APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE FLUJO

PROBLEMAS BIOLGICOS ABORDABLES MEDIANTE CITOMETRA DE FLUJO

- Estudio de la complejidad y heterogeneidad del SI - Estudio del crecimiento celular - Estudio de la apoptosis - Cuantificacin de la actividad fagoctica - Cuantificacin de la actividad microbicida

COMPLEJIDAD Y

HETEROGENEIDAD CELULAR
DEL SISTEMA INMUNE

COMPLEJIDAD Y

HETEROGENEIDAD CELULAR DEL SISTEMA INMUNE

1) Discriminacin por FSC-SSC 2) Marcaje celular con anticuerpos monoclonales

1) DISCRIMINACIN POR FSC-SSC

Granulocitos

Linfocitos
R1

Monocitos

2) MARCAJE CELULAR CON ANTICUERPOS MONOCLONALES

I) Marcaje Superficial II) Marcaje Intracelular

I) MARCAJE SUPERFICIAL

I) MARCAJE SUPERFICIAL

I) MARCAJE SUPERFICIAL

FICT CD3 T

PE CD56 NK

PerCP CD19 B

I) MARCAJE SUPERFICIAL

Dobles negativos

Simples positivos

Dobles positivos

Triples positivos

I) MARCAJE SUPERFICIAL

I) MARCAJE SUPERFICIAL
- Caracterizacin fenotpica: CD3, CD56, CD19 - Diferenciacin celular: CD95, CD45RA, CD45RO - Coestimulacin: CD28, ICOS, CTLA-4 - Recirculacin: CD62L, CLA, a4b7 - Activacin celular: CD57, CD25, HLA-DR, CD71

II) MARCAJE INTRACELULAR

- Complejidad del sistema inmune - Comunicacin celular a dos niveles * Por contacto, mediante receptores superficiales * Mediante mediadores solubles: citocinas

Marcaje superficial

Fijacin

Permeabilizacin

Marcaje

intracelular

Citocinas intracelulares
CD4
Y

Marcaje con AcMo Fijacin anti-CD4 y anti-CD8

CD8

Permeabilizacin
Y Y Y Y

Anti-CD8 PE-Cy5

Y Y

Anti-CD4 FITC

Y
Anti- IFN gamma Anti- IL 2 Anti- IL 4

PRODUCCION DE IL-6 POR LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO
CONTROL
R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)

0.1%

0.22%

R1

PACIENTE SHOCK SEPTICO

R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)

0.3%
R1

33.8%

PE

II) MARCAJE INTRACELULAR

- Relacionados con la apoptosis: Bcl-2, caspasas - Citoesqueleto: actina - Protenas nucleares: histonas - Antgenos de superficie endocitados: CD4

ESTUDIO DEL CRECIMIENTO CELULAR

ESTUDIO DEL CRECIMIENTO CELULAR

I) Cambios en el tamao celular II) Deteccin de protenas relacionadas con el crecimiento celular III) Sntesis de DNA IV) Historial de divisiones V) Enumeracin celular

I) CAMBIOS EN EL TAMAO CELULAR

- Antes de dividirse las clulas deben aumentar de tamao - Podemos medir crecimiento celular

estudiando aumentos en el FSC

I) CAMBIOS EN EL TAMAO CELULAR

Clulas en proliferacin

II) PROTENAS RELACIONADAS CON EL CRECIMIENTO CELULAR

- Marcaje superficial: Expresin de receptores para
factores de crecimiento: CD25, CD71

- Marcaje intracelular:
* Molculas implicadas en control del ciclo

celular: ciclinas
* Secrecin de factores de crecimiento:citocinas

III) SNTESIS DE DNA

A) Cantidad de DNA en clulas individuales B) Incorporacin de anlogos de bases: BrdU

A) CANTIDAD DE DNA EN CLULAS INDIVIDUALES

A) CANTIDAD DE DNA EN CLULAS INDIVIDUALES

Fase Cantidad DNA

G0/G1
S

2n
2n-4n

G2/M

4n

A) CANTIDAD DE DNA EN CLULAS INDIVIDUALES

PI

Fijacin

Permeabilizacin

A) CANTIDAD DE DNA EN CLULAS INDIVIDUALES

G0/G1
M1

S G2/M
M2 M3

2n

4n

IV) HISTORIAL DE
DIVISIONES: CFSE
- Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE)

- Sonda fluorescente que se une a protenas intracelulares y que se reparte por igual entre las clulas hijas

IV) HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

IV) HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

CFSE

Fluorescencia / clula X X/2 X/4

IV) HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

No proliferantes

R3

R2

Proliferantes

V) ENUMERACIN CELULAR
- Los mtodos anteriores proporcionaban una cifra relativa de las clulas que estn proliferando
- Este mtodo ratiomtrico permite calcular el nmero absoluto de clulas con respecto a las que sembramos inicialmente

CULTIVOS CELULARES
Clulas

Medio

PHA

ENUMERACIN CELULAR
R2

CLULAS T CLULAS B MICROPARTCULAS

R1

Tras cultivo

R1

Crecimiento
Basal

R2 R1 Muerte celular R2

R1
R2

ENUMERACIN CELULAR
Crecimiento

Tras Cultivo

Apoptosis

CLCULO DEL NMERO ABSOLUTO DE CLULAS

N0 = concentracin celular inicial Nt = concentracin celular a tiempo t
Nt = (Ratiot / Ratio0) * N0 Ratiot = (Clst / Partculast) Ratio0 = (Cls0 / Partculas0) t. Partculas = cte. Nt = (Clst / Cls0) * N0

V) ENUMERACIN CELULAR
Basal
Crecimiento
R1 R8

4000 = 2 2000 1 50.000 cls = 2 x

R1

R8

Apoptosis

x = 100.000 cls

Clulas 2000 = 1 = Partculas 2000 2000 = 50.000 cls 2000

R1

1000 = 0.5 2000

R8

1 50.000 cls = 0.5 x x = 25.000 cls

ESTUDIO DE LA APOPTOSIS

ESTUDIO DE LA APOPTOSIS
0) Caractersticas de la apoptosis I) Tamao celular II) Marcaje con anticuerpos monoclonales III) Permeabilidad a sondas fluorescentes que se unen al DNA IV) Extraccin de DNA de bajo peso molecular V) TUNEL VI) Aumento de fosfatidilserina VII) Medida del potencial de la mbra mitocondrial VIII) Disminucin de F-actina IX) Apostaina

APOPTOSIS
-La apoptosis es un modo de muerte celular activo y fisiolgico en el que la clula ejecuta el programa de su propia muerte

- Deben existir seales que induzcan la apoptosis

INDUCCIN DE LA APOPTOSIS

APOPTOSIS vs. NECROSIS

- La apoptosis es un modo de muerte celular
activo y fisiolgico en el que la clula ejecuta

el programa de su propia muerte.

- La necrosis es una muerte accidental debida

a un estrs: choque trmico, hipotnico, pH...

- Los mtodos deben distinguirlas

Diferencias entre apoptosis y necrosis.

Apoptosis
Programada genticamente Disminuye

Necrosis
Accidental Aumenta

Mecanismo Tamao celular

Integridad de membrana Orgnulos

Se mantiene
Se preservan Temprana

Se pierde
Se desintegran Tarda

Condensacin de la cromatina Fragmentacin del DNA

Fragmentacin celular

Restos celulares

Temprana Tarda en fragmentos en fragmentos grandes oligonucleosomales En cuerpos apoptticos Los contenidos . rodeados por membrana de los orgnulos se liberan Son reconocidos Inducen y fagocitados inflamacin local

APOPTOSIS vs. NECROSIS

DIAGRAMA DE FLUJO DE LA TEMPORIZACIN DE LA APOPTOSIS

Activacin de caspasas Prdida de la asimetra de la membrana Prdida de la integridad de membrana / Fragmentacin DNA

Fragmentacin en cuerpos apoptticos

I) TAMAO CELULAR
La deshidratacin y el plegamiento de la membrana plasmtica causan una disminucin de FSC y un aumento de SSC
R1

No viables
R3 R4

Viables

II) MARCAJE CON ANTICUERPOS MONOCLONALES

Marcamos antgenos especficos de la apoptosis A) Marcaje superficial: susceptibilidad a la apoptosis: CD95, TNFRI. B) Marcaje intracelular: determinacin de apoptosis temprana con anticuerpos anti-caspasa activa.

III) PERMEABILIDAD A SONDAS FLUORESCENTES QUE SE UNEN AL DNA PI

7AAD

Viables

No Viables

III) PERMEABILIDAD A SONDAS FLUORESCENTES QUE SE UNEN AL DNA

Viables
Desventajas: - Detecta apoptosis tarda - No discrimina necrticas
M2

No Viables
M1

IV) EXTRACCIN DE DNA DE BAJO PESO MOLECULAR

IV) EXTRACCIN DE DNA DE BAJO PESO MOLECULAR

PI

Diploide (2n)
Viables

Hipodiploide (<2n) Apoptticas

IV) EXTRACCIN DE DNA DE BAJO PESO MOLECULAR

MEDIO CHX

M1

M1

M2

M2

IV) EXTRACCIN DE DNA DE BAJO PESO MOLECULAR

Ventajas: - Simple y barato - Permite estudio de ciclo celular Desventajas: - Detecta apoptosis intermedia y tarda - Puede generar artefactos - No discrimina necrticas

VI) CAMBIOS EN LA COMPOSICIN LIPDICA: AUMENTO DE PS

- Translocacin de la PS durante la apoptosis

- La translocacin es universal y especfica

- Anexina V reconoce especficamente PS

- Combinacin con sondas vitales (7AAD)

VI) CAMBIOS EN LA COMPOSICIN LIPDICA: AUMENTO DE PS

VI) CAMBIOS EN LA COMPOSICIN LIPDICA: AUMENTO DE PS

R2 R3

VI) CAMBIOS EN LA COMPOSICIN LIPDICA: AUMENTO DE PS

Necrticas Apoptticas tardas

Viables

Apoptticas tempranas

VI) CAMBIOS EN LA COMPOSICIN LIPDICA: AUMENTO DE PS

Ventajas: - Detecta fase temprana de la apoptosis - Se puede combinar con marcaje con anticuerpos monoclonales. - Discrimina necrticas Desventajas: - No es especfico en determinadas condiciones

CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD FAGOCTICA

PRINCIPIO DE LA CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD FAGOCTICA

100 % DE FAGOCITOSIS 80 60 40 20 0

MACRFAGO / o GRANULOCITO 10 min, 0 C

5
TIEMPO (min)

10

2.5 min, 37oC

+
E. Coli
FITC

5 min, 37oC 10 min, 37oC

ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA DE LOS GRANULOCITOS (CD15+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCK SEPTICO Control
R1=Granulocitos Control negativo (R1)
0.84%
R1

E. Coli Positivo (R1)

9 5 .4 5 %

Paciente con Shock Sptico

0. 73 %
R1

57%

LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO PRESENTAN UNA ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA Control
R1=Monocitos Control negativo (R1) E. Coli Positivo (R1)

2 .2 5 %

8 1 .2 8%

R1

Paciente con Shock Sptico

1.30%
3 6 .7 4 %

R1

CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD MICROBICIDA

PRINCIPIO DE LA CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD MICROBICIDA O2

e
1
-

O2
H 2O 2 SOD Cl
-

O2

Fe

3+

O2 * OH OH H 2O

OCl

Catalasa

H 2O 2
Mieloperoxidasa Glutation peroxidasa

PRINCIPIO DE LA CUANTIFICACIN DE LA ACTIVIDAD MICROBICIDA

WASHING BUFFER

+
MACRFAGO GRANULOCITO

fMLP E. Coli TPA

GENERACIN DE RADICALES LIBRES
RODAMINA

1,2,3- DIHIDRO- RODAMINA

NO FLUORESCENTE

FITC

R1

R2

Quadrant Statistics File: Oxi RMC-3.005 Sample ID: W.B Tube: Acquisition Date: 9-Dec-98 Gated Events: 2155 X Parameter: SSC-H SSC-Height (Linear) Quad Location: 148, 10 Quad UL UR LL LR Events % Gated 0 0.00 64 2.97 0 0.00 2091 97.03 % Total 0.00 1.60 0.00 52.34 Log Data Units: Linear Values Patient ID: 10 Panel: Gate: G1 Total Events: 3995 Y Parameter: FL1-H Rodamina (Log)

X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean *** *** *** *** 708.08 683.15 43.09 19.03 *** *** *** *** 675.00 657.90 5.11 5.01

R1

R2

Quadrant Statistics File: Oxi RMC-3.005 Sample ID: W.B Tube: Acquisition Date: 9-Dec-98 Gated Events: 115 X Parameter: SSC-H SSC-Height (Linear) Quad Location: 148, 10 Quad UL UR LL LR Events % Gated 0 0.00 5 4.35 14 12.17 96 83.48 % Total 0.00 0.13 0.35 2.40 Log Data Units: Linear Values Patient ID: 10 Panel: Gate: G2 Total Events: 3995 Y Parameter: FL1-H Rodamina (Log)

X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean *** *** *** *** 273.80 270.20 11.53 11.47 112.14 110.25 5.43 5.21 230.90 225.56 5.68 5.54

R1

R2 Quadrant Statistics File: Oxi RMC-3.006 Sample ID: E.Coli Tube: Acquisition Date: 9-Dec-98 Gated Events: 5843 X Parameter: SSC-H SSC-Height (Linear) Quad Location: 148, 10 Quad UL UR LL LR Events 0 552 0 5291 % Gated 0.00 9.45 0.00 90.55 % Total 0.00 5.52 0.00 52.91 Log Data Units: Linear Values Patient ID: 10 Panel: Gate: G1 Total Events: 10000 Y Parameter: FL1-H Rodamina (Log)

X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean *** *** *** *** 686.71 665.12 276.84 53.29 *** *** *** *** 690.27 674.45 5.14 5.02

R1

R2 Quadrant Statistics File: Oxi RMC-3.006 Sample ID: E.Coli Tube: Acquisition Date: 9-Dec-98 Gated Events: 300 X Parameter: SSC-H SSC-Height (Linear) Quad Location: 148, 10 Quad UL UR LL LR Events % Gated 1 0.33 62 20.67 48 16.00 189 63.00 % Total 0.01 0.62 0.48 1.89 X Mean 136.00 252.52 109.17 232.49 Log Data Units: Linear Values Patient ID: 10 Panel: Gate: G2 Total Events: 10000 Y Parameter: FL1-H Rodamina (Log)

X Geo Mean 136.00 246.87 106.55 226.90

Y Mean 16.11 76.30 4.83 6.05

Y Geo Mean 16.11 33.27 4.61 5.89