarse en estareaest
la utilizacin de
poliuretano con caractersticas drferentes: mayor espacio areo, mayor superficie de crecimiento, mayorafinidadporelagua,elusodemezclasgaseosas diferentes,
limitacin de oxgeno,el estudio de los patrones de! represin y secrecin enzimtica. En este trabajo hapodidoreproducirseconxitolamayora existentes entre FS y FL, usandocomosoporte de las diferencias
inerte alpoliuretano, que es un
sistema limpio, barato y de facil preparacin en el laboratorio. Al mismo tiempo este trabajo representa el primer paso hacia estudio el cientfico de los fenmenos
bsicos ligados a la fermentacion solida y que permitir el estudio molecular de los aspectos de crecimiento, Induccin produccin de enzimas. y
4 Conclusiones
De acuerdo con los resultados de este trabajo se conclusiones:
pueden formular las siguientes
Aspergi//us niger crece ms rpidamente, con una mayor biomasa mxima y con un
mayor rendimiento de biomasa por gramo de substrato consumido en fermentacin slida que en fermentacin lquida.
Laproduccin de invertasaest al menosparcilalmenteunidaalaproduccinde biomasa en ambos tipos de cultivo. Por lo tanto, la mayor productividad de los cultivosdefermentacinslidasedebe,a biomasa en este tipo de fermentacin. la mayory ms rpidaproduccinde
Los cultivos de fermentacin slida en poliuretano, presentan crecimiento en forma

de micelio dispersocon un granespacioareo y unasuperficiedeintercambio
gaseoso 160 veces mayor que en lquido, la cual presentan pellets con centros muy densos. De manera que las condiciones de cultivo y el tipo de crecimiento favorecen la transferencia de oxgeno al interiordelabiornasaenfermentacinslida dificultan en fermentacin lquida.
y la
Propuestas:
En este trabajo se presentaron los resultados de la comparacin del crecimiento de Aspergillus nigeren fermentacinlquidayfermentacinslida.Estos resultados
muestran el probable origen de algunas de las diferencias entre ambos sistemas de cultivo, estn pero basadas en su mayor parte en indicaciones indirectas
y el
conocimientosobre las respuestasmetablicasde
los hongos filamentosos a las
condiciones de cultivo encontradas supuestas en base alos resultados. o Otro factor tomar a determinaciones, como en cuenta es la incertidumlbre inherente algunas a de biomasa por gravimetra las en los
la determinacin de la
primeros tiempos de cultivo. Para poder probarde manera directa algunas de las ideas presentadas esta tesis, en podran implementarse algunos experimentosde comprobacin que se presentan en esta seccin. Adems, existe la posibilidad de refinar los experimentos presentados para obtener una determinacin de los parmetros de crecimiento y produccin ms exacta e implementar otros sistemas de anlisis de datos. Estasconsideracionespermitirnobtenerresultadosmsconfiables exploracin de las diferencias entre la fermentacin slida y Adems, el uso del poliuretanocomo
y mejorarla
la fermentacin lquida.
el estudio de la
un sistemamodelopara
fermentacin slida abre vastas posibilidades que ,pueden permitir el estudio de las diferencias entre fermentacin slida lquida de manera directa. y Podra determinarse de manera directa la idea de que la limitacin en el ingreso del oxgeno en la fermentacinlquida es laresponsabledelbajorendimientode
la
produccin de biomasa y de la menor produccin de
biomass por gramo de

108
biomasa. probar hiptesis Para esta podra llevarse experimentos:
a cabo los siguientes
a) Aumentar la transferencia de oxgeno en la fermentacin lquida por
medio del
uso de matraces con mamparas, y el uso de fermentadores agitadosy aireados.

b) Limitar el ingreso de oxgeno fermentacin en slida medio por del
usode
mezclas gaseosas con bajas concentraciones de oxgeno. c) Estudiar el efecto de la concentracin del oxgenoen el medio de cultivo sobre la sntesis de rnetabolitos primariosy secundarios El estudio de la regulacin de produccin enzimtica hidrolasas de en hongos
filamentosos podria realizarse por medio de siguientes experimentos: los a) Uso de mezclas con diferentes proporciones de inductor glucosa y
b) Medir los niveles de induccin enzimtica por medio
de la determinacin de los
niveles de RNAm in situ. c) Seguir la ruta de la secrecin enzimtica por rnedio de la expresin de la "greenprotein" fusionada con una secuencia reguladora y lder de una hidrolasa o por medio de inmunolocalizacin en microscopa ellectrnica. Una de las principales diferencias entre la fermentacin slida y la lquida es que el modo de crecimiento como pellets en lquido y micelio disperso en slido, resulta en diferencias importantes en los niveles actividad de metablica de
los cultivos.
Determinar los ntveles de actividad metablica de los cultivos permitira comparar de manera precisa ms algunos parmetros de produccinhidrolasas. de
Esto
requerira, determinar la proporcin de actividad del micelio activo por los niveles de
RNAr.
La utilizacin de poliuretano como soporte inerte para el estudio de la fermentacion slida puede permitir el que se midan directamente las velocidades de crecimiento de las hifas individuales y realizar observaciones por imgenes. La realizacin de estos experimentos en trabajos subsecuentes permitira explorar de manera ms directa y exacta, las diferencias exis'tentes entre fermentacin lquida y fermentacin slida medio del procesamiento de
Bibliografa
Acua-Argelles, M.Gutirrez-Rojas,M. (1995). Production

Aspergillus niger
Viniegra-Gonzlez,G.,Favela-Torres,
E.
and properties of three pectinolytic activities produced by in submerged and solid-state fermentation.
Applied
Microbiology and Biotechnology 43: 808-814.
Aguilar, C.N (2000) Tesis doctoral, comunicacin personal. Aguilar, G., Huitrn C. (1 987) Stimulation of the production of extracelular pectinolityc activities of Aspergihs sp bygalacturonicacidandglucoseaddition.
Microbial Technology. 9: 690-696. Enzyme
Andres,I. , Peberdy, J.F. (1 974) The production of invertase in Aspergillus nidulans with reference to the effects glucose and sucrose. Microbios, 1O:15-23 of Antier, P., Minjares-Carranco, A., Viniegra,
G. (1 993) Pectinase-hyperproducing
mutants of Aspergillus niger C28B25 for solid state fermentation on coffee pulp.
Enzyme Microbial Technology 15 254-260.
Archer, D. B. (1994)Enzymeproductionbyrecombinant
Technology. 19: 373-393.
Aspergillus. Bioprocess
Archer, D. B., Peberdy,
J. F. (1997) molecular The
biology of secreted enzyme
production by fungi. Critical Reviews in Biotechnology. 17(4):273-306. Auria, R., Hernandez, S., Raimbault, M., Revah, S.(,1990) Ion exchange resin: a model for state fermentation solid growth of
Techniques. 4(6): 391-396.
Aspergillus niger. Biotechnology
Auria, R., Morales, M., Villegas, E., Revah, S. (1993) Influence of mold growth on the solid fermentation. pressure drop in aeratedstate 1 Bioengineering. 41 : 1007-1O 3. Auria, R., Ortiz, l., Villegas,
Biotechnology and
E.,Revah, S.
(1 995) Influence of growth and high mold

Process
concentration on the pressure drop in aerated solid state fermentation.

Biochemistry. 30(8): 751-756.
Barford, (1990) JP.
A general model aerobic for yeast growth: Batch
growth.,
Biotechnology and Bioengineering. 35907-920,
Berry, D., Chmiel, A., AI Obaidi,
Z.(1977) Citric acid production by Aspergillus niger.
En Genetics and physiology of Aspergillus . Smith, J. E., Pateman, J. A. (Eds) Academic Press, pp 361-390. Boccas, F., ROUSSOS, S., Gutierrez-Rojas, M., Viniegra-Gonzlez, G. (1994) Production of pectinase on coffee pulp in solid-state fermentation system: selection of wild fungalisolates
of highpotencybyasimple-stepscreeningtechnique.
Journal of Food Science Technology. 31: 22-26.
Boddy, L.M.,Berges,
T., Barreau, C., Vainstein, IM. H., Dobson, M. J., Ballance, D.
J., Peberdy, J. F. (1993) Purification and characterization of an Aspergillus niger invertase and its DNA sequence. Current Genetics. 24: 60-66. Bos,
C. J.; Debets J. M.; Swart, K.; Huybers, A.; Kobus, G.; Slakhorst,
S. M.; (1988)
Genetic Analysis and the Construction
of a Master Strain for Assignment to Six
Linkage Group in Aspergillus niger. Current Genetics. 14: 437-443. Carlson, C., Botstein, D. (1982) Two differentially regulated mRNA with different 5'
ends encode secretedand intracellular formsof yeast invertase. Cell. 28: 145-1 54.
112
Carlson, M. (1987) Regulation of sugar utilizationin Saccharomyces species. Journal
of Bacteriology. 169 (1 1): 4873-4877.

Carter, B.
L. A., Bull,
A. T. (1969) Biotechnology Bioenginering
11: En 785. in
Nielsen, J. (1 Modelling growth 992) the
of filamentous fungi. Advances
biochemical Engineering/Biotecnology. 46: 187-1223. Chavira,R.J.R.,Burnett

, T. J., Hageman, (1 J. 984) Assaying proteinases with
azocoll. Analitical Biochemistry. 136: 446-450. Chen, J. S., Saxton,J.,Hemming,

F. W., Peberoly,J.(1996Purification
and partial
characterization of thehigh and lowmolecularweightform invertase secreted by 1296: 207-21 8. Chen, W. C.,Liu,C.H.(1996)Productionoffl-fructofuranosidaseby
japonicus. Enzyme and Microbial technology. 18:153-160.
(S- andF-form)of
Aspergillus nidulans. Biochimica et Biophysica Acta.
Aspergillus
Chen-Tien, C., Yu-Yen, L., Moh-Shy, T., Cheng-Fwu, L. (1994) Purification properties p-fructofuranosidase of from
Aspergillus oryzae ATCC 76080.
and
Biochemistry and Molecular Biology International.32(2): 269-277.
Cocker, Greenshield, (1977) R., R.N. Fermenter cultivation
of Aspergillus. En
Genetics and physiology of Aspergillus . Smith, J. E.,Pateman, J. A.(Eds)
Academic Press, pp 361-390. De Winde,J.H.,Crawels, M., Hohmann, S., Thevelein,J.M.,Wlnderickx,

J.
(1996)
Differentialrequirementoftheyeastsugarkinasessensing
in establishing the
catabolic-repressed state. European Journal off Biochemistry. 241: 633-643.
113
Desgrandes, C., Vergoignan, C. George, M., Duranid, A. (1991) Biomass estimation in solid state fermentation. Applied Microbiology andBiotechnology. 35:200-205. Diaz-Godnez, G. (2001) Tesis doctoral, comunicacin personal. Dunn-Coleman, N. S., Bloebaum, P., Berka, Armstrong, G., Ward, Kodama, K. H., Baliu,
R. M., Bodie, E., Robinson, N.,

L. J.,
M., Przetak, M., Carter, L., G. LaCost, Wllson, R., E. F., Bower, B., Lamsa,
M., Heinsohn. H. (1991)
Commercial levels of chymosin production by Aspergillus. Biotechnology. 9: 976-
981.
Favela-Torres, E. Cordova-Lopez, J. Garcia-Rivero, M. Gutierrez-Rojas, M. (1998) Kinetics of growth of Aspergillus niger during submerged, agar surface and solid 103-1 07. state fermentations. Process Biochemistry. 33(:2): Favela-Torres, E., Garcia-Rivero, M., Cordova-Lopez, J., ROUSSOS, ViniegraS., Gonzalez, Gutierrez-Rojas, G., HuertaOchoa,
M., Saucedo-Castaeda, G., Gunasekaran, P.,

of Aspergi/lus niger growthathigh of the culture.
En Advances in
S. (1996)Kinetics
glucose
concentrationsindifferenttypes
solid state
fermentation. ROUSSOS, Lonsane, B.K., Raimbault, S.
M., and Viniegra-Gonzalez,
G. Ed. Kluwer academic publishers. Netherlands. Fujishima, F., Uchida, K., Yoshino, H. (1972) Enzyme production by molds in sponge culture. Journal of Fermentation Technology. 50,724-730. Gascon, S., Lampen, J. O. (1968)Purification olf theinternalinvertase of yeast.
Journal of Biological Chemistry. 243: 1567-1 572.
Gascon, S., Neumann,
N. P., Lampen, J. O. (1968) Comparative study of the
properties of the purified internal and external invertases. Journal of Biological

Chemistry. 243: 1573-1 577.
Goel, A., Lee, J., Domach, M.M., Ataai, M.M. (1999)Metabolicfluxes,
polls and
enzyme measurements suggest a tighter coupling of energetics and biosynthetic reactions associated with reduced piruvate kinase
flux. Biotechnology and
Bioengineering. 64(2): 129-1 34.
Grajek, W. P., Gervais, (1987) H. Influencewater of activity the on biosynthesis and enzymeactivitiesproducedby
enzyme
Trichoderma Viride TS in solid
state fermentation. Enzyme and Microbial Technology. 9: 658-662. Henzler, H. J., Schedel, M. (1991) Suitability of the! shaking flask for oxygen supply to microbial cultures. Bioprocess Engineering. 7: 123-1 31. Herrera, T., Ulloa, M. (1990) El reino de los hongos Micologa bsica y aplicada.
1a Ed., Fondo de Cultura Econ6mica. Mexico.
Hesseltine, C.
W.
(1972) Fermentation. Solid State
Biotechnology
and
Bioengineering. 13517-532.
DA. Mimicking gas Ikasari, L., Mitchell, (1998) enzyme production by
and temperature changes during
Rhizopus oligosporus in solid-state fermentation.
Biotechnology Letters. 20: 349-353.
Johansen, D. A. Plant Microtechnique. 1'' Ed. McGraw-Hill. U.S.A. 1940. Kluyer A. J., Perkin, L. H. C. (1933) Methods to study the metabolism of molds. En
Genetics andphysiology of AspergMus . Smith, J. E., Pateman, J. A. (Eds)
Academic Press, 1977, pp 361-390.

115
KO, y . F., Bentley, W. E., and Weigand, W. A. (1994) A metabolic model of cellular energetics and carbonduring flux aerobic Escherichia
Biotechnology and Bioengineering. 43:847-855. coli fermentation.
Kubicek-Pranz, E. M., Mozelt, M., Rohr, M., Kubkek, C. P. (1990) Changes in the concentration of fructose-2,6-biphosphate in Aspergillus niger during stimulation of acidogenesis elevated by sucrose concentrations.
Acta.1033: 250-255.
Biochimica et Biophysica
Kulmburg, P., Sequeval, Identification of
D., Lenouvel, F., Mathieu,
M., Felenbok, B. (1992)

in the autoregulation of the
the promoter region involved
transcriptionalactivatorALCR
6i0l0gy. 12(5): 1932-1 939.
in Aspergillus nidulans. Molecular and Cellular
Kuster-van Someren,
M. A., Kester,
H. C. Samson, M.,
R. A., Visser, J. (1990)
Variation in pectinolityc enzymes of the black Aspergilli: A biochemical and genetic approach. In Modern Concepts in Penicillium and Aspergillus classification, J.
I. Pitt and R. A. Samson Eds. Plenum Press, New York, pp 321-334.
Lapadatescu, C., Bonnarme, P. (1999) Production of aryl metabolites
in solid-state
fermentations of the white-rot fungus Bjerkandera adusta. Biotechnology Letters.

21:763-769.
Laukevics, J. J, Apsite, A.
F.,Viesturs, U. S., Tengerdy, R. P. (1985) Steric hindrance

in solidsubstratefermentationon
wheat straw.
of growthoffilamentousfungi
Biotechnology and Bioengineering. 27:16874691.
Lekha, P. K.,Lonsane, B.K. (1994)Comparati'vetitres,locationandpropertiesof tannin acyl hydrolase produced by Aspergillus niger PKL 104 in solid-state, liquid surface and submerged fermentations. Process Biochemistry.29:497-500. Liu, F., Li, W., Ridgway, D., Gu, T., Moo-Young, M. (1998) tnhibition of extracellular protease secretion by Aspergi//us niger using cell immobilization. Biotechnology
Letters. 20(6) 539-542.
MacKenzie, D.A., Jeenes,
D.J., Belsaw, N.J. Archer, 0.6. (1993) Regulation of

and
secreted proteins production filamentous by fungi: Recent developments perspectives. Journal of General Microbiology. 193: 2295-2307. Marsh, A. J., Mitchell,
D. A., Stuart, D. M., Howes, T. (1998) O2 uptake during solid-
state fermentation in a rotating drum bioreactor. Biotechnology Letters. 20(6): 6761 1. Mavituna, F., Sinclair,
C.G. (1985) A graphical method for the determination of critical

Biotechnology Letters.
biomass concentration non-oxygen-limited for growth. 7(2):69-74.
Miller, G.L. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination Reducing of Sugar. Analytical Chemistry. 31 (3):426-428. Minjares-Carranco, A, Trejo-Aguilar, B. A., Aguilar,
G., Viniegra-Gonzlet, G.(1 997)

Aspergillus
Physiologicalcomparisonsbetweenpectinase-producingmutantsof
niger adapted either solid-state to fermentation submerged or fermentation. Enzyme and Mycrobial. Technology.21: 25-31,
117
Moo-Young, M., Moreira A. R., Tengerdy R. P. (1983). Principles of Solid-Substrate Fermentation. En: The Filamentous Fungi. Vol. IV Fungal Technology. Esis, E.;
E. Smith; D. R. Berry & B. Kristiansen, (Edit.), Arnold, London. pp 117-143.
Mukherjee, K., Sengupta,S. (1985) production The inulinase by mushroom the
of constitutive invertase
and
Panaeolus papillonaceus in submerged culture.
Canadian Journal of Microbiology. 31 :773-7'77.
Mukhopadhyay, S. N., Ghose T.K. (1976) Oxygen participation
in fermentation
(Oxygen microorganism interactions). Process Biochemistry, June: 19-27. Modellinggrowth the of filamentous fungi. Nielsen, J. (1992)
biochemical Engineering/Botecnology.46: 187-223. Advances in
Oriol, E., Schettino, B., Viniegra-Gonzlez,
G.,Raimbault, M. (1 Solid 988)
state
culture of Aspergillus in support. Journal of Fermentation Technology. 66: 57-62 Pandey P., Selvakumar, P., Soccol, C. R., Nigan, P. (1999) Solid state fermentation for the production of industrial enzymes. Current Science. 27(1): 491-1 62. Recent Pandey, A. (1992).
Process Developments Solid in State Fermentation.
Process Biochemistry. 27: 109-1 17.
Peberdy, J.
F. (1994)Proteinsecretion in filamentousfungitryingtounderstand
highly productive black box.Trends in Biochemistry. 12: 50-57. Prez J. A., Rodriguez, J., Rodriguez,L.,Ruiz,
T. (1996)Cloningand
sequence
analysis of theinvertase gene INV 1 fromtheyeast

Genetics. 29:234-240.
Pirt, J. (1975) Principles of microbial, and
Pichia anomala. Current
cell cultivation. Academic Press.
Blackwell Scientific Publications, London.

118
Pontecorvo, G.; Roper, J. A.; Hemmons, L. M.; McDonald, M. K. D.; Bufton, A. W. J. (1953). The Genetics of Aspergillus nidulans. Advances in Genetics. 5: 141 -238. Quiroga, E. N., Vattuone, M. A., Sampietro, A. Purification R. (1995) characterization of theinvertasefrom
Biophysica Acta. 1251: 75-80. Pycnopoms sanguineus.
and
6iochimcaet
Raimbault, M. (1998) General and microbiological aspects of solid state fermentation. Process Biochemistry, l(3) in Electronic Jourrlalof Biotechnology.www.ejb.org Ramamurthy, V., Kothari, R. M. (1993) Journal of Biotechnology. 27: 349-354. En Liu,
F., Li, W., Ridgway, D., Gu, T., and Moo-Young,
M. (1998) Inhibition
of
extracellularproteasesecretionby
Aspergilluls niger using cell immobilization.
Biotechnology Letters. 20(6) 539-542.
Ramesh, M. V., Lonsane, B. K. (1 991a) Abilityof solid state fermentation technique to significantlyminimizecatabolicrepressionofa-amylaseproduction by Bacillus
lichenifomis M 27. Applied Microbiolgical. Biotechnology.35: 591-593.
Ramesh, M. V., Lonsane, B. K. (1991 b) Regulation of alpha-amylase production BacilluslicheniformisM27

by enzymeend-products
in
in submergedfermentation
and its overcoming in solid state fermentation system. Biotechnology Letters. 13: 355-360. Reinfenberger, E., Boles, E., Ciriacy, M. (1997) Kinetic characterization of individual hexose transporters of Saccharomycescerevjsiae and theirrelationshiptothe
triggering mechanism of glucose repression.Eurlopean Journalof Biochemistry.

245: 324-333.
Righelato, R. C.(1975)
Growth kinetics ofmycelialfungi.En
Filamentous fungi
vol.1 (Industrial mycology). Smith, J. E., Berry, D. (Eds.) Edward Arnold, London.
Roche, N., Venague, Desgranges, A., measurement to estimate fungal
C., Durand, A.
bioma'ss in
(1993) Use solid
of chitin
state fermentation.
Biotechnology Advances. 11:677-683.
Romero-Gmez, S.J., Augur,
C., Viniegra-Gonziilez, G. (2000) Invertase production
by Aspergillus niger in submergedandsolid-statefermentation.Biotechnology Letters 22: 1255-1 258. Ronne, H. (1 995) Glucose represion in fungi. Trends in Genetics. 11: 13-17 . Ruijter, G.
J. G., Visser, J. (1997) Carbon repression in
Aspergilli. FEMS
Microbiology Letters. 151: 103-114.
Shankaranand, V. S., Ramesh, M. V., Lonsane, B. K. (1992) ldionsyncracies of solid state fermentation systems in the biosynthesis of metabolites bysome bacterial and fungal cultures. Process Biochemistry. 27: 33-36.
Sols, A. (1969)Aspectsofyeastmetabolism.
Mills, A. K. Krebs, and
H. (Eds.)
Blackwell Scientific Publications. Oxford, U. K. pp. 269. Sols-Pereira, S., Favela-Torres, E., Gutierrez-Rlojas, M., ROUSSOS, SaucedoS., Castaeda, Gunasekaran, G.,
P., Viniegra-Gonzlez,
G. (1996) Production of
pectinases by Aspergillus niger in Solid State Fermentation at high initial glucose concentrations. World Journal of Microbiological. Biotechnology. 12: 257-260. Solis-Pereira, S., Favela-Torres, E., Viniegra-Gonzlez, G.,Gutierrez-Rojas, M. (1993) Effects of different carbon sources the on synthesis of pectinases by
120
Aspergillus
niger in submerged and solid
state fermentation.
Applied
Microbiological Biotechnology. 39: 36-41.
Solomon, R. (1975) Growth of Aspergillus in liquid fermentors. En Filamentous fungi
vol.1 (Industrial mycology). Smith, J. E., Berry, D. (Eds.) Edward Arnold, London.
Sorensen, T. K-., Wallis, G. L.
F., Peberdy, J. F. (1996) Fungal protoplast as took for
studies on protein secretion. Biotechnology Letters.18(12): 1375-1 380. Tao, S., Peng, L., Beihui, L., Deming, L., Zuohu, rice chaff for fibrinolytic production enzyme
L.. (1997) Solid state fermentation of

by
Fusarium oxyspomm.
Biotechnology Letters. 19(5): 465-467.
Tengerdy, R. D (1985). Solid Substrate Fermentation. Elsevier Science Publishers.
200:96-99.
Tomasini, A., Fajardo,
C.,Barrios-Gonzlez, J. (1997)Gibberellic acid production
using different solid-state fermentation systems. World Journal of Microbiology
& Biotechnology . 13:203-206.

Torres,
N. V., Riol-Cimas, J. M., Wolschek, M, Kubicek, C. P. (1996)
Glucose
transport by Aspergillus niger: The low-affinity carrier is only formed during growth on high glucose concentrations. 44:790-794. Vainstein, M. H., Peberdy, J. F. (1990) Solubilization of a cell wall invertase in
Applied Microbiology and Biotechnology.
Aspergillus nidulans. FEMS Microbiology Lettens. 71: 265-270.
Viniegra-Gonzlez,
(1988). Perspectives and Limitations
Solid-state of
Fermentation in Mexico.En:Raimbault,
M. (Edit.). Solid-Sate Fermentation in
121
Bioconversion of Agroindustrial Raw Materials. ORSTOM, Montpellier, France.
pp 67-72. Viniegra-Gonzlez,
G. (1996) Solid statefermentation:Definition,
characteristics,
limitations and monitoring. En Advances in solid state fermentation ROUSSOS, S. Lonsane, B.K., Raimbault, M., and Viniegra-Gonzalez,Kluwer G. academic publishers Netherlands. Walsh, M.C., Scholte, M., Valkier, J., Smiths, H.P., VanDam,
K. (1996)Glucose
require the
sensing and signalling properties in Saccharomyces cerevisiae
presence of at least two members of the glucme transporter family. Journal of

Bacteriology. 179: 2593-2597.
Wallis, G. L. F., Hemming,
F. W., Peberdy,
.I. F. (1997) Secretion
of two
6-
fructofuranosidases by Aspergillus niger growing in sucrose. Archives of

Biochemistry and Biophysics. 345(2): 214-222.
Wessels, J. G. H. (1999) Fungi in their ownright. Fungal Geneticsand Biology. 27: 134-1 45. Xu, D.B., Madrid, C. P., Rohr, M., Kubicek,
C. P. (1989)The influence of type and
concentration of the carbon source on the production of citric acid by Aspergillus niger. Applied Microbiological Biotechnology. 30: 553-561. Ye L., Krukceberg Berden, A.L.,
J.A. Van Dam,
K. (1999) Growth and
glucose cells
repression are controlled by glucose transport in Sacharomyces cerevisiae
containing only one glucose transporter. Journal of Bacteriology. 181 (15): 46734675.
122
Zhu, Y., Smits J. P., Knot W., Bol J. (1994) A novel solid-state fermentation system using polyurethane foam as inert carrier. Biotechnology Letters. 16(6): 643-648.
123

Produccion de Invertasa Por A (1) .Niger en Fermentacion

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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

Casa abiertaal tiempo

Produccin de lnvertasa por A,spergillus niger en Fermentacin Lquida y Fermentaci6n Slida

TESIS Que para obtener grado de el Doctor en Ciencias Biolgicas PRESENTA

Sergio de Jess Romero Gmez

Tutor: Dr. Gustavo Viniegra Gonzlez

Asesor: Dra. Amelia Farrs Gonzlez-Sarabia cI;&.L,

Asesor: Dr. Christopher Augur

Sinodal: Dr. Ernesto Favela Torres

Sinodal: Dr. Sergio Huerta O &

Sergio de Jess RomeroIGmez

Tutor: Dr. Gustavo Viniegra Gonzlez

Asesor: Dra. Amelia Farrs Gonzlez-Sarabia

Asesor: Dr. Christopher Augur

Sinodal: Dr. Ernesto Favela Torres

Sinodal: Dr. Sergio Huerta Ochoa

Hongos filamentosos ........................................................................

Hiptesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 . Material y Mtodos.......................................................................

la concentracin inicial de sacarosa sobre

107 108 111 124

la adicin de cantidades crecientes sacarosa de

crecimiento del organismo (p), el nivel mximo de la biomasa () X ,

indices se pretende demostrar la si

gramo1 de biomasa y siestose

de crecimiento micelio del dentro cada de

fueron mucho mayores en fermentacin slida

que los obtenidos por fermentacin

del caldo de cultivo con

proteoltica fue 6.5 veces menor en la fermentacin slida que lquida.

slido, este organismo creci en forma de un micelio disperso

biomasa por gramo substrato de

3. Los cultivos de fermentacin slida

con un gran espacio areo mayor clue en lquido.

intercambio gaseoso 160 veces

The purpose of thepresentstudywasto

compare the productivity of a fungal

concentrations as invertase inducer

biomass yields per substrate gram and culture productivity

(P) from solid

comparison of the above parameters was done toevaluatewhetherthe

(p.) was higher than to solid in

maximal and higher biomass

yields in SSF than SmF.

2. Invertase production is at least partially associated to biomass production In both

El mercado de enzimas utilizadas en procesos industriales representa alrededor de

nuevas en procesos conocidos (Archery Peberdy, 1997). Lamayorade las enzimasutilizadasenprocesosindustrialesseproducen

sntesis de enzimas excretadas medio que los cultivos de FL al

lugar de tejidos. Los hongos no

a sus organelos, estableciendo as, continuidad la

Los hongos filamentosos comnmente son conocidos como

taxonmica y seaplica a una variedaddehongosquecrecencomo

de! hongo, pero

o conidias y se distinguen por

de las ramificaciones se maduras se dispersan en el

denominan sterigmata secundarias. esporas Las

ambiente y en condiciones adecuadas dan origen a otra colonia de hongos (Herrera

Taxonmicamente los hongosestnagrupados dentro del reino

es complicada y se basa principalmente

umycota (hongos verdaderos)

Los Deuteromicetos y los Ascomicetossonhongosfilamentosos,de

los Deuteromicetos, famllla

Eurotium, y se caracteriza por presentar: hifas septadas, esporas asexuales llamadas

reproductoras llamadas conidiforos que dan origen, en negras, lo que da el nombre de