Coproculture

Gnralits
Indications: diarrhe aigu Selon loms: diarrhe aigu = mission dau moins 3 selles liquides et/ou molles par jour depuis moins de 14 jours Si volution > 2 semaines: diarrhe persistante

Si volution > 4 semaines: diarrhe chronique

Gnralits
Toutes les diarrhes aigus ne sont pas infectieuses Les diarrhes infectieuses ne sont pas toutes bactriennes Au final Interrogatoire minutieux

Aspect selles
Symptmes associs Terrain

Gravit
volution clinique

Gnralits
Flore commensale du tube digestif: Bactries anarobies (99%) Bactries arobies: entrobactries+++

Jeunes enfants nourris au lait maternel: Bactries acidophiles (Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus) qui s'opposent l'implantation des entrobactries par la cration d'un ph acide

Rappels sur la flore commensale intestinale

Gnralits
Cette flore va progressivement se modifier en fonction des habitudes alimentaires Rle de l'environnement: hospitalisation: bactries typiquement d'origine hospitalire (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) dans la flore intestinale

Gnralits
Les mcanismes physiopathologiques varient selon les bactries impliques -Les bactries entro-invasives -Les bactries entrotoxinognes

Celles qui scrtent sur place les toxines au niveau de l'intestin grle
Celles qui scrtent leurs toxines dans laliment ingre: TIAC

Germes pathognes invasifs

Germes pathognes invasifs

Shigella
Pntration dans la muqueuse colique
Multiplication - ulcrations Clinique: douleurs abdominales et coliques Tnesme, fivre Diarrhe sanglante, glaireuse Bactrie strictement humaine Pas de portage

Germes pathognes invasifs

Salmonella
Salmonella responsable de la fivre typhode:
- Multiplication dans les ganglions lymphatiques septicmie - localisations secondaires

- le seul rservoir est lhomme

- les hmocultures sont souvent positives - la diarrhe est caractristique du second septnaire

Germes pathognes invasifs

Salmonella
Salmonella responsable des fivres paratyphodes:
- Tableau dentrite fbrile - Multiplication dans les ganglions msentriques - Complications septiques et localisations secondaires possibles surtout chez les patients affaiblis

- Rservoir lanimal

Germes pathognes invasifs

Salmonella
Salmonella responsables des gastro-entrites simples
- Spontanment rsolutives

- Bactrie pntre jusqu la lamina propria et sy multiplie

Germes pathognes invasifs

Campylobacter
Seconde cause de gastro-entrites fbriles en Europe
pidmiologie mal connue en Afrique Rservoirs: oiseaux+++, porc Contamination par voie digestive Tableau de colite ulcreuse ou pseudo membraneuse: fivre leve et diarrhe mucosanglante Complications possibles: cholcystite, arthrite

Germes pathognes invasifs

Yersinia enterocolitica
- Tableau de gastro-entrite fbrile avec
douleurs abdominales et diarrhe sanglante ou non - Parfois tableau de pseudo appendicite - Porte dentre alimentaire - Hte danimaux de boucherie

Germes pathognes invasifs

Escherichia coli
E. Coli entro-pathognes (E.P.E.C):
nouveau-ns et les jeunes enfants selles liquides avec mucus, fivre et dshydratation pathognie: bactries senchssent et dtruisent les cellules en brosse de la muqueuse intestinale Srogroupes O dfinis : 20, 26, 44, 55, 86, 111, 114, 119, 125, 126, 127, 128, 141, 158

Germes pathognes invasifs

Escherichia coli
Escherichia coli ntroinvasif (EIEC):
Pouvoir pathogne identique celui des Shigella Srogroupes O : 28, 32, 112, 115, 124, 136, 143, 144, 147, 152, 164

Germes pathognes invasifs

Staphylococcus aureus
Rare et suit le plus souvent un traitement ayant slectionn le germe
Fivre et diarrhe muco-sanglante

Germes toxinognes

Germes toxinognes

Clostridium difficile
Tableau de colites pseudo-membraneuses induites par les antibiotiques
Diarrhe mucosanglante et formation in situ de pseudo-membranes Commensale de la flore normale de lenfant et plus rarement de ladulte

Prolifration induite par la prise par dantibiotiques (clindamycine, lincomycine, cphalosporines)

Recherche faite sur indications prcises

Germes toxinognes

Vibrio
Vibrio cholerae
Scrtion dune entrotoxine thermolabile Toxine cholrique Diarrhe aqueuse massive afcale, avec des grains riziformes et odeur de poisson Maladie strictement humaine

Germes toxinognes

Vibrio

Vibrio non O1 ou NAG

Proche du cholra par scrtion de toxines voisines de la toxine cholrique

Entrites sporadiques
Pas de contamination secondaire

Germes toxinognes

Vibrio
Vibrio parahaemolyticus
diarrhes aqueuses + vomissements Consommation de poissons, fruits de mer crus Germe marin Pas de transmission inter humaine

Germes toxinognes

Escherichia coli
Escherichia coli entrotoxinognes (ETEC)
Toxine thermolabile LT proche de celle du cholra Et / ou une toxine thermostable Toxine: cholra-like Diarrhe modre ou peu svre Contamination alimentaire: diarrhe des voyageurs

Agents dintoxications alimentaires

Staphylococcus aureus
Souches productrices dentrotoxines
Toxine partiellement thermostable dans les aliments (ptisseries, mayonnaise, plats cuisins contenant de la crme) toxine produite dans les aliments lors de la croissance du germe

Symptmes: nauses, vomissements et diarrhe

Agents dintoxications alimentaires

Autres
Clostidium perfringens type A
Diarrhe avec douleurs intestinales intenses Courte dure et bon pronostic Bacillus cereus: Vomissements intenses + diarrhe sans fivre Toxine thermostable ou toxine thermolabile prsente dans laliment

Autres agents de gastroentrites

Dautres bactries peuvent porter un facteur de virulence pour lintestin ou scrter une entrotoxine Ex: Plesiomonas, Pseudomonas, Aeromonas Recherche non systmatique Mais culture pure ou trs prdominante: interprtation en fonction des symptmes et du terrain

Cas particuliers
Germes retrouvs chez le nouveau-n
Streptococcus agalactiae et Listria monocytogenes, Escherichia coli Germes chez le nourrisson hospitalis Staphylococcus aureus, Bacilles gram ngatif en culture pure

Cas particuliers
Chez les immunodprims hospitaliss
On recherche la prsence : - dune bactrie gram ngatif largement dominante, - de germes potentiellement pathognes (Pseudomonas, Staphylococcus aureus, levures)

Cas particuliers
Recherche de BMR
Chez malades hospitaliss dans services risque (ranimation, ou onco-hmatologie)

Entrobactries productrices de BLSE

Entrocoques rsistant la vancomycine

Objectifs

- Mettre en vidence des germes qui ont un rle pathogne chez un malade au sein dune flore complexe
. Germes pathognes par eux-mmes (nombre

limit despces rputes pathognes)

. Germes commensaux qui peuvent par leur

importance relative crer un dsquilibre fonctionnel - Mettre en vidence des germes qui sont prsents chez un porteur sain

Types de coproculture

 Coproculture classique ou coproculture systmatique

Recherche de Salmonella , Shigella,

Yersinia
Campylobacter

Coproculture oriente
En vue dune recherche dtermine : Vibrio cholerae Listeria monocytogenes Mycobacterium tuberculosis

Dmarche au laboratoire

Prlvement

Prlvement
Selles fraichement mises:

Recueil

Rcipient propre pas obligatoirement strile, type pot vis

Munis dune cuillre ou dune spatule: prlvement ensemencement plus pratiques

Choisir chantillon muco-purulent ou sanglant si prsence couvillonage rectal Recueil sur papier filtre

Biopsies de muqueuse rectale sous rectoscopie

Prlvement

Transport
Achemin sans dlai au laboratoire
Sinon milieux de transport: Cary blair+++ Glycrine tamponne Milieu de Stuart Papier filtre sch

Conservation
12h +4c
Dessiccation Prolifration des bactries commensales carts de ph

Prlvement

Prlvement

Bulletin danalyse
Doit accompagner tout prlvement
Indications cliniques: ge fivre sjour en zone dendmie cas dans lentourage traitement pris Recherche particulire doit tre prcis

Examen macroscopique

 Selles liquides fcales jus de melon afcales eau de riz gairo-sanglantes ou sanglantes muqueuses pseudomembranes Selles pteuses

Examen direct

Examen microscopique ltat frais

Technique

- Dposer sur une lame une petite goutte de mucus fcal ou de selle liquide ajouter un gal volume de bleu de mthylne ou de lugol Mlanger avec une baguette de bois
recouvrir dune lamelle, laisser la coloration se faire pendant 2 3 minutes examiner lobjectif 40

Examen microscopique ltat frais

Technique

- Dposer sur une lame une petite goutte de mucus fcal ou de selle liquide ajouter un peu deau physiologique recouvrir dune lamelle
examiner lobjectif 40

Examen microscopique ltat frais

Rsultats
Permet de dceler la prsence leucocytes: signe dinfection bactrienne invasive

hmaties dans les selles

ventuellement de parasites dune mobilit vocatrice

Examen dun talement color au gram

Permet dobserver lquilibre de la flore :

Flore normale : 1/3 gram +, 2/3 gram Flore anormale: prdominance de Gram + prdominance de Gram flore monomorphe

Culture - Identification

Mise en Culture
Ensemencement

Prlvement lse ou la pipette dun fragment de selles ou quelques gouttes

Sur glose: ensemencement en stries

Sur bouillon: ensemencement par une noisette de selles

Incubation: atmosphre variable

Dure variable

Mise en culture
Milieux disolement Glose slective: SS, TCBS, CIN, CCDA, Karmali. Milieux denrichissement Bouillons Slnite, Rappaport, EPHA Repiquage sur milieux slectifs

Identification
Lecture

Reprage de colonies suspectes

Tests dorientation Examen microscopique Oxydase Catalase Urase.

Identification
Identification biochimique

Galeries en tubes
Galeries miniaturises Identification antignique Srogroupe Srotype Biotypes Antibiogramme Tests de sensibilit aux antibiotiques

Identification

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Coproculture classique

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Examen macroscopique Examen microscopique prsence de leucocytes +/- hmaties dsquilibre de la flore en faveur des Gram Culture Milieux slectifs lactoss: SS, HK, DCL Bouillon denrichissement: bouillon slnite milieu de Rappaport

Culture Milieux denrichissement Rappaport

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Lecture Colonies suspectes Salmonella: lactose ngatif +/- H2S Shigella: lactose ngatif - H2S Tests dorientation recherche durase: 3 5 colonies incubation pendant 4h 37C

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Glose Hektoen

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Glose SS

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Glose Mac Conkey

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Glose BCP

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Glose Drigalski

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Identification

A partir des urases ngatives

Mini galeries: Kligler Hajna Mannitol mobilit Incubation 24h 37C, arobie Caractres biochimiques Caractres antigniques Antibiogramme

Recherche de Salmonelles et de Shigelles

Recherche de Escherichia coli

Recherche de Escherichia coli

Examen macroscopique

Examen microscopique
leucocytes +/hmaties +/-

dsquilibre de la flore en faveur des Gram Culture Milieux slectifs lactoss: EMB Milieu sorbitol-mac conkey (E. Coli O157)

Recherche de Escherichia coli

Glose EMB

Recherche de Escherichia coli

Lecture

Colonies suspectes:
EMB: colonies plates bleues fonces avec un clat mtallique en lumire rflchie Milieu sorbitol-mac conkey: colonies incolores (sorbitol ngatif)

Recherche de Escherichia coli

Identification

Galerie en tubes: KH, MM, UI, CS

Agglutination: ECEP, ECEH O157H7 Recherche de toxine: ECEH, ECEI partir de la souche isole des selles

Recherche de Yersinia enterocolitica

Recherche de Yersinia enterocolitica

Examen macroscopique

Examen microscopique
prsence de leucocytes dsquilibre de la flore en faveur des Gram Culture Milieux slectifs: CIN (cefsulodine-irgasan novobiocine) Bouillon denrichissement: incubation +4C Milieux lactoss des entrobactries

Recherche de Yersinia enterocolitica

Glose CIN

Recherche de Yersinia enterocolitica

Lecture

Milieu CIN: colonies de 1 mm de diamtre, centre rouge entoures dune zone translucide
Milieu de MacConkey: colonies incolores

Milieu Hektoen: colonies saumon

milieu xylose-lysine-dsoxycholate XLD: colonies jaunes opaques

Recherche de Yersinia enterocolitica

Identification

mobiles 25 C, immobiles 37 C
Caractres biochimiques: Urase positive lactose ngatif saccharose positif VP, ONPG, ODC gnralement positifs 28 C et ngatifs 37 C

Recherche de Vibrio cholerae

Recherche de Vibrio cholerae

Examen macroscopique

Examen microscopique
absence de leucocytes bacilles mobiles polaires vol de moucheron Culture Milieux slectifs: TCBS, GNA Bouillon denrichissement: EPHA

Recherche de Vibrio cholerae

Lecture Colonies suspectes TCBS: colonies lisses, transparentes, jaunes (saccharose+) GNA: colonies lisses, translucides Tests dorientation etat frais sur une colonie: mobilit polaire oxydase sur GNA: positive agglutination avec srum anti 01

Identification

Recherche de Vibrio cholerae

Glose TCBS

Recherche de Vibrio cholerae

Glose GNA

Recherche de Campylobacter

Recherche de Campylobacter
Prlvement: pas dcouvillonnage Examen macroscopique Examen microscopique

prsence de leucocytes+/- hmaties

bacilles mobiles polaires, spirals

Recherche de Campylobacter
Milieux de culture

Milieu CCDA: charcoal, cfoprazone, desoxycholate agar

Milieu de Skirrow

Milieu de Butzler
Milieu de Karmali Milieu de Preston

Glose au sang
Glose Columbia au sang de mouton

Recherche de Campylobacter
Culture

- Sur milieu slectif: CCDA

Incubation 42C Atmosphre micro arophile Pendant 24 48h

- Sur milieu denrichissement: bouillon de Preston

Repiquage sur CCDA 42C Micro arophilie 1 5 jours

Recherche de Campylobacter
Culture Mthodes de filtration passive Filtre en actate de cellulose + pores de 0,45 0,65 microns Etale sur une glose au sang Pendant 30 mns 37C Passage des Campylo grce leur mobilit et leur petite taille (0,2 0,4 Um) Glose incube 37C en atmosphre micro arophile Lecture quotidienne pendant 10 jours

Recherche de Campylobacter

Recherche de Campylobacter
Lecture

CCDA ou GSO: Colonies ovales, mtalliques brun gris ou vert gris

Examen microscopique: petits bacilles mobiles polaires, incurvs ou lgrement hlicodaux Repiquage colonies suspectes sur GS 37C, 24h

Recherche de Campylobacter
Identification Catalase Oxydase Test au KOH Hydrolyse de lhippurate Hydroxyle de lindoxyle actate Production dH2S Rduction des nitrates en nitrates Croissance 25 et 42C

Recherche de Campylobacter

C jejuni Oxydase + Catalase + Hippurate + Indoxyl + acetate H2S V Nitrates + 25/42C -/+ CF R NA V

C doylei + V + + -/faible R S

C coli + + + V + -/+ R S

C upsaliensis + Faible + -/+ S S

C lari + + +/faible + -/+ R R

C fetus + + + +/V S R

Recherche de Clostridium difficile

Recherche de Clostridium difficile

Milieu de transport pour anarobies (portagerm)

Prparation des milieux anarobie

Ensemencement sur milieu base de cyclosrinecfoxitine

Incubation: 48 heures en atmosphre anarobie

Colonies: 4 6 mm de diamtre Blanc- gristres Opaques

Recherche de Clostridium difficile

 Milieu de Wilkins Chalgren

Recherche de Clostridium difficile

Autre technique

Slectionner de spores de C. Difficile par chauffage dun chantillon de selles pendant 10 mn 80c,
Traitement de cet chantillon par une solution de thioglycolate de sodium Suspension ensuite tale sur milieux TGY Incubation en anarobiose pendant 24 48 h

Recherche de Clostridium difficile

Mise en vidence de la toxine:

par technique immuno-enzymatique

par immunochromatographie

Autres recherches

Autres recherches
Recherche de staphylocoque Culture facile sur milieu de chapman Pas dantibiogramme sur les staphylocoques isols des selles Intoxication et non dinfection Antibiothrapies abusives qui modifient la flore

normale

Autres recherches
Recherche de Listria monocytogenes

Se fait surtout sur le mconium

Ensemencement sur glose au sang Milieu slectif: (acide nalidixique 40 g/ml, colimycine 4 g/ml, ou trypaflavine 45 g/ml) Milieu denrichissement plac + 4c

Autres recherches
Recherche de Listria monocytogenes

Sur GS: colonies bte hmolytiques

Sur GO: fines colonies translucides Examen direct: petits bacilles immobiles 37C mobiles 33C Gram positif

Autres recherches
Recherche de Listria monocytogenes

Autres recherches
Recherche de Listria monocytogenes
catalase positive esculine positive fermente le glucose pousse + 4C

Recherche de BMR

Recherche de BMR
Entrobactries rsistantes aux C3G

Milieu chromogne: glose BLSE

Milieux MH, BCP ou REB) supplmente en ceftazidime

Glose glucos REB

Colonies rouges (glucose +) entrobactrie ou Acinetobacter (diffrencier sur le gram) Colonies blanches oxydase + Pseudomonas spp Colonies blanches oxydase - Acinetobacter

Recherche de BMR
Entrobactries rsistantes aux C3G

Identification biochimique
Distinction EBCASE/BLSE: test de synergie ac. Clavulanique/C3G ( bouchon de champagne ) CMI (e-tests)

Recherche de BMR
Entrocoques rsistants la vancomycine Milieux spciaux supplment en vancomycine Bouillons: enterococcosel, esculine Gloses: glose bile/esculine BHI agar Vancomycine screen agar

Recherche de BMR
Entrocoques rsistants la vancomycine

Mthode en disque: disque de vancomycine 30g

S si D 17 mm. Pour D < 17 mm, mesurer la CMI Etest cmi vancomycine, ticoplanine S : CMI 4 mg/L I: 4< CMI 16 R: CMI > 16

PCR : dtermination des phnotypes de rsistance vana, vanb, vanc

Cas des TIAC

 Germes les plus frquemment isols Salmonella Staphylococcus aureus Clostridium perfringens Recherche de bactries et/ou toxines

possibles dans selles, aliments, vomissements

Salmonella dtectes dans coproculture standard Autres germes: toxiniques

Conclusion
Lantibiogramme des bactries isoles des matires fcales doit tre systmatique, mais ne doit pas inciter une antibiothrapie Cela permet de dpister lapparition de rsistances nouvelles

Conclusion
La prsence des bactries pathognes dans les selles nimplique pas de maladie Une recherche ngative nimplique pas labsence de maladie

Ne pas rpondre pas de bactries entropathognes mais doit donner la liste des bactries effectivement recherches, par exemple : recherche de Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter ngative