Utilisation de la spectromtrie de masse pour diverses tudes protomiques en 2007-2008

Anas AULAS, Alessandro BALLESTER, Joseph BAREILLE, Hannah BENISTY, Naciba DAHMANI, Emilie DELVERDIER, Yoana DIMITROVA, Kevin DROMER, Karine JACQUET, Mathias MANGION, Paola MUNOZ, Thomas PRUDHOMME, Sandrine RAZAFIMAHATRATRA, Karine ROTTIER, Farah ZMIRI,

Promotion EGPR 9

1 Professeur rfrant : Franois COUDERC

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ETUDES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES
La glycosylation
Gnralits Caractrisation des sites de glycosylation Diagnostic par quantification de la glycosylation Diagnostic par tude de la glycosylation tudes du profil de glycosylation

4 5 5

La phosphorylation
Gnralits Techniques danalyse de peptides phosphoryls Indentification des sites de phosphorylation La quantification Prsomption de sulfatation artefactuelle

10

Autres modifications
Gnralits Sulfatation de la tyrosine Actylation de la lysine Formation de dhydroalanine

15

QUANTIFICATION EN SPECTROMETRIE DE MASSE DES PROTEINES 20

Techniques de quantification protique en MS

20

Quantification absolue : AQUA Marquage isotopique in vivo pour quantification relative: ISIS (Isobaric SILAC with Immonium Ion Splitting) Amlioration de la technique iTRAQ par fractionnement OFFGEL

Applications lenvironnement mdical.

25

Gnralits Dtection et quantification du facteur ltal de lanthrax dans le srum par spectromtrie de masse Mise au point dun test de dpistage de la maladie de Wilson par LC-MS/MS.

APPLICATIONS
Applications mdicales
Modifications post-traductionnelles. Recherche de biomarqueurs

30 30

Applications en protomique vgtale

34

Gnralits Identification des changements du protome dans des feuilles de bl, en rponse un stress salin par tablissement de cartes peptidiques massiques Identification des protines des feuilles de riz dont lexpression est induite en rponse au froid par squenage peptidique par spectromtrie de masse en mode tandem. Etudes des modifications post-traductionnelles des histones par mthode classique. Identifications des protines chloroplastiques et de leurs modifications.

CONCLUSION REFERENCES

37 38

INTRODUCTION
Lanalyse du protome reprsente un enjeu majeur qui permet daccder des donnes fondamentales. Les tudes en protomique sont en effet en grand essor depuis le dbut des annes 2000 et la spectromtrie de masse apporte un grand soutien dans la comprhension des mcanismes de rgulation des protines ainsi que dans les voies o elles sont impliques. Elle est un outil indispensable dans cette approche dtude et de caractrisation des protines. En constante volution, elle est souvent couple dautres techniques danalyse permettant daugmenter la sensibilit de dtection et donc danalyse. A travers cette revue nous avons essay de donner un aperu des capacits de la spectromtrie de masse dans des tudes touchant des domaines divers et varis. En effet, cette technique permet dtudier les nombreuses modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, la glycosylation De part ces analyses en spectromtrie de masse, un aspect quantitatif des protines et de leurs modifications peut tre abords. Diffrentes applications dans le domaine mdical ou vgtal utilisables en routine ou non, sont galement traites dans cette tude.

ETUDES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES

De faon gnrale, les modifications post-traductionnelles sont identifies par MALDI-TOF MS/MS ou par ESI-TOF MS/MS. Lanalyse des ions issus de la fragmentation met en vidence les modifications post-traductionnel006Ces caractrises par un incrment de masse correspondant lajout de groupement chimique.

La glycosylation
Gnralits Les protines glycosyles sont gnralement destines tre scrtes ou tre intgres la membrane plasmique. Les chanes de polysaccharides sont souvent ramifies et font varier de 1 50% la masse de la protine. Dterminer la structure des glycoprotines est actuellement l'un des travaux les plus difficiles puisque chaque ose possde plusieurs hydroxyles libres pouvant interagir avec un autre ose ou un autre compos. Ainsi, la possibilit de former des diffrents de polysaccharides est immense. Par ailleurs, on distingue la N-glycosylation (sucre li lAsn) et la O-glycosylation (Ser & Thr). Ici nous tudierons la dtermination les sites de glycosylation ainsi que des squences consensus de ces sites. Egalement dans une autre optique nous tudierons la comprhension des mcanismes de certaines maladies et leur diagnostic ainsi que le dpistage de maladies (les troubles congnitaux) et la glycosylation danticorps thrapeutique recombinant. Caractrisation des sites de glycosylation Les expriences de la publication de Gross et al. visent ltude de la glycosylation de la protine HMW1. LHaemophilus influenzae HMW1 est une adhsine bactrienne possdant un ou plusieurs sucres N-lis par une glycosyltransfrase. Cette adhsine est responsable du Human Respiratory Tract Disease .

Peptide non modifi Peptide modifi

INITK
[M-162 + 2H]++ [M-162 + H]+ m/z= R + 18 + 2

Figure 1 : Exemple dun spectre MS/MS du peptide. INITK m/z= 750.3 permettant lidentification du rsidu portant la modification de 162Da porte par le y4 vert.
b2-162 y4 -162 y4 : R + 162 +19

Des tudes prliminaires de digestion la PNGase F, clivant les N-glycosylations, ne modifient pas la taille de la protine suggrant une O-glycosylation ou une N-glycosylation non reconnue par lenzyme. Des expriences de spctromtrie de masse vont permettre 5

dtudier les diffrentes glycosylation. Lanalyse des ions de MS aprs digestion trypsique rvle un incrment de masse de 162 Da par rapport aux masses attendues et ce, pour divers peptides trypsique. Lanalyse des peptides trypsiques permet lidentification, grce aux ions fragments, du rsidu portant la modification de 162Da (fig. 1). Afin didentifier la modification suppose tre un hexose, une exprience de remplacement de protons changeables en deutrium dans leau lourde est ralise par MALDI-MS (fig. 2).

Hxose : 162Da

32 protons changeables

Hxose deutr : 166Da

32
Figure 2 : Remplacement au deutrium des protons changeables du peptides NVTVNNNITSHK. Haut : Spectre MALDI-MS du peptide modifi avant et aprs deutration. Bas : Structure du peptide modifi par un hexose avec tous les protons changeables (en rouge).

Cette exprience rvle un incrment de masse (ou nombre de protons changs) permettant de le corrler au type dose souponn. La diffrence de masse de 32 Da, pour le peptide dexemple correspond au nombre de protons changeables pour un hexose. De plus, les auteurs indiquent que la perte dune masse de 165Da en MS/MS correspond un hexose deutr alors quon sattend 4 OH libres soit 4H changeables: 166 Da. Pour conclure, ltude par spectromtrie de masse a permis didentifier les sites de glycosylation ainsi que le type de saccharide N-li. Diagnostic par quantification de la glycosylation Les troubles congnitaux de glycosylation (Congenital Disorders Glycosylation) sont des maladies associes des dfauts de glycosylation. Les CGD de type I prsente une diminution du taux doccupation des sites de N-glycosylation des glycoprotines. Dans le but de quantifier ce dfaut de glycosylation une mthode de multiple reaction monitoring LCMS/MS est mise au point afin par Hlsmeier et al. de remplacer la mthode actuelle base sur la technique de focalisation isolectrique. La transferrine et l1-antitrypsine sont utilises comme biomarqueurs de la maladie puisque les sites de N-glycosylation sur les asparagines sont connus. Les chantillons de personnes saines et atteintes de CDG de type I sont digrs avec de la trypsine et Asp-N. Afin de distinguer les peptides qui prsentent ou non une asparagine N-glycosyles, une digestion

la PNGase F est ralise dans H218O. Lasparagine N-lie devient un aspartate marqu avec 18 O (fig. 1) alors que les asparagines non N-glycosyle ne ragissent pas avec lenzyme. PNGase F dans H218O
18

Aspartate

Figure 1 : schma de laction de la PNGase F sur une asparagine N-lie

Les standards internes utiliss sont marqus isotopiquement comme dcrit dans le tableau de la figure 2A. Pour la MRM, ils possdent au site de N-glycosylation, soit une asparagine soit un aspartate, reprsentant ainsi les 2 possibilits de glycosylation des peptides (fig 2A). Pour le standard interne et pour chaque peptide, un ion prcurseur et. un ion fragment correspondant sont slectionns pour la transition MRM (fig. 2B). A B

Figure 2 : standard interne et ions choisis pour la MRM A) standards internes marqus utiliss pour la MRM. Peptides ATP de l1-antitrypsine et TFP de la transferrine, les acides amins marqus sont en gras souligns, les acides amins des sites de glycosylation sont encadrs, et prsentent une asparagine ou un aspartate (violet) correspondant aux peptides du srum aprs laction de la PNGase F. B) ions prcurseurs Q1 et ions fragments correspondant Q3 suivis pour la MRM. Les numros des peptides correspondent aux sites de glycosylation

Les spectres LC-MS/MS permettent didentifier les peptides (fig. 3). La quantification ralise par MRM avec le standard permet de dfinir les variations de glycosylation pour chaque site. En effet le deuxime site de glycosylation de la transferrine a des variations de modification plus importantes alors que l1-antitrypsine prsente des variations moins videntes.

Standard

chantillon

Figure 3: spectre MS/MS du peptide TFP1DK correspondant au premier site de glycosylation de la transferrine du standard et de lchantillon. LA : marquage isotopique du standard (+11Da) D : site de glycosylation prsentant un aspartate 18O (+2) aprs digestion PNGase F Lion y9 est utilis pour ce peptide comme ion fragment pour la transition en MRM et la quantification

Les rsultats permettent de dterminer que le deuxime site de glycosylation est un biomarqueur plus intressant pour le diagnostic de CDG de type I tant donn que la technique de routine de focalisation isolectrique ne permet pas de discriminer les sites de glycosylation. Diagnostic par tude de la glycosylation Le syndrome Peter Plus est induit par une enzyme inactive : la 1,3glucosyltransfrase qui est implique dans la glycosylation des thrombospondines. Dans cette tude, Hess et al. ont tudi le dfaut de glycosylation putatif dune protine faisant partie des thrombospondines tant implique dans le syndrome Peter Plus. La properdine, thrombospondine choisie pour ltude est abondante, facilement purifiable et toutes les positions du disaccharide Glc-1,3-fuc-O sont connues. Aprs purification de la properdine du srum des individus, la protine est digre par la trypsine. 4 peptides issus de la tryspinisation sont glycosyls (T7, T11, T17+T18, T23). Plusieurs glycoformes existent pour chaque peptide et nous prendrons le peptide T7 titre dexemple.

M: mannose F: fucose MMF0 (forme attendue chez les patients): G: glucose WSLWmanSTWmanAPCSVTfucCSEGSQLR 0: pas de monosaccharide M0FG WSLWmanSTWAPCSVTfuc-glcCSEGSQLR

Peptide T7 MMFG WSLWmanSTWmanAPCSVTfuc-glcCSEGSQLR

Daprs la LC/MS, la masse de la glycoforme MMFG du peptide T7 est attendue 3129.2 Da. Chez les patients malades ce peptide est absent, cependant un peptide de 2967.1 Da est retrouv. Celui-ci prsente une perte de 162 Da qui pourrait correspondre une perte de glucose (glycoforme MMF0), mais galement une perte de mannose (glycoforme M0FG) ces deux glycoformes de mme masse ne peuvent donc pas tre distingues par LC-MS.

Une analyse par LC-MS/MS est ralise afin de discriminer ces 2 glycoformes en vrifiant la prsence des mannoses et la nature de la modification porte par la thronine (fucose ou fucose-glucose) (fig. 1).

W + mannose

C E S S G b6 T

SV W GE AD

b7 b8

Q/K

Figure 1: spectre MS/MS du peptide T7 MMF0 dun patient malade. Les lettres en rouges correspondent aux acides amins dduits des ions prsents sur le spectre. Les fragments indiqus en vert reprsentent les ions utiliss pour dterminer la prsence des 2 mannoses. # :mannose sur tryptophane.

Les 2 mannoses sont identifis par les masses des ions b7 et b8. La modification sur la thronine est identifie par une perte de masse. En effet, aprs fragmentation le peptide perd les sucres O-lis sur la thronine. Le spectre MS/MS du peptide de 2967.6 Da donne un fragment [M+2H-Fuc]2+ m/z =1412.3 donc M = 2822.6Da (fig. 1) soit une perte de 142 Da correspondant une perte de fucose et non de glucose. Ce peptide trypsique possde donc 2 mannoses et un fucose : MMF0. Aprs lanalyse de tous les peptides trypsiques glycosyls (T7, T11, T17+T18, T23) aucune glycoforme ne possdant la modification Fucose-Glucose nest trouve chez les personnes atteintes du syndrome Peter Plus confirmant que cest une maladie congnitale de glycosylation . Les auteurs ont par la suite mis au point une mthode de quantification relative par MRM (multiple reaction monitoring). Une normalisation est ralise avec des peptides non glycosyles dont la quantit ne varie pas. La fiabilit de cette technique nest pas vidente puisque les peptides utiliss pour la normalisation ne co-migrent pas, ne permettant pas les mmes conditions de fragmentation. tudes du profil de glycosylation Les anticorps monoclonaux sont de plus en plus utiliss en thrapeutique. La Nglycosylation des anticorps monoclonaux a une influence sur leur efficacit, leur clairance, immunognicit, ainsi que sur leur fonction. Larticle de Lim et al. utilise une approche base sur la LC-MS afin de dterminer le profil de glycosylation et la distribution des glycorformes en fonction de la ligne cellulaire.

Les anticorps sont prpars pour librer les fragments de chanes lgres et lourdes pour lanalyse en LC-MS (fig. 1). B

Figure 1 : (A) Schma dun anticorps avec les rgions variables Fab et constante Fc. (B) Spectre dconvolu danticorps monoclonaux aprs traitement la papane et au DTT avec les diffrentes glycorformes correspondant aux rgions Fab et Fc.

Les sites de N-glycosylation ainsi que les diffrentes glycoformes sont connus. Le spectre dconvolu est attribu, ce qui permet, par la mesure de lair de chaque pic, de calculer labondance relative des glycoformes (fig 1B). Les donnes obtenues sur la distribution des glycoformes dans la rgion Fab et Fc des anticorps monoclonaux des diffrentes lignes indiquent des profils de glycosylation diffrents. Cette modification post-traductionnelle semble tre dpendante de la ligne cellulaire. Daprs les auteurs, cette mthode permet donc dobtenir des informations sur le profil de glycosylation des anticorps monoclonaux et de dfinir limpact des conditions de culture cellulaire sur la distribution des glycoformes et de sassurer ainsi que la glycosylation est approprie.

La phosphorylation
Gnralits C'est une modification post-traductionnelle (PTM) des protines indispensable qui intervient dans un trs grand nombre de processus cellulaires (diffrenciation, division, prolifration, apoptose, ...) et en particulier dans les mcanismes de signalisation. On estime quun tiers des protines voient leur activit rgule par une ou plusieurs phosphorylations. Actuellement plus de 500 kinases ont t identifies chez les eucaryotes. Ces enzymes peuvent ajouter un groupement phosphate sur les rsidus de Serine, Thronine et/ou de Tyrosine. Lajout de ce groupement entrane un incrment de masse de 80 (1 Phosphate (31) + 3 Oxygnes (3x16 = 48) + 1 Hydrogne (1)) (fig.1)

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 NH CH CO OH l l _ P = O CH + OH l l OH OH

NH CH CO l CH l = O l _ P= O OH l OH

Figure 1 : La phosphorylation. Le cercle violet reprsente la phosphorylation sur un rsidu de srine. Les atomes d'oxygne sont en rouge, ceux de phosphore sont en orange, ceux de carbone en gris et l'azote en bleu. Les atomes d'hydrogne ne sont pas reprsents.

Techniques danalyse de peptides phosphoryls. La plupart du temps la phosphorylation est une modification post traductionnelle qui rgule lactiv protique. Les protines natives et celles ayant subi une ou plusieurs modifications post-traductionnelles ne vont pas avoir le mme point isolectrique et vont pouvoir tre identifie laide dun gel 2D. Ainsi Parker et al. ont voulu caractriser le phnotype des protines sarcomriques de cur de rat nonatal et adulte. Ces protines sont impliques dans la contraction musculaire et leur tat de phosphorylation a un impact sur leur fonctionnement. Pour apprhender ces diffrences physiologiques un gel 2D est ralis dans lequel les protines sont spares en fonction de leur taille et de leur point isolectrique (pI). Les phosphorylations vont changer le pI de la protine, et entraner la prsence de plusieurs spots de taille molculaire identique. Des extraits de plusieurs cellules vont pouvoir tre compars sur un mme gel. Ainsi des marquages diffrents sont effectus dans chaque type cellulaire ; vert pour les chantillons de rat nonatal et rouge pour les chantillons de rat adulte (fig. 2). Les tats de phosphorylation de la tropomyosine (Tm), de la chane lgre de la myosine (MLC2), de la protine C liant la myosine (MyBP-C), de la troponine 1 (Tn1), de la troponine T (TnT) et de la chane lourde de la myosine (MHC) sont ainsi mis en vidence.

Figure 2: analyse des myofilaments protiques de rat nonatals et adultes en gel 2D. Les protines sont extraites partir de 6 rats nonatal et de 6rats adultes marqus respectivement en vert (Cy3) et en rouge (Cy5). Les 12 chantillons sont mlangs avant sparation par une lectrophorse en deux dimensions. Les spots des protines qui changent sont marqu, la tropomyosine (Tm), la chaine lgre de la myosine (MLC2), la protine C liant la myosine (MyBP-C), la troponine 1 (Tn1), la troponine T (TnT) et la chaine lourde de la myosine (MHC).

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Seulement, cette mthode ne permet pas de savoir quelle modification est ralise, quelle est sa position, ainsi que le nombre survenu. Pour rpondre ces questions, il faut raliser une analyse en spectromtrie de masse. Dans cette publication, un enrichissement au TiO2 a dabord t ralis, permettant daugmenter la concentration en molcules phosphoryles (fig. 5). Le TiO2 est greff sur une colonne, car il prsente une forte affinit pour les groupements phosphate et permet ainsi la fixation des protines phosphoryles sur la colonne. Les rendements denrichissement sont suprieurs ceux obtenus avec dautres techniques comme lIMAC.

Enrichissement au TiO2

Figure 5 : Enrichissement grce au dioxyde de titane en peptides phosphoryls et analyse en spectromtrie de masse.

Ces analyses ont permis de mettre en vidence des tats de phosphorylations diffrents ce qui explique des tats physiologiques variants dune population une autre. En effet les deux phnotypes sont diffrents et la rexpression dun phnotype nonatal chez un rat adulte implique de graves consquences pathologiques. Indentification des sites de phosphorylation HSP27 est un marqueur de langiogense. Afin didentifier les sites prcis de phosphorylation, Dai et al. vont avoir recours des analyses de fragmentation de la protine. Pour cela, ils effectuent des digestions enzymatiques (Lys-C, trysine, Glu-C) leur permettant davoir accs un recouvrement de squence de 96.1% aprs analyse en MALDI. Les chantillons sont spars en chromatographie liquide (LC) puis analyss en MS, en MS2 et en MS3 (fig. 2). Cette triple fragmentation permet de mieux identifier les diffrents profils de phosphorylation de HSP27 Dans la premire MS, les auteurs slectionnent un massif qui correspond la protine dintrt charge 3 fois. Lors de la MS2, ils tudient la fragmentation de ce pic pour sassurer de la prsence de la protine dintrt. Lors de la MS3, ils tudient le peptide susceptible de porter la phosphorylation (mais non phosphoryl dans la figure). HSP27 peut tre mono- ou pluri-phosphoryle essentiellement sur au niveau des serines 78 et 82. De plus lanalyse en LC-MS a mont la prsence dautres modifications post-traductionnelles telle que le clivage de la mthionine en N-term ainsi que lactylation de la thronine sub-terminale expose.

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795.7603
A

Figure 2 : Identification du fragment 65-87 de HSP27 contenant une phosphorylation sur la Srine 82 par une analyse en LC-MS aprs traitement avec Glu-C. A) Spectre de FITC/MS, mesure de lion prcurseur dintrt 43.43 min. B) Spectre des ions fils obtenus aprs fragmentation (CID-MS2) de lion parent (m/z 795.7603 43.43 min). C) Spectre MS3 obtenu partir dun ion fragment de MS2 (m/z 966.7 => H PO )

Dans le spectre de la MS3, on fragmente lion correspondant notre peptide dintrt ayant perdu ses phosphates. Les srines, de masse 87, perdent une molcule deau lors du dpart du phosphate et ont alors une masse de 69. Le spectre montre des fragments avec des phosphorylations de S78 ou S82. Les 2 positions doivent tre phosphoryles dans le vivant, mais correspondent-elles des activits et des kinases diffrentes ? La quantification

La spectromtrie de masse est utilise pour lidentification de protines ou de biomarqueurs prsents dans des chantillons. Dai et al. ont cherch valuer une technique de quantification sans talons interne. Dans cette tude, les chercheurs souhaitaient trouver une corrlation linaire entre la prsence de peptide phosphoryls et leur dtection. Pour faire cette tude ils ont utilis 7 peptides synthtiques diffrents. Pour chacun ils ont fait varier le taux de phosphorylation, ils ont aussi analys linfluence de la matrice ainsi que du mode sur la quantification (rsultats montrs que pour un peptide). Le peptide TSTEPQ(p)YQPGENL est analys sur la figure 1. Pour commencer, les rsultats obtenus diffrent dun matrice une autre (noir: CHCA, gris fonc: DHB, gris clair: THAP). La quantification est moins bonne avec la matrice CHCA pour les deux modes et prsente gnralement une grande sous-estimation de la prsence de peptides phosphoryl. Les matrices DHB et THAP prsentent aussi une sous-estimation de la quantification en mode positif alors quelle se rapproche des taux rel en mode ngatif. Cependant aprs tude des sept peptides, aucune rgle de quantification ne peut tre tire de ces expriences. La dtection des peptides phosphoryls dpend de nombreux paramtres comme la nature du peptide (composition en acides amins, nombre de rsidus) ainsi que dautres paramtres comme la matrice de lchantillon ou encore le mode dionisation (positif ou ngatif). Cette tude confirme quil est impossible davoir une quantification de peptide sans talon interne.

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Mode positif

Mode ngatif

Figure 1: analyse du peptide TSTEPQ(p)YQPGENL.

Calibration de la phosphorylation en MALDITOF du peptide en fonction du mode et de la matrice utilise (noir: CHCA, gris fonc: DHB, gris clair: THAP)

Prsomption de sulfatation artefactuelle Avant analyse en spectromtrie de masse les protines sont souvent soumis une sparation. Lors de la migration de protines sur gel de polyacrylamide, la coloration est une tape indispensable avant lanalyse en spectromtrie de masse. Le colorant utilis est souvent choisi en fonction de sa sensibilit. Cependant certaines de ces colorations peuvent induire des artfacts de PTM et induire une mauvaise indentification des peptides ou des PTM quils portent. La raction thiosulfate/argent est montre figure 1. Au bilan de la raction une prcipitation brune du nitrate dArgent et une sulfatation du peptide sont obtenues.
Figure 1: mcanisme propos pour la sulfatation des peptides par la coloration au nitrate dargent. Le thiosulfate de sodium rduit lion argent en un intermdiaire mtallique ractif qui va faire lobjet dune attaque nuclophile par une paire dlectrons isols dun rsidu hydrolyl; ici la srine. Lintermdiaire form par le thiosulfate peut rduire un second ion argent proche dun rsidu acide pour produire Ag2S ncessaire pour visualiser les protines spares par le gel et libre un peptide sulfat

Ainsi Gharib et al. comparent deux colorations, le nitrate dArgent et le bleu de Coomassie. Ils constatent que certains peptides contenant une sulfatation ne sont colors

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quau nitrate dArgent (mcanisme de la coloration figure 1). La sulfatation est une modification post traductionnelle trs peu retrouve et qui prsente de fortes similitudes avec la phosphorylation ; incrment de masse et ajout de charge identiques (fig. 2).

Figure 2 : Comparaison des caractristiques de la phosphorylation et la sulfatation.

Lutilisation dun systme de MS orbitrap, capable de diffrencier les masses 1/10000me, est un des seuls moyens pour diffrencier ces deux modifications. Les auteurs se sont demands si les sulfatations identifies ne seraient pas un artefact d la coloration au nitrate dargent. Pour vrifier cette hypothse ils ont tudi leffet du traitement de pr-coloration au thiosulfate de sodium, montrant quil induit une sulfatation artfactuelle des protines. Le pr-traitement au thiosulfate de sodium qui intervient initialement pour augmenter la sensibilit de dtection au nitrate dargent. Bien quil induise une coloration de certains peptides sans modification, les auteurs montrent quil peut galement induire des artfacts de sulfatation. Cependant cette tude soulve un problme dans lanalyse des modifications post traductionnelles. En effet dans de nombreuses publications portant sur lindentification de phosphorylation protique, les analyses nont pas fait intervenir un systme orbitrap. Aux vues des fortes similitudes entre la phosphorylation et la sulfatation, on peut se demander si toutes les phosphorylations identifies en sont rellement

Autres modifications
Gnralits En dehors des phosphorylations et de la glycosylation , il existe dautres modifications post- traductionnelles caractrises par lajout de petites molcules. Quelques exemples sont cits ci-dessous. Sulfatation de la tyrosine Nous avons vu que la sulfatation des tyrosines pouvait tre une modification posttraductionnelle importante pour la mdiation des interactions protine-protine dans lespace extracellulaire. Un groupement sulfuryl est transfr du PAPS (3-phosphoadenosine 5phosphosulfate) vers le groupement phnol de la tyrosine grce au TPSTs (tyrosylprotein sulfotransferases) ; ceci rsultant en un incrment de masse de 80 Da en SM (fig. 1).

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SO3-

SO3TPST1ou TPST2

PAPS
Figure 1 : Schma de la raction de sulfatation dun rsidu tyrosine. Les TPSTs (tyrosylprotein sulfotransferases) catalysent le transfert dun groupement sulfuryl partir du PAPS (3-phosphoadenosine 5phosphosulfate).

La sulfatation et la phosphorylation conduisent des ions isobares. Ainsi, Yu et al. ont appliqu une stratgie permettant de discriminer ces modifications. Les auteurs ont utilis la proprit de labilit des sulfotyrosines dans les conditions de MS/MS (temprature leve et pH faible). Tout dabord, les groupements hydroxyl des tyrosines libres sont acetyls par du S-NHSAc (sulfosuccinimidyl acetate) en prsence dimidazole pH 7 (fig. 2). Ensuite, lanalyse en MS permet la perte des groupements sulfuryl des rsidus de tyrosine O-sulfats. Enfin, les sites de sulfatation sont dduits partir des rsidus tyrosine libre aprs analyse MS/MS.

Figure 2 : Stratgie de dtermination de sites de sulfatation de tyrosine. Les rsidus tyrosine non sulfats sont actyls par une raction avec du S-NHSAc catalyse par de limidazole. Lanalyse par MS permet dliminer les groupements sulfuryl des tyrosines sulfates tandis que les tyrosines actyles restent stables. Les sites de sulfatation sont ensuite dduits aprs analyse MS/MS partir des tyrosines libres.

Les auteurs ont appliqu cette stratgie notamment sur un peptide modle, la cholecystokinine (Tyr-CCK-8 ; (DY(SO3H)MGWMDFY). Lanalyse MS a mis en vidence la prsence de deux sites dactylation (fig.3a et b). Yu et al. ont dduit le site de sulfatation sur le rsidu tyrosine 2 aprs analyse MS/MS partir de lion parent m/z 1311.5 (fig. 3c et d).
1302.28 Da

84=42*2 Da 1386.32 Da

1311.5-y8 = 157.1 = Asp (115)+42 y7-y8 = Tyr(163) 1311.5-b8 = 223.1= Tyr (163.17)+18+42

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Figure 3 : Dtermination des sites de sulfatation du peptide modle cholecystokinine (Tyr9-CCK-8 ; (DY(SO3H)MGWMDFY). a : spectre MS (mode ngatif) de la cholecystokinine. b : spectre MS (mode ngatif) de la cholecystokinine aprs traitement au S-NHSAc et limidazole. c : spectre MS/MS de la cholecystokinine aprs actylation et desulfatation. d : squence du peptide aprs traitement et MS/MS.

Actylation de la lysine Lactylation des protines histones est une modification post-traductionnelle importante car elle permet lactivation de la transcription. Celles-ci sont actyles sur les rsidus lysine en position N-terminale ou au sein de la chane polypeptidique. Catalyse par une actyltransfrase, lactylation correspond lajout dun groupe actyl partir de lactylCoA (fig. 4). Lincrment de masse observ sur les spectres MS est donc de 42 Da.

Figure 4 : Schma descriptif de lactylation dune lysine terminale ou dans la chane polypeptidique. Le groupe actyle a un poids molculaire de 42 Da.

La mthode basique pour la dtermination des sites dactylation dune protine consiste en une digestion enzymatique puis une analyse MS de certains peptides. Seuls les ions dintensits les plus fortes sur le spectre MS sont ensuite soumis une analyse MS/MS. Cette stratgie prsente cependant un inconvnient puisque certains peptides portant une actylation risquent de ne pas tre slectionns pour lanalyse MS/MS. Une des mthodes existant pour reprer des peptides actyls consiste utiliser de lactyl-CoA marque ([13CD3-13CO]-acetyl-CoA) qui apporte un incrment de masse de 5 Da au groupe actyl. (Wu et al). Les auteurs ont synthtis cette molcule et ralis des ractions dactylation de protines histones en prsence dactyltransfrase et dun mlange quimolaire dactyl-CoA marqu et non marqu. Ce marquage rsulte en un incrment de masse de 5 Da des peptides actyls observable aprs une digestion enzymatique et une HPLC en phase inverse couple une ESI-MS. Le logiciel DeltaFinder permet de reprer sur les spectres MS les doublets ayant des diffrences de masse spcifiques de 5n-Da (n correspondant au nombre dactylations). Ainsi, les peptides potentiellement actyls sont reprs et soumis lanalyse MS/MS pour localiser les sites dactylation.

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Les auteurs ont analys notamment le peptides histone H3 (acides amins 1 20) (fig. 5).
H3 natif: M= 2285,4 Da

m/z= 9,40
m 5 Da

m/z = 8,40
m = 42 Da H3 actyl*: M= 2332,4 Da

H3 actyl M= 2327,4 Da

Figure 5 : Spectre MS du peptide histone H3 (acides amins 1 20). Lincrment de masse entre le peptide H3 natif (M= 2285.4 Da) et le peptide actyl (M= 2327.4 Da) est de 42 Da. Lincrment de masse entre le peptide non marqu et le peptide marqu (M= 2332.4 Da) est de 5 Da.

Le spectre montre que le peptide histone H3 ne prsente quun site dactylation. Ce site est ensuite localis par analyse MS/MS partir de lion prcurseur m/z 466.48 du peptide H3 non marqu (fig. 6).

Figure 6 : Spectre MS/MS du peptide histone H3 (acides amins 1 20) partir de lion prcurseur m/z 466.48. Masse attendue : MacK = 170 Da b184+ M=1965.56 Da b153+ M= 1542.24 Da y4-NH32+ M= 526.22 Da y3-NH3+ M= 362.11 Da

Les auteurs ont localis lactylation sur le rsidu de lysine 18. Aprs vrification, seuls les intensits obtenues pour les ions b184+ et b153+ permettent de confirmer ce rsultat.

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Formation de dhydroalanine La dhydroalanine se forme partir dune cystine libre non implique dans un pont disulfure. Lquipe de Bar-Or et al. a essay didentifier la modification post-traductionnelle prsente sur la cystine libre (34me) de la HSA (human serum albumin). Ils ont pu caractriser trois formes par LC-MS : la forme libre (R-SH), la forme cystinyle (forme un pont disulfure avec une cystine exogne) et la forme dhydroalanine (R=CH2) (fig. 7).

Figure 7 : Spectre LC-MS de la protine HSA non trait. 3 formes : libre, dhydroalanine (DHA) et cystinyle. 34,5 = perte du SH DHA 118,5= Cys exogne Cystinyle

Afin didentifier la prsence dune dhydroalanine, les auteurs ont ralis un traitement au DTT pour rduire les ponts disulfures suivi dune carboxymthylation avec de lacide iodoactique afin dajouter un groupement actyle (58Da) sur le soufre des cystines libres. La protine a t par la suite digre la Trypsine. Enfin, un spectre MS/MS a t ralis sur le peptide contenant la 34me cystine (fig. 8). Deux formes ont t caractrise, la forme carboxymthyle et dhydroalanine. La forme carboxymthyle correspondant a une cystine libre drive par lacide iodoactique et la dhydroalanine provenant de la figure 7 montrent lidentification de ses deux acides amins (rsidu dha = 69 ; rsidu Cys carboxymthyl = 161) dans la squence peptidique (RPCFSALEVDETYVPK) considre. Les auteurs ont par la suite, interprt le spectre prsent dans la figure 8.

Figure 8 : Spectre MALDIMS/MS du peptide RPCFSALEVDETYVPK de la HSA. A : forme dhydroalanine (dha). B : forme carboxymthyle (cm) cys libre.

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QUANTIFICATION EN SPECTROMETRIE DE MASSE DES PROTEINES

Techniques de quantification protique en MS
Quantification absolue : AQUA Rcemment des techniques impliquant la spectromtrie de masse ont t dveloppes afin de permettre la quantification absolue de protines. La mthode AQUA est une stratgie de quantification absolue de protines. Elle utilise des peptides synthtiques marqus avec des isotopes lourds (13C, 15N), qui miment les peptides natifs forms lors de la protolyse de la protine, comme des standards internes. Ces standards internes AQUA permettent la quantification dune protine donne aprs protolyse par la technique de SRM (Selected Reaction Monitoring) en MS/MS. Li et al. ont mis au point une mthode qui permet la quantification dune protine membranaire MRP2 (Multidrug Resistance Protein), retrouve la membrane caniculaire, qui est suppose tre responsable de grandes variations interespces observes au niveau pharmacocintique. La mthode dveloppe pour sa quantification utilise la LC-MS/MS afin de retrouver un peptide prototypique partir dun chantillon de MRP2 enrichie par immunoprcipitation et digr la trypsine (fig. 1). Un peptide prototypique est un peptide gnr par la digestion enzymatique (trypsine), dune protine donne de faon reproductible et spcifique vis vis de la protine et qui est intense dans un spectre MS. Le peptide prototypique identifi pour la MRP2 est LTIIPQDPILFSGSLR-.

Figure 1. Mthodologie employe par Na Li et al, dans le dveloppement de la stratgie de quantification de la protine membranaire MRP2. La protine MRP2 humaine est surexprime dans des cellules canines MDCK. Lchantillon est enrichie en MRP2 par immunoprcipitation et digr la trypsine. Un peptide prototypique a t dtermin par LC-QTOF-MS. Un standard interne et externe, qui miment le peptide prototypique ont t synthtis et ont servi dans le dveloppement de la mthode de quantification de MRP2 par LC-MS/MS en mode SRM (Selected Reaction Monitoring).

Un standard interne marqu avec des isotopes lourds (SIL) et un standard externe non marqu, de mme squence que le peptide prototypique, ont t synthtiss. Leur diffrence de masse est de 7 Da. Aprs une tude des spectres MS/MS des deux peptides synthtiques, les transitions a suivre lors de la SRM ont t dtermine (m/z 885,9>m/z1331,8 et m/z889,5>m/z1338,8). Il a t choisi de mesurer lintensit du pic de m/z 1331,8 pour le peptide synthtique et de m/z 1338,9 pour le SIL.

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A
7Da [
13

B
C6
15

N1]

Figure 2. A. Squence du peptide prototypique. Lors de la synthse du peptide SIL une leucine marque radioactivement a t icorpore et est responsable de la diffrence de 7Da entre le peptide SIL et le standard externe. B. Massif isotopique du peptide prototypique C. Spectre de fragmentation du peptide synthtique non marqu (standard externe) D. Spectre de fragmentation du peptide synthtique marqu SIL (standard interne).

La sensibilit de la mthode a t estime par la LOQ 31,25 pM. Cette mthode a t utilise pour mesurer la quantit de MRP2 humain surexprime dans des cellules MDCK canines (1ng MRP2 pour 1 g de protines totales). Marquage isotopique in vivo pour quantification relative: ISIS (Isobaric SILAC with Immonium Ion Splitting) Cette technique est base sur la mthode SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture). Cest une mthode de marquage mtabolique qui utilise des paires dacides amins marqus ou non avec des isotopes lourds afin dintroduire des diffrences de masse prdites dans les chantillons protiques comparer. Dans la mthode ISIS, les peptides des 2 chantillons ont la mme masse nominale et le mme spectre MS. Il y a donc co-fragmentation des prcurseurs mais cest lors de la gnration dions immonium issus de cette fragmentation que lon va observer une diffrence de masse et faire une quantification relative des protines parentes. Les cellules sont mises en culture en prsence des acides amins Valine, Leucine et Isoleucine marqus soit par un 13C sur le carbone de lacide carboxylique (culture A) soit par un 15N sur lamine N-terminal (culture B, fig. 3A). Ces acides amins ont t choisis pour leur grande abondance dans les protines. Les cellules vont subir environ 6 divisions ce qui va permettre le marquage denviron 98% des protines totales. Les lysats cellulaires issus des 2 conditions testes sont ensuite mlangs et soumis une digestion trypsique.

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Sans incrment de masse

Avec incrment de masse

Figure 3 : Schma gnral de la mthode ISIS (A) 2 conditions sont testes : les cellules sont cultives en prsence de Leucine, Valine et Isoleucine marqus soit par un C13 soit par un 15N. (B) La formation dions immonium va conduire la dtermination de ratio relis la quantit de protine dans les conditions testes

Les ions immonium sont spcifiques des rsidus du peptide parent. Dans ce cas, on observe une diffrence de masse atomique de 1 unit entre deux ions issus de la mme protine mais des deux conditions diffrentes. Le mme peptide dans les 2 conditions va avoir le mme incrment de masse, soit du au carbone soit lazote (masses isobares), mais les ions immonium issus des Val, Leu et Ile auront des masses diffrentes (fig. 3B). Cette mthode a t utilise par Colzani et al., afin de mesurer la diffrence dexpression protique entre deux types de mlanomes des stades diffrents. Le peptide contrle charg 3+ contient une valine et une isoleucine. Ce peptide marqu au 13C subit une modification de masse conduisant un dcalage des pics de 0,33m/z vers la droite. Ce mme phnomne est observ lors du marquage 15N avec une plus grande abondance des peptides lourds du lincorporation de lazote lourd dans les autres acides amins (A). On peut observer la dtection des ions immonium lgers sur des protines non marques avec une intensit fiable par rapport la richesse isotopique naturelle (B). Lors de culture en 13C, il ny a pas de modification du spectre MS/MS car pas de modification de masse des ions immonium. Au contraire en (B) H (marquage 15N), on a une modification de masse des ions immonium conduisant une inversion du spectre. Les auteurs arrivent ainsi identifier 26 protines dont lexpression est modifie entre ces deux types cellulaires et donc potentiellement responsables du passage ltat mtastatique. A noter que chaque protine est reprsente par 2 peptides spcifiques identifis via Mascot.

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Figure 4 : Spectres et systme reporteur (A) spectre MS dun peptide contrle, (B) spectre MS/MS de ce mme peptide non-marqu (UN), marqu 13C (L pour light) ou marqu 15N (H pour heavy).

Amlioration de la technique iTRAQ par fractionnement OFFGEL Le marquage iTRAQ (Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification) permet lidentification et la quantification de protines in vitro dans 8 chantillons par MS/MS. Les chantillons protiques subissent au pralable une tape de rduction et alkylation suivie dune digestion trypsique. Les peptides ensuite sont marqus via le tag iTRAQ puis mlangs et subissent une tape de sparation avant dtre analyss en MS/MS (fig. 6).

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(a

(b)

Carbonyl

Peptide Reactive Groupe

Groupement Reporter Figure 5 : Marquage iTRAQ (a) Tag iTRAQ. Il possde une masse constante de 145 u. Le groupement Reporter diffre entre les diffrentes formes du ractif utilis (masse de 114 117) grce un marquage isotopique. La Balance a pour rle de compenser la diffrence de masse du Reporter. Sa masse varie de 28 31 u selon le Reporter qui lui est associ. Le Peptide Reactive Group (PRG) marque les peptides. (b) Structure du tag. Le groupement Reporter est form par un groupe N-methylpiperazine. Il possde 2 amines tertiaires qui sont facilement ionisable par MALDI. La balance est compose dun groupement carbonyle. Le PRG est form par un groupe NHS-ester (N-Hydroxysuccinimide ester) et ragit avec les amines primaires des peptides (amines Nterm et des chanes latrales des lysines). Lors de la liaison, on a perte du cycle NHS et formation dune liaison amide.

En MS, les ions prcurseurs dintrts seront isols, quelque soit la condition/marquage, puis co-fractionns car ils possdent la mme masse. On compare ensuite les intensits des Reporters retrouvs sur le spectre MS/MS (fig. 6) dont le rapport conduira la quantification des protines parentes.

Figure 6 : Illustration de la quantification du peptide ANIAILGFIK par iTRAQ Aprs isolation du prcurseur 1347,8473 m/z par MS qui correspond au peptide dinteret, on procde la MS/MS. On retrouve gauche les groupes Reporter 117 et 114 qui vont servir la quantification. Source ?

Les chantillons protiques sont relativement complexes, ajouter cela la digestion trypsique, il est ncessaire de procder une tape de fractionnement efficace avant le traitement en MS/MS. Ernoult et al. proposent une amlioration de la quantification par la mthode iTRAQ grce un fractionnement OFFGEL-IEF-IPG. Cette mthode consiste en une focalisation isolectrique (IEF) via une lectrophorse en gradient de pH, ceci est fait partir dun gel de gradient de pH immobilis (IPG) en OFFGEL.

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Figure 7: Principe de la focalisation OFFGEL On applique un courant lectrique sur un gel IPG crant ainsi un gradient de pH. Lchantillon protique est mlang un tampon de focalisation contenant des espces ampholytes puis dpos dans les micro-puits audessus du gel. Les protines ou peptides vont se stabiliser dans la zone de pH correspondant leur pI. Pour cela ils vont diffuser entre les micro-puits travers le gel pousss par les ampholytes. A lquilibre, le contenu des micropuits est transfr en micro-tube puis concentr par speed-vac.

Grce cette mthode de focalisation isolectrique hors gel, les auteurs parviennent identifier une grande proportion de protines contenues dans un extrait protique complexe issu dune ligne de neuroblastome. En combinant marquage iTRAQ et fractionnement OFFGEL, la proportion de protines identifies de faon significative est multiplie par 5 par rapport une mthode classique sans marquage et en fractionnement par SCX (Strong Cation eXchange). Ils identifient les protines par au moins 2 peptides (recherche de squence dans des bases de donnes) quils recoupent avec les donnes de pI fournies par lexprience. Enfin ils observent que le marquage iTRAQ amliore lionisation en MALDI, que la combinaison avec le fractionnement OFFGEL permet de diminuer le bruit de 6 fois environ, tout en diminuant la quantit de matriel soumis lanalyse par 2.

Applications lenvironnement mdical.

Gnralits Un des grands enjeux de la spectromtrie de masse est son potentiel dapplication clinique, du point de vue du dpistage et/ou du diagnostique, du sa sensibilit, sa spcificit et sa rapidit de mise en oeuvre dans la dtection et le dosage de protines biomarqueurs de pathologies. Elle est gnralement fonde sur la sparation des protines contenues dans un mlange complexes dun fluide corporel, par chromatographie liquide haute performance (HPLC), couple lanalyse par MS en tandem. La possibilit de synthtiser des protines par gnie gntique ainsi que la synthse de peptides marqus, et lincorporation disotopes lourds (15N, 13C, 2D), ont permis le dosage de tels marqueurs. Bondar et al. ont par exemple pu mettre au point un systme de dtection et de quantification dune glycoprotine, la Zinc-alpha 2 (Zn-2) ou peptide ZAG, biomarqueur du

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cancer de la prostate. Pour cel, ils ont tout dabord produit et purifi cette protine de manire recombinante dans les cellules CHO (Chinese Hamster Ovaries). La protine a ensuite t rduite, alkyle et digre par la trypsine, les peptides spars par HPLC et le processus de fragmentation tudi par MS/MS. Les ions prcurseurs et fragments caractristiques ainsi produits ont t slectionns, et lion fragment donnant la rponse la plus fiable suivi par SRM (Single Reaction Monitoring). Cette mthode, couple la synthse dun peptide utilis comme talon interne et correspondant lion fragment slectionn mais marqus par les isotopes 13C et 15N lui donnant un incrment de masse, a permis lindividualisation des pics correspondant aux deux peptides et la quantification du biomarqueur. La quantification a pu tre ralise directement sur les sra de patients et dtermine par une courbe de dose-rponse du ratio correspondant labondance relative du peptide ZAG srique et celle de ltalon interne. Cette tude, selon les auteurs, a permis de baisser le seuil de dtection obtenu en ELISA jusqualors, en obtenant une LOD (Limit Of Detection) denviron 30% infrieure. Dune faon analogue, Singh et al. , ont pu quantifier lalbumine urinaire dans le cadre de la dtection de la microalbuminurie. La levure Pichia pastoris a t utilise pour synthtiser une HSA (Human Serum Albumin) marque compltement lazote 15 (15N). Les fragmentations de la HSA marque et non marque ont t tudies et caractrises par QTOF, et les ions donnant les meilleures intensits ont t slectionns. Cependant comme la Q-TOF nest pas adapte pour lanalyse clinique, la MS (triple quadrupole) a t choisie pour lanalyse en routine. Les ions non marqus b244+ (m/z = 685.1) et b243+(m/z = 693.6) correspondant au fragment N-terminal ont t slectionns pour la quantification de la HSA en utilisant les ions 15N35-b244+(m/z = 913.2) et 15N35-b243+ (m/z = 924.1) de la 15N-HSA comme talon interne. Les LOD et LOQ (Limit Of Quantification) obtenues par les auteurs sont plus basses (de lordre de 20%) que celles des mthodes immunochimiques et chromatographiques utilises pour ce marqueur. Cependant les mesures de rptabilit (CV intra-day ; n = 20, 12.6% (17 mg/L), 10.1% (70 mg/L), et 4.0% (210 mg/L)) et de reproductibilit (CV inter-day ; n = 10, 12.2% (19 mg/L), 11.0% (80 mg/L), et 7.1% (230 mg/L)) limitent la prcision de la mthode. Deux tudes ont t slectionnes pour illustrer de faon plus dtaille les potentialits quoffre la spectromtrie de masse dans le domaine du dpistage clinique. Dtection et quantification du facteur ltal de lanthrax dans le srum par spectromtrie de masse La bactrie Bacillus Antracis constitue une arme biologique lorsquelle est inhale sous sa forme sporulante. Linfection doit tre dtecte de faon prcoce mais les techniques de diagnostic existantes, bien que sensibles, sont longues (plus de 8 jours). Le lthal-factor (LF) est une protine enzymatique entranant lapoptose des cellules en ciblant les MAP kinases. Boyer et al. ont quantifi le LF plasmatique en observant son activit sur un substrat peptidique synthtique. Dans un premier temps lenzyme a t purifie par capture laide dun anticorps monoclonal anti-LF. Puis diffrents substrats peptidiques (fig. 8) pour LF ont t synthtiss par alignement de ses substrats naturels (MAPK) et le meilleur substrat a t slectionn (meilleur m/z des fragments clivs produits, rapidit de la raction, etc), savoir le LF4 (fig. 9).

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Figure 8 : Squences des peptides synthtiss. LF clive les peptides synthtiques en 2 parties N-term et Cterm.

Figure 9 : Spectre de masse du peptide LF-4 en prsence de LF. On observe une diminution de la quantit LF-4 et une augmentation de la quantit des fragments peptidiques C-term et N-term produits.

Aprs avoir dtermin le meilleur substrat et montr que lactivit enzymatique du facteur ltal tait constante en fonction du temps, la quantification du facteur a t ralise laide dun standard interne marqu chimiquement. Ici lisotope utilis est la partie Nterminale du peptide LF-4 comprenant trois 13C, trois 2D et un 15N donnant un incrment de masse de 7 Da (fig. 10).

Figure 10 : Spectre de masse du fragment N-terminal de LF-4 et de son homologue peptidique marqu.

Ainsi, ce test apporte une triple spcificit, savoir la reconnaissance et la purification du factor ltal par un anticorps, le dosage par lactivit de clivage de lenzyme, et la spcificit de lanalyse MALDI-TOF. Il permet de dtecter le LF en 4h, avec un seuil de dtection de 0,05 ng/ml, soit 400 fois moins quen ELISA (20 ng/mL).

Mise au point dun test de dpistage de la maladie de Wilson par LC-MS/MS. La maladie de wilson est une maladie rare et est provoque par une mutation dans le gne ATP7B qui code un transporteur ATPase du Cu2+ localis dans le rticulum endoplasmique. Cette protine permet au cuivre de se complexer lApocruloplasmine pour former la Cruloplasmine, qui est scrte. La mutation entrane une perte de fonctionnalit de la cruloplasmine qui transporte et rgule 90% du Cu2+ srique, ce qui provoque une accumulation de ce dernier entrainant un tableau clinique chez le patient pouvant conduire la mort. Comme toutes les maladies rares, un dpistage systmatique nest pas recherch, et 27

cest dans le but de palier ce problme que deWilde et al. se sont intresss une technique permettant un dpistage prcoce, simple et fiable chez le nouveau-n. La mthode utilise pour le dpistage est base sur la quantification par UPLCMS/MS du biomarqueur srique de la maladie de Wilson, la Cruloplasmine (132kDa), partir dune goutte de sang sche (DBS, Dried Blood Spot). Dans un premier temps les ions utiliss pour la quantification ont t slectionns par une analyse Q-TOF et trappe ions dun digestat trypsique de la Cruloplasmine, spar par chromatographie liquide ultra-haute performance. Les ions prcurseurs et les ions fils produits ont t slectionns sur lintensit des pics obtenus, sur labsence de rsidu Cystine (formation de ponts disulfures pouvant masquer certains sites de clivage la trypsine et entrainant une digestion incomplte), sur leur ion score , ainsi que sur la base du rapport m/z. A partir de ces rsultats, trois peptides ont t synthtiss chimiquement, dont deux ont t choisis comme talons internes pour la quantification. Ce sont des peptides marqus de P1 et P-2 (respectivement P-1-IS et P-2-IS, tableau 1) confrant un incrment de masse de +8 Da pour P-1-IS et +10 Da pour P-2-IS qui ont t utiliss pour la quantification par LC/MSMS.

Tableau 1 : Squences des peptides P-1, P-2, P-1-IS et P-2-IS. La masse molculaire de chaque peptide, le m/z de leurs ions prcurseurs et des 4 ions utiliss pour la MRM sont indiqus.

De plus, ltape de digestion trypsique a t optimise, de sorte ce la Cruloplasmine soit totalement digre pour ne pas sous-estimer sa quantit. Pour se faire, il y a eu ncessit de dissocier les complexes ventuels, de solubiliser la protine (surtout si elle est hydrophobe) et de la dnaturer. Lutilisation de PPS comme dtergent compaptible avec la MS-MS, et lactonitrile comme solvant solubilisant permis la ralisation de ses tapes Ltape de sparation des peptides issus de la digestion trypsique a galement t optimise en diminuant les temps de rtention de ces peptides en chromatographie liquide ultra-haute-performance (fig. 11). Cette optimisation sest accompagne dune perte de signal du peptide P-2, rsultant dune mauvaise rtention par la phase stationnaire et donc dune lution prmature.

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Figure 11 : La sparation est effectue par UPLC sur une colonne C-18 dans un gradient linaire dACN de 0
25% .Les 3 chromatogrammes prsents correspondent des temps de sparation diffrents : 50 min, 10 min, 7min.

Ainsi la quantification des peptides trypsiques de la cruloplasmines a seulement t effectue avec P-1-IS (fig. 12). La dtermination de la quantit effective de Cruloplasmime dans les extraits de sang denfants malade et sains a t permise par ltablissement dune courbe de calibration des peptides P-1 dune Cruloplasmine produite par gnie gntique.

Figure 12 : Spectre de masse de P-1-IS avec son ion prcurseur m/z=600.7 sur le premier spectre et ces 4 ions fils analyss en MRM sur le second. Les rsultats obtenus, selon les auteurs, pemettent partir dune faible quantit de matriel de dpart (3,2 L de sang sch) de quantifier la Cruloplasmine plasmatique partir de 7 ng/L en un minimum de temps (7 min). Ces donnes laissent entrevoir une utilisation plus grande chelle sur dautres biomarqueurs dans le dpistage de maladies chez les nouveaux-ns.

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APPLICATIONS
Applications mdicales
Modifications post-traductionnelles. Analyse des modifications post-traductionnelles par ECD : La dissociation par capture dlectron est une nouvelle technique de fragmentation utilise dans la spectromtrie de masse FT-ICR. L'un des grands attraits de l'ECD repose sur sa capacit rompre des liaisons amides dans des peptides tout en laissant gnralement intactes des liaisons plus "faibles", que ce soient celles de glycosylations, phosphorylations et mme certaines liaisons hydrogne intra et intermolculaires. Les polypeptides doivent tre initialement au moins doublement chargs positivement pour pouvoir tre dtects en spectromtrie de masse. En effet, la capture lectronique provoque la perte dune charge positive et lobtention dun ion radicalaire. Ces polypeptides capturent un lectron ce qui est suivi dune neutralisation de charge provocant un clivage rapide des radicaux. Cette fragmentation va se faire sur la liaison NC, donnant prfrentiellement des fragments c en N-terminal (le simbole indique le transfert de H avant la fragmentation) et des fragments z en C-terminal (Fig. 1). Dans tous les cas, les fragments obtenus par ECD semblent retenir plus de groupes labiles (modifications posttraductionnelles) que la CID MS/MS.

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Figure 1: Formation des fragments cet z par le mcanisme ECD. La capture de llectron se fait par un site charg, donc normalement les rsidus His, Arg, Lys, ou groupes N-term. Llectron clibataire va rapidement cliver la liaison N-H ce qui va crer un atome dhydrogne de haute nergie. Le groupe carbonyl amide va tre le site prferentiel pour la capture de latome dhydrogne, et cela va provoquer la formation dun radical de haute nergie qui va alors provoquer un clivage de la liaison N-C. Le peptide N-term fragment va reprsenter les ions de type c, et le C-term les ions de type z.

Un exemple de dtection de modification sur une protine avec ECD est prsent pour loxydation de lenzyme hBAT par le lipide lectrophile 4HNE (lipide prsent en grandes quantits dans les tissus animaux pendant le stress oxydatif) (Barnes et al.). La modification sur la protine apporte la formation dune addition de Michael (+m/z = 156,1105).

Figure 2: tude ECD LTQ-FT-MS/MS du peptide hBAT A335H*AEQAIGQLKR346 ; Produit lors dune addition de Michael sur une Lysine. Observation de la modification de lHistidine 336 par addition de Michael. Lion c2 correspond RA-H +18 = 226.130 + 138,104 (ce qui correspond une addition de Michael deshydrate : 156,1105 H20 = 138,104). Les fragments z correspondent la R + 2 + 1 (z + H = ion z + 1).

Recherche de biomarqueurs Lapport de la spectromtrie de masse pour ltude des biomarqueurs devient de plus en plus important. En effet, la dtection de profils protiques dutilit pronostique et diagnostique dans les srums et les tumeurs de patients suscite depuis peu un intrt considrable et devrait permettre terme une amlioration de la prise en charge du malade. Les analyses protomiques reposent principalement sur des mthodes de comparaison de profils protiques dchantillons sains et malades en vue de dtecter des diffrences de prcense de certaines protines provoques par la pathologie. Lavantage de ces tudes protomiques et quil ny a besoin que du srum et ce nest donc pas une mthode invasive. Un exemple est la recherche de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer de pancreas (Kojima et al.). Pour ces tudes, des chantillons de srum sont utiliss. Le problme qui se pose est quils contiennent certaines protines srologiques qui sont trs abondantes. Pour liminer les protines les plus abondantes et permettre une analyse plus prcise, une colonne dimmunoaffinit se ralise avec IgY12. Lchantillon obtenu est alors dsal et concentr avec C18 Macrotrap et ensuite fractionns avec une colonne HPLC C4. Les fractions sont alors analyses par MALDI-TOF. Dans cette tude, les profils de MALDI-TOF obtenus pour des patients atteints de cancer, de pancreatites et sains, sont compars. Un des pics qui 31

prsente des intensits diffrentes pour chacun des trois cas (m/z = 9713), est rcupr sur gel et trypsinis pour une tude MALDI-MS/MS (fig. 3).

Figure 3: MALDI-MS de la protine dintrt. Les pics obtenus correspondent des fragments c. Lanalyse du spectre montre une squence avec une modification sur la thronine 74 (GalGalNAC-Sia-Sia). La comparaison avec base de donnes montre que les rsultats correspondent au profil de lapolipoprotine CIII2.

Donc Apo CIII2 pourrait constituer un biomarqueur pour distinguer entre la pancreatite et le cancer de pancras. Par contre il serait ncessaire de confirmer cette tude avec un plus grand nombre dchantillons (seulement 24 patients atteints de cancer sont analyss). De plus on trouve dans la littrature beaucoup dtudes qui se basent dans la comparaison de profils MS, comme celui-ci. Ceci est bien une erreur, puisque ces profils ne peuvent pas tre compars sans standard interne, sachant quil y a toujours de variations entre les expriences (exprimentateur et machine). Une nouvelle mthode utilise dans le but de pouvoir faire des tudes comparatives entre diffrents profils protiques et peptidiques de cas cliniques, est le SELDI-TOF (SurfaceEnhanced Laser Desorption Ionisation). Il sagit dune approche adapte aux stratgies de profiling protique. Cette technique consiste fixer les protines de manire slective sur de petites surfaces chromatographiques (changeuses danions dans le cas prsent), les protines retenues sont ensuite analyses en MALDI-TOF. Il a t utilis pour identifier des biomarqueurs caractristiques de patients schizophrnes afin daider la comprhension des mcanismes pathologiques de cette maladie. (Jeffrey et al.). Pour cela les auteurs ont rcupr des chantillons de liquide cphalo-rachidien de 50 patients sains et 51 patients schizophrnes.

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Figure 4: Comparaison des spectres SELDI-MS de protines/peptides du liquide cphalo-rachidien des patients malades et sains. Les auteurs sintressent au pic correspondant m/z= 3958,90, puisquil prsente une diffrence dintensit pour les deux cas compars.

Ensuite les protines des mmes chantillons sont slectionnes nouveau sur les barrettes de SELDI et analyses par nanoLC-ESI-MS/MS (Q-TOF) en slectionnant le pic correspondant m/z= 3958,90 (fig. 5).

Figure 5 : Spectre partiel en nanoLC-ESI-MS/MS (Q-TOF) du peptide 3959,90 Da. Observation de fragments y et b, mais aussi de fragmentations internes notes biyj. Par exemple b24y30 correspond : PPLSSEHKEPVAGD R + 1 (1 qui provient du proton ajout dans la partie N-term du fragment interne obtenu)= 1444,64.

En SELDI, les chantillons sont traits en mme temps et de la mme faon permettant, selon les utilisateurs des comparatifs. Mais le problme est la reproductibilit relle des donnes gnres. En effet, si la variabilit intra-essai de cette mthode reste moyennement acceptable, la variabilit inter-essai dans le temps semble plus problmatique.

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Applications en protomique vgtale

Gnralits Lextrme dilution des ressources nutritives dans lenvironnement (CO2, ions minraux, et souvent eau) fait que la plupart des cellules dune plante sont directement confrontes aux conditions environnementales, contrairement leurs homologues du monde animal, protges par lhomostasie du milieu intrieur. Les cellules des plantes supportent les conditions agressives dun milieu extrieur continuellement fluctuant, grce des adaptations aux stress environnementaux varis et frquents (carences en nutriments, stress hydrique, excs ou dfaut de lumire, fluctuations brutales de la temprature, agressions par une grande diversit dagents pathognes, etc.). Ces adaptations sont une marque distinctive du mtabolisme vgtal. Dans toutes ces conditions, lexpression du gnome varie considrablement, conduisant une grande diversit des protomes cellulaires et subcellulaires en rponse ces modifications de lenvironnement. Lanalyse protomique est un outil puissant qui peut tre utilis dans de trs nombreux domaines, tant au niveau dtudes fondamentales quau niveau dtudes appliques en particulier en biologie vgtale et pour lagriculture. Le but dune approche protomique consiste avoir une vision plus globale et donc plus juste du fonctionnement de la cellule mais aussi de caractriser les protines dun compartiment subcellulaire ou didentifier de nouvelles protines et donc de nouveaux gnes, en particulier pour les organismes dont le gnome na pas t squenc. Enfin, il faut prciser que si lintrt manifest actuellement pour la protomique nest pas propre aux modles vgtaux, de nombreuses quipes de cette discipline ont contribu de manire significative son dveloppement rsultant en des applications classiques de MS. Identification des changements du protome dans des feuilles de bl, en rponse un stress salin par tablissement de cartes peptidiques massiques. Lexcs de sel dans les sols est un des principaux stress abiotiques pour lagriculture. Partout dans le monde, respectivement 20 et 50 % des zones cultives et irrigues sont concernes par ce problme, qui, en affectant la croissance et le dveloppement des plantes, reprsente une vritable limite une productivit agricole optimale. Dans ce cas, le but de lanalyse protomique compare, entre une culture tmoin et une culture test, va tre didentifier les protines impliques dans la tolrance au stress, avec, comme enjeux, la caractrisation des varits de bl les plus rsistantes et ainsi lamlioration des rendements de production. Cette tude a t ralise par Giuseppe Caruso et al., De faon classique, la protine est digre par une protase spcifique (la trypsine), les masses des peptides obtenus sont mesures avec une grande prcision par spectromtrie de masse MALDI-TOF, lensemble de ces masses constituant sa carte peptidique massique et qui savre tre une vritable empreinte digitale de la protine (fig.6). Cette protine peut ensuite tre identifies en comparant la carte peptidique obtenue exprimentalement aux cartes thoriques prsentes dans les banques de donnes.

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Figure 6 : MALDI-TOF M/S : Cartographie peptidique massique dune des 38 protines dont lexpression est modifie suite lexposition un stress salin. Corrle au pI et la masse molculaire dtermins exprimentalement, cette carte permet, via linterrogation des banques de donnes (MSDB et NCBInr), lidentification de la protine RuBisCo subunit binding protein bta subunit .

Identification des protines des feuilles de riz dont lexpression est induite en rponse au froid par squenage peptidique par spectromtrie de masse en mode tandem. Une basse temprature est un autre des principaux facteurs environnementaux limitants pour les plantes, qui gnrent dans ce cas des ROS (anion superoxyde, peroxyde dhydrogne, oxygne singulet) entranant la dgradation des composants de la cellule, dou des diminutions significatives de croissance et donc de rendements des cultures agricoles. Lenjeu de Dong-Gi Lee est donc de pouvoir gnrer des plantes transgniques plus rsistantes au froid, par la dcouverte de nouvelles protines impliques dans cette rsistance. Dans le cas de protines inconnues, cest dire non rpertories dans les banques de donnes, lidentification par carte peptidique est inoprante. On utilise la MS/MS permettant de slectionner un un les peptides provenant de la digestion trypsique de la proteine tudie. Chaque peptide est alors fragment et lanalyse de ces fragments permet de dterminer des lments de la squence en acides amins du peptide, squence qui sera utilise pour chercher identifier la protine dans les banques de donnes. Ici, la recherche dune petite partie (PEGLAEW) de la squence totale dun peptide (m/z = 859.57) dune des 14 protines sur-exprimes lors dune exposition au froid, a ainsi permis lidentification de la NDPK1 (Nucloside Di-phosphate Kinase1). La spectromtrie de masse est trs utilise pour ltude des modifications posttraductionnelles chez les plantes. En effet, ces modifications sont trs nombreuses dans le domaine vgtal. Diverses tudes ont t publies dont le but est de lister les protines retrouves dans les plantes et les modifications qui leur sont associes. Nous allons ici vous dvelopper deux exemples. Etudes des modifications post-traductionnelles des histones par mthode classique. Parmi les protines porteuses de modifications, on peut distinguer les histones. Les variations apportes ces molcules conditionnent ltat dexpression de lADN. Aussi, limportance de caractriser les diffrentes modifications est capitale pour bien comprendre quelles sont les rgions les plus transcrites. Ainsi, une tude mene par K.Zhang et al, sest elle propose didentifier les diffrentes modifications observes sur les histones de la chromatine des plantes. Le modle choisi est Arabidopsis thaliana et la mthode slectionne est la LC-MS/MS. Dans un premiers temps une chromatographie liquide est faite pour sparer les diffrentes protines histones entre eux. Puis chaque histone est indpendamment tudie par spectromtrie de masse.

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Ils ont ainsi mis en vidence, des actylations (m=42) et mthylations (m=14) sur des lysines, des phosphorylations (m=80) sur les srines. Ils ont galement not que la majorit des modifications sont situes sur la rgion N-terminale. Identifications des protines chloroplastiques et de leurs modifications. Ltude mene par B.Zybailov et al, concernant les protines chloroplastiques utilise une technique rcente de spectromtrie de masse qui permet une caractrisation fine et trs rsolutive, la LTQ-Orbitrap. Cette mthode utilise un dispositif complexe mlangeant la technique de la trappe ion et celle du quadrupole. Par cette technique, il est galement possible de concentrer les ions avant la fragmentation ce qui permet ltude dion de faible taille. Les avantages de lorbitrap sont multiples mais les principales qualits sont laugmentation de la rsolution engendre par le faible parcours des ions aprs la spectromtrie et la forte prcision de la masse mme pour de faible diffrence entre les ions obtenus.

Figure 2 : (a) spectre MS/MS du peptide AVSIKPEAGVEGLNIADNAAQLIGK on note un incrment de masse de 42Da soit un ajout une diffrence de masse correspondante une actylation, celle-ci est localise sur

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lalanine N-terminal. (b) ) spectre MS/MS du peptide VSIKPEAGVEGLNIADNAAQLIGK on remarque alors la disparition de la variations de la masse ce qui confirme lactylation de lalanine.

Les auteurs ont ainsi pu caractriser 1 258 protines de faon formelle et 22 groupes de protines homologues. Ils ont galement coupls leurs rsultats ceux quils obtiennent avec dautres techniques de spectromtrie de masse et ont ainsi identifi par alignement de squences plusieurs squences consensus pour les signaux de translocation vers le chloroplaste. De mme, par comparaison contre les banques de donnes, plusieurs modifications post-traductionnelles ont t mises en vidences dont des actylations sur des alanines sur les rgions N-terminales.

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CONCLUSION
Malgr les perspectives trs intressantes de la spectromtrie de masse, il est noter que certaines limites existent. En effet la prparation des chantillons reste une tape critique, il faut obtenir une protine la plus pure possible dans le solvant adquat. Cest pourquoi actuellement de nombreuses publications sont axes sur les techniques de sparation des chantillons en amont. Elle sera choisie en fonction du type dappareil utilis et des protines tudies. Le solvant doit lui aussi tre slectionn avec soin afin de ne pas interfrer avec les peptides prsents en solution. Une fois ces conditions fixes, il faut chercher obtenir la meilleure sensibilit. Celleci peut passer par lutilisation dappareil haute sensibilit comme le LTQ ORBITRAP capable de diffrencier les masses au 1/10000me. Ceci nous permet davoir des informations extrmement prcises pour les analyses en protomique. La spectromtrie de masse nest pas utilise en premire ligne pour la quantification. En effet le besoin dtalon interne peut prsenter quelques inconvnients lors des analyses. Cependant elle reste une technique de choix en protomique.

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