Espectroscopa

UV-Visible

1
2013
Bouguer, Lambert y Beer.
La ley fotomtrica fue planteada
independientemente (y de distintas maneras)
por Bouguer en 1729, Lambert en 1760 y Beer
en 1852.
Lambert interesado en la representacin de la
profundidad en la pintura y en la transparencia
del aire, propuso en 1760 la ley fotomtrica
finalmente llamada Ley de Lambert-Beer, que
relaciona la absorcin de luz con las
propiedades del material atravesado.


2
Johann Heinrich
Lambert (1728 - 1777),
matemtico, fsico,
astrnomo y
filsofo alemn.
ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA Y VISIBLE
TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA
T = P / P
0
A = - log T = log (P
0
/ P)
LEY DE LAMBERT Y BEER. ABSORTIVIDAD
A = k.b.c
Absortividad (a):
Absorbancia de una solucin de 1 gramo por litro, en celda de 1 cm de paso ptico.
a = A / cb Unidades: L g
-1
cm
-1
.
Coeficiente de extincin especfica [E
(1 %, 1 cm)
]:
Absorbancia de una solucin de 1 % (1g/100 mL), en celda de 1 cm paso ptico.
E
(1 %, 1 cm)
= A / cb = 10 a Unidades: g%
-1
cm
-1
.
Absortividad molar ():
Absorbancia de una solucin de 1 mol por litro, en celda de 1 cm paso ptico.
= a PM Unidades: M
-1
cm
-1
.
3
Po
P
Los valores de a, E
(1 %, 1 cm)
y , a una longitud de onda especfica y en un
solvente determinado, son caractersticos del analito.
CALIBRACIN DE UN ESPECTROFOTMETRO
1. El nivel 0 % de transmitancia con el obturador del instrumento cerrado
2. El nivel del instrumento al 100 % de transmitancia (cero de absorbancia)-BLANCO
4

Simple
haz
Doble
haz
LIMITACIONES A LA APLICABILIDAD DE LA LEY DE LAMBERT Y BEER
Son las desviaciones de la linealidad entre absorbancia y concentracin cuando el
paso ptico (b) es constante.
Desviaciones reales
A concentraciones 0,01 M o menores, el ndice de refraccin es esencialmente constante.
5
Son producidas por:

a) Concentraciones elevadas del analito (>0,01M). (Produce alteracin de la
distribucin de cargas entre las molculas cercanas).
b) Concentraciones elevadas de electrolitos.
c) Los cambios en el ndice de refraccin del sistema analtico, pues como a depende
del ndice de refraccin de la muestra:
=

(
2
+2)
2


Desviaciones instrumentales
a) Radiacin policromtica
La deduccin de la ley de Lambert-Beer supone radiacin monocromtica
Los monocromadores en realidad proporcionan una banda de longitudes de onda.
Cuando a' = a''..., esta ecuacin se simplifica a A = a'bc y se cumple la ley de Beer.

6
=

0
+
0
+

0
. 10

+
0
. 10

+

b) Radiacin esprea
Son reflexiones procedentes de componentes pticos y del monocromador.
Llegan al detector debido a la dispersin por partculas de polvo y a las reflexiones en las
superficies interiores, pudiendo no haber atravesado la muestra.
Posen longitudes de onda que son muy diferentes de las de la banda de luz principal
utilizada.
P
s
es la potencia de la
radiacin esprea no
absorbida.

7
= log

0
+

Desviaciones qumicas
Causadas por equilibrios en solucin que involucran a la especie
absorbente y alteran su concentracin.
Originan desviaciones positivas o negativas, dan lugar a un
producto con un espectro de absorcin diferente al del analito.
Ejemplos:
reacciones de asociacin-disociacin
reacciones cido-base
polimerizacin
formacin de complejos
reacciones con el solvente.
8
APLICACIONES
ANLISIS CUALITATIVO
Se realiza barrido espectral (espectro de absorcin).
Se compara el espectro obtenido de la muestra que contiene el analito
absorbente y el espectro de un estndar de dicho analito.
Requiere proceso de aislamiento y/o purificacin de los analitos absorbentes
contenidas en la muestra.
El anlisis del espectro UV-Visible no se utiliza como criterio nico de identificacin,
sino como anlisis complementario.
ANLISIS CUANTITATIVO
- Amplia aplicabilidad tanto a sistemas orgnicos como inorgnicos
- Sensibilidades de hasta 10
-7
M
- De moderada a alta selectividad
- Buena precisin
- Fcil adquisicin de datos
9
Procedimientos para el Anlisis Espectrofotomtrico
1. Seleccin de la longitud de onda
2. Determinacin de la relacin entre absorbancia y concentracin
a) Mtodo sin la adicin de estndar
b) Mtodo con la adicin de estndar:
til para contrarrestar los efectos de matriz de la muestra.
A
1
= e b V
x
C
x

V
t

A
2
= e b V
x
C
x
+ e b V
s
C
s

V
t
V
t

Donde A
1
y A
2
son las absorbancias de la muestra diluda y de la muestra diluda
ms estndar
10
Algunas utilidades de la espectrofotometra:
DETERMINACIN DE ELEMENTOS POR MEDIO DE AGENTES
COMPLEJANTES
Los complejos de ciertos elementos presentan en muchos casos e 10
4
M
-1
cm
-1
y
absorben fuertemente en el visible.
Los altos coeficientes de absortividad molar permiten la determinacin de
concentraciones del orden de mg/l ppm.
2, 2 Dipiridilo
1,10 fenantrolina
Difenilcarbazona
11
H In + H
2
O H
3
O
+
+ In
-

Forma cida Forma bsica
Especie absorbente a
a
Especie absorbente a
b

DETERMINACIN DE CONSTANTES DE DISOCIACIN DE INDICADORES
CIDO-BASE
K
a
= [ In
-
]
eq
[ H
+
]
eq

[ H In ]
eq

pK
a
= - log [ In
-
]
eq
[ H
+
]
eq
. = pH log [ In
-
]
eq
.
[ H In ]
eq
[ H In ]
eq

Cuya constante de equilibrio o constante de acidez, sera:
Y cuyo pK
a
, sera:
12
Procedimiento
(1) Determinar la longitud de onda de mxima absorcin para cada una
de las dos formas (In
-
y InH).

InH
: 520 nm

In-
: 430 nm
13
Se determina la de mxima absorcin para cada una de las dos formas (In
-
y InH).
Se preparan dos soluciones de indicador con diferentes pH:
Una solucin cida, donde todo el indicador estar en su forma InH
y una solucin bsica, donde todo el indicador estar en su forma In
-
.
(2) Verificar la ley de Lambert y Beer para ambas formas del indicador.
InH
y = 150.50x + 0.02
R
2
= 1.00
y = 10.10x + 0.02
R
2
= 0.99
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
cc (g/ L)
A
b
s
Abs 520nm
Abs 430 nm
Absortividad de InH a 520 nm (a
520
InH) 150,50 L g
-1
cm
-1

Absortividad de InH a 430 nm (a
430
InH) 10,10 L g
-1
cm
-1

In-
y = 73.00x + 0.00
R
2
= 1.00
y = 9.81x + 0.01
R
2
= 0.96
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 0.002 0.004 0.006 0.008
cc (g/ L)
A
b
s
Abs 520nm
Abs 430 nm
Absortividad de In
-
a 520 nm (a
520
In
-
) 9,81 L g
-1
cm
-1

Absortividad de In
-
a 430 nm (a
430
In
-
) 73,00 L g
-1
cm
-1

14
Se verifica Lambert y Beer para ambas formas del indicador.
Se preparan soluciones de distintas concentraciones de la forma cida (InH) y de la forma bsica
(In
-
) trabajando a pH extremos (asegurando la existencia de slo una de las formas del indicador).
Luego se grafica Abs = f (concentracin) y se obtiene de la curva de calibracin la absortividad
de ambas formas (InH y In
-
), a las dos de onda mximas de absorcin.
(3) Determinacin de la concentracin de ambas formas InH y In- a
distintos pH cercanos al pKa.
Solucin de Rojo de
Metilo 0,01 %

10,00 mL

10,00 mL

10,00 mL

10,00 mL
AcNa 0,04 F 25,00 mL 25,00 mL 25,00 mL 25,00 mL
AcH 0,02 F 50,00 mL 25,00 mL 10,00 mL 5,00 mL
Agua destilada c.s.p. 100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL 100,00 mL
pH
4,70 5,05 5,45 5,90
Abs a 520 nm 1,097 0,796 0,456 0,276
Abs a 430 nm 0,356 0,432 0,585 0,658
Abs
520 nm
= a
520
InH.b.(cc InH) + a
520
In
-
.b.(cc In
-
)
Abs
430 nm
= a
430
In
-
.b.(cc In
-
) + a
430
InH.b.(cc InH)
15
Consiste en la determinacin de la concentracin de ambas formas InH y In
-
a distintos pH
cercanos al pKa.
Se preparan soluciones de la misma concentracin total del indicador con distintos pH,
se mide la absorbancia a las dos mximas de absorcin de ambas formas del indicador,
se determina la concentracin de las formas InH y In
-
en cada una de las soluciones preparadas.
Cc InH = . (a
430
In
-
. Abs
520
) (a
520
In
-
. Abs
430
) .
(a
520
InH . a
430
In
-
) (a
520
In
-
. a
430
InH)

Cc In
-
= . (a
520
InH . Abs
430
) (a
430
InH . Abs
520
) .
(a
520
InH . a
430
In
-
) (a
520
In
-
. a
430
InH)
pH Cc. InH (g/L) Cc. In
-
(g/L) pKa Ka
4,70 0.0070 0.0039 4.9557 1.10716 x 10
-5

5,05 0.0049 0.0052 5.0256 9.42651 x 10
-6

5,45 0.0025 0.0076 4.9687 1.07463 x 10
-5

5,90 0.0012 0.0088 5.0531 8.84878 x 10
-6

Ka media = 1,0023 x 10
-5

pKa = 5,00
16
Espectroscopa de
Fluorescencia
17
Fluorescencia
La fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia, son procesos
fotoluminiscentes, las molculas de analito se excitan para dar una
especie, cuyo espectro de emisin brinda informacin para el anlisis
cualitativo y cuantitativo.
Tienen un lmite de deteccin del orden de partes por billn y un
amplio rango lineal (permiten la determinacin cuantitativa de
especies orgnicas e inorgnicas, a nivel de trazas).
Debido a su alta sensibilidad, suelen aplicarse como mtodo de
deteccin en HPLC y electroforesis capilar.
Su utilidad est limitada, ya que pocas especies presentan
fotoluminiscencia.
18
Teora de la fluorescencia y fosforescencia
1) Estados excitados
El principio de exclusin de Pauli establece que en un tomo no
puede haber dos electrones con los cuatro nmeros cunticos
iguales.
Estado Singulete: Dos electrones en un orbital con estados de spn
opuestos (apareados). No presentan un campo magntico neto
(molculas diamagnticas), no son atradas ni repelidas por un
campo magntico permanente.
Estado Doblete: es el estado fundamental de un radical libre, tiene
electrones desapareados, el electrn impar puede tomar dos
orientaciones en un campo magntico, lo que otorga ligeras
diferencias de energa al sistema. Son molculas paramagnticas y
son influenciadas por campos magnticos.
19
Teora de la fluorescencia y fosforescencia
Cuando uno de los electrones de una molcula es
excitado a un nivel de energa superior, se forma
un singulete o triplete.
En el estado singulete excitado, el espn del
electrn promocionado contina apareado con el
del estado fundamental, en el estado triplete los
espines de los dos electrones estn desapareados
(paralelos).
Una molcula es paramagntica en el estado
triplete y diamagntica en el estado singulete.
Una transicin singulete-triplete excitado, es
menos probable que la transicin singulete-
singulete excitado.
Estado singulete
fundamental
Estado singulete
excitado
Estado triplete
excitado
20
2. Procesos de desactivacin (a)
Una molcula excitada puede volver a su estado fundamental
mediante combinacin de varios mecanismos:
Por medio de la fluorescencia y la fosforescencia que conllevan la emisin
de un fotn de radiacin.
Mediante procesos no radiantes de desactivacin o relajacin (flechas
onduladas).
El camino hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el
tiempo de vida del estado excitado.
La fotoluminiscencia se limita a pocos sistemas que presentan
caractersticas estructurales y ambientales que permiten que las
velocidades de los procesos de desactivacin no radiantes se
demoren hasta el punto en el que la reaccin de emisin puede
competir cinticamente con ellos.
21
Esquema de procesos de excitacin y
desexcitacin
Procesos de desactivacin (b)
1) Relajacin vibracional:
en disolucin el exceso de energa vibracional se pierde mediante colisiones entre las molculas
de las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz (t
1/2
=10
-12
seg).
23
Esquema de procesos de excitacin y
desexcitacin
Procesos de desactivacin (b)
1) Relajacin vibracional:
en disolucin el exceso de energa vibracional se pierde mediante colisiones entre las molculas
de las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz (t
1/2
=10
-12
seg).
2) Conversin interna:
son procesos intermoleculares donde la molcula pasa a un estado electrnico de menor
energa sin emisin de radiacin. Es ms eficaz cuando dos niveles de energa electrnicos estn
lo suficientemente cerca como para que haya solapamiento de los niveles de energa
vibracional.

Esquema de procesos de excitacin y
desexcitacin
Procesos de desactivacin (b)
1) Relajacin vibracional:
en disolucin el exceso de energa vibracional se pierde mediante colisiones entre las
molculas de las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz
(t
1/2
=10
-12
seg).
2) Conversin interna:
son procesos intermoleculares donde la molcula pasa a un estado electrnico de menor
energa sin emisin de radiacin. Es ms eficaz cuando dos niveles de energa electrnicos
estn lo suficientemente cerca como para que haya solapamiento de los niveles de
energa vibracional.

3) Conversin externa o amortiguacin colisional:
ocurre por interaccin y transferencia de energa entre la especie excitada y el disolvente
u otros solutos. Todas las condiciones que tienden a reducir el nmero de colisiones entre
partculas (bajas temperaturas y elevada viscosidad) desfavorecen este mecanismo y
tienden a aumentar la fluorescencia.
27
Esquema de procesos de excitacin y
desexcitacin
Procesos de desactivacin (b)
1) Relajacin vibracional:
en disolucin el exceso de energa vibracional se pierde mediante colisiones entre las molculas de
las especies excitadas y las del disolvente. Este proceso es muy eficaz (t
1/2
=10
-12
seg).
2) Conversin interna:
son procesos intermoleculares donde la molcula pasa a un estado electrnico de menor energa
sin emisin de radiacin. Es ms eficaz cuando dos niveles de energa electrnicos estn lo
suficientemente cerca como para que haya solapamiento de los niveles de energa vibracional.

3) Conversin externa o amortiguacin colisional:
ocurre por interaccin y transferencia de energa entre la especie excitada y el disolvente u otros
solutos. Todas las condiciones que tienden a reducir el nmero de colisiones entre partculas (bajas
temperaturas y elevada viscosidad) desfavorecen este mecanismo y tienden a aumentar la
fluorescencia.
4) Cruce entre sistemas:
Se invierte el espn de un electrn excitado y cambia la multiplicidad de la molcula.
La probabilidad de esta transicin aumenta cuando los niveles vibracionales de los dos estados se
solapan.
Es mas frecuente en molculas con tomos pesados (Br y I).
La presencia de especies paramagnticas en la disolucin (O
2
) favorecen este proceso y disminuyen
la fluorescencia.
29
Esquema de procesos de excitacin y
desexcitacin
Fluorescencia y Fosforescencia
VARIACION DE STOKES:

Debido a la alta eficiencia de la
relajacin vibracional, la
desactivacin ocurre desde el menor
nivel vibracional del estado excitado
hacia un estado vibracional del
estado basal, con corrimiento de la
banda de emisin hacia mayores y
menores v con respecto a la de
absorcin.
Un triplete tiene menor energa que un singulete excitado, por lo que la fosforescencia emitida al
desactivarse desde un triplete ser de mayor que la de la desactivacin fluorescente.
La fluorescencia no involucra cambios en el espn electrnico (Tiempo de vida =10
-5
segundos).
En la fosforescencia se rota el espn para generar el estado triplete, aumentando el tiempo de vida, (10
-4
a
segundos).
31
La fosforescencia comprende la desactivacin desde un estado triplete excitado, luego de un cruce intersistemas.
32
Estructura
Temperatura Rigidez estructural
Solvente
Viscosidad
pH
Fluorescencia
Variables que afectan a la fluorescencia y
fosforescencia
kf : fluorescencia
kces : cruce entre sistemas
kce : conversin externa
kci : conversin interna
kpd : predisociacin
kd : disociacin

kf, kpd y kd dependen principalmente de la estructura qumica del compuesto, mientras que el resto de
las constantes estn fuertemente influenciadas por el entorno y en menor medida por la estructura.
Variables que afectan a la fluorescencia y
fosforescencia
1) Rendimiento cuntico o eficiencia cuntica
Es la relacin entre el nmero de molculas que emiten luminiscencia respecto al nmero
total de molculas excitadas.
Para molculas altamente fluorescentes como la fluorescena, la eficacia cuntica es cercana a la unidad.
Las especies qumicas que no presentan fluorescencia apreciable tienen eficacias que se acercan a cero.

El rendimiento cuntico de fluorescencia | de un compuesto, puede calcularse a partir de las
constantes de velocidad relativas de los procesos por los cuales el estado singulete excitado
mas bajo se desactiva.
33
d pd ci ce ces f
K K K K K K
Kf
excitadas molculas de n
fluorescen que molculas de n
+ + + + +
= =

|
2. Factores estructurales (a)
La fluorescencia ms intensa la presentan los compuestos que tienen grupos
funcionales aromticos.
Pueden presentar fluorescencia, compuestos con grupos carbonilo en estructuras
alifticas y alicclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados.
La mayora de los compuestos aromticos no sustituidos son fluorescentes en solucin
y su eficiencia cuntica aumenta con el nmero de anillos y grado de condensacin.
En aromticos, los sustituyentes dadores de electrones (OH, F, OCH
3
y NH
2
),
incrementan la fluorescencia al aumentar la probabilidad del pasaje del estado excitado
al basal, al contribuir con la deslocalizacin de los electrones; ocurriendo lo contrario
con los grupos atractores de electrones.
La falta de rigidez en la molcula, favorece la desactivacin no radiante por conversin
interna.
Ciertos agentes quelantes orgnicos, fluorescen mas intensamente al estar complejados
con un in metlico no paramagntico, debido al aumento de rigidez de la estructura.
Se puede incrementar la fluorescencia adsorbiendo la molcula a un soporte slido.

34
3. Influencia de la temperatura
Al aumentar la temperatura disminuye la eficacia cuntica de fluorescencia, debido
a que aumentan las colisiones entre las molculas y por lo tanto aumenta la
probabilidad de desactivacin por conversin externa.
4. Influencia del solvente
Una disminucin en la viscosidad del solvente aumenta la probabilidad de la
conversin externa y produce el mismo efecto que el aumento de temperatura.

Tambin disminuye la fluorescencia en solventes que tienen tomos pesados.
Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan a los disolventes
compuestos que contienen tomos pesados, ya que en estas condiciones aumenta
la velocidad de formacin del triplete.
35
El oxigeno suele disminuir la intensidad de fluorescencia:
Esto puede deberse a una oxidacin de la sustancia
o a las propiedades paramagnticas del oxigeno molecular, que favorece el cruce entre sistemas y
la conversin de las molculas excitadas al estado triplete (produciendo fosforescencia).
Otras especies paramagnticas tienden a disminuir la fluorescencia.
6. Efecto del oxigeno disuelto
5. Efecto del pH
La fluorescencia de un compuesto aromtico con sustituyentes cidos o bsicos
en el anillo depende normalmente del pH.
Tanto la de absorcin como la de emisin, difieren entre la forma ionizada y la
no ionizada. Esto sugiere que los procedimientos analticos basados en la medida
de fluorescencia requieren un control del pH.

Cuanto mayor es el nmero de formas resonantes, mayor es la estabilidad del
estado excitado y la consecuencia es fluorescencia.
36
Otros factores responsables de las desviaciones negativas a concentraciones elevadas:
Autoaniquilacin o autoquenching.: Se produce como consecuencia del choque entre molculas excitadas, lo cual origina
una desactivacin en forma de energa no radiante.

Autoabsorcin.: la longitud de onda de emisin se solapa con la longitud de onda de absorcin, produciendo una
disminucin de la fluorescencia medida. La radiacin emitida atraviesa la solucin y es reabsorbida por otras molculas en ella
que se relajan en forma no radiante. Este fenmeno puede ser ocasionada por las especies del analito u otras especies
presentes en solucin.

7. Efecto de la concentracin
La potencia de emisin fluorescente F es proporcional
a la potencia radiante del haz de excitacin absorbido
por el sistema.

Reemplazando con Lambert-Beer se obtiene la serie de
Maclaurin.

Si cbc es pequeo solo el primer trmino del polinomio
es significativo y la ecuacin se convierte en lineal.

La ecuacin establece una relacin lineal entre la
concentracin y la intensidad de fluorescencia.
A concentraciones superiores, los trminos no pueden
ser despreciados y se pierde la linealidad.
) (
0
P P K F =
(
(

|
.
|

\
|
+ |
.
|

\
|
= ...
! 3
303 , 2
! 2
303 , 2
. 303 , 2
3 2
0
bc
bc P K F
c
c
K.C F constantes son b y P Si
303 , 2
o
0
= =
= bc P K F c
37
Sensibilidad y especificidad
La alta sensibilidad se debe a que el poder de fluorescencia se puede medir
independientemente de la relacin P y P
0
. En cambio en espectrofotometra,
la medicin requiere evaluar ambos parmetros P y P
0
, ya que la absorbancia
es proporcional a la relacin entre ambas intensidades.

Esto es fcil de comprender si visualizamos que es ms fcil detectar una
pequea seal que una pequea diferencia entre dos grandes seales.

Para aumentar la sensibilidad se puede aumentar la potencia de la lmpara o
amplificar la seal fluorescente.
Su especificidad resulta de la necesidad de conjugar dos espectros: el de
excitacin y el de emisin. Es poco probable que dos compuestos tengan la
misma longitud de onda de excitacin y de emisin de fluorescencia, por esto
es que el mtodo tiene alta especificidad.
38
Absorbancia
Fluorescencia
Fluorescencias vs Absorcin
Fluorescencia Absorcin
Ms sensible Menos sensible
F=2,3.K.c.b.c.Po T=P/P
o
=10
-cbc
Se mide F
A >Po>S
Se mide T
A > Po = S
(aumento proporcional de P)
Ms selectiva Menos selectiva
41
Instrumentos de medida
(1) fluormetro o espectrofluormetro
1) Casi todos los instrumentos de
fluorescencia utilizan pticas de doble haz,
para compensar las fluctuaciones en la
potencia de la fuente.
2) El haz proveniente de la fuente atraviesa un
filtro o monocromador de excitacin que
transmite la radiacin y excluye la de
emisin.
3) La fluorescencia es emitida en todas las
direcciones, pero la mejor manera de
observarla es en un ngulo de 90 con
respecto al haz de excitacin; a otros
ngulos, la dispersin por la solucin y las
paredes de la cubeta, puede causar grandes
errores en la medida de la intensidad.
4) La radiacin emitida llega al detector
fotoelctrico luego de atravesar el filtro o
monocromador de emisin.
5) El haz de referencia pasa por un atenuador,
que reduce su poder aproximadamente 100
veces.
6) Ambos rayos llegan a un amplificador
diferencial y de all al registrador.
Figura 5. Esquema de un fluormetro o
espectrofluormetro.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
42
Instrumentos de medida
Espectrofluormetros

Tipo 1: son los que tienen un filtro para
seleccionar la de excitacin y un monocromador
de red o prisma para la seleccin de la de
emisin.
Tipo 2: son los verdaderos espectrofluormetros,
que tienen dos monocromadores; uno de ellos
permite variar la de excitacin y el otro permite
obtener el espectro de emisin.
Fluormetros

Son anlogos a los fotmetros de absorcin
donde se utilizan filtros para seleccionar las
longitudes de onda de excitacin y emisin.
43
Aplicaciones
1. Determinacin de especies inorgnicas
Existen dos tipos de mtodos:
Los directos donde se forma un quelato fluorescente y se mide
su emisin;
y los indirectos, donde se mide la disminucin de emisin que se
debe a la accin atenuadora de la sustancia que se quiere
determinar. Este ltimo mtodo es ms utilizado en la
determinacin de aniones.
2. Determinacin de especies orgnicas
Se pueden determinar enzimas, coenzimas, medicamentos,
productos naturales, esteroides y vitaminas. Siendo til en el
anlisis de productos alimentarios, farmacuticos, muestras
clnicas y productos naturales.
44
Validacin de Mtodos
Analticos
45
INTRODUCCIN
(1)
Un producto farmacutico puede comercializarse
si cumple una serie de requisitos,
Estos se verifican a travs de ensayos qumicos,
fsicos y microbiolgicos.
Mediante ensayos descriptos en un Mtodo
Analtico se comprueba que el producto cumple
con las especificaciones exigidas.
46
INTRODUCCIN
(2)
Un Mtodo Analtico consta de un conjunto de
ensayos, necesarios para efectuar el anlisis
completo de una sustancia.
Existen 3 tipos fundamentales de ensayo:
Ensayos de Identificacin: se verifica la identidad del
producto analizado.
Ensayos de Valoracin: se verifica la concentracin y
pureza del principio activo en la forma farmacutica en
ensayo.
Ensayos de disolucin: se evala la liberacin de los
principios activos contenidos en el producto
farmacutico.
47
INTRODUCCIN
(3)
Tipos de Mtodos Analticos:
Mtodos estndar (de refencia):
desarrollados por organizaciones de prestigio internacional.
Mtodos oficiales:
exigidos por organismos de regulacin gubernamentales.
Mtodos de revistas cientficas:
usados con especial atencin y requieren previa validacin.
Mtodos del propio laboratorio:
siempre documentados y previamente validados.
Se validan:
1. Mtodos Analticos.
2. Mtodos de control de limpieza.
3. Equipos e instalaciones, Procesos, Software, Personal, etc.
48
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

Validar significa demostrar que un mtodo es
adecuado para el propsito que fue diseado.
(Segn ICH).
Mediante una validacin se demuestra que los resultados
obtenidos a partir del mtodo analtico son confiables.
Se valida debido a que:
1. Disminuye los costos debido a que no sern necesarias las
repeticiones de ensayos, disminuyendo el gasto de materiales y
tiempo de trabajo.
2. Permite un conocimiento profundo de las caractersticas del
mtodo analtico.
3. Constituye un requisito regulatorio.






(ICH:The International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)
49
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

Los mtodos descriptos en Farmacopeas se
consideran validados .
Sin embargo la validez de estos mtodos es
discutible, debido a diferencias en los excipientes
empleados y en la calidad de las materias primas
segn su origen.
Resulta necesario validar el mtodo analtico para
cada producto.
Todos los Mtodos Analticos desarrollados en el
laboratorio o publicados en revistas cientficas
deben ser validados.







50
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

Tipos de Validacin:

Validacin Prospectiva:
Para mtodos nuevos.
Validacin Retrospectiva:
Para mtodos repetidamente utilizados, no validados
anteriormente y de los que se tiene documentacin
suficiente para probar la bondad del mtodo.
Revalidacin:
Repeticin parcial o total de una validacin debido a
cambios efectuados que pueden afectar la bondad del
mtodo validado.






51
52
Los parmetros a considerar en una validacin:

1) Selectividad y Especificidad (*)
2) Linealidad y rango
3) Exactitud
4) Precisin
5) Robustez
6) Sensibilidad
7) Lmite de deteccin y cuantificacin del analito (LOD/LOQ)

(*) Preferentemente se realizan durante el desarrollo del mtodo
analtico.

VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

53
1) Especificidad / Selectividad:

El mtodo desarrollado debe ser capaz de resolver el analito de la
matriz de sus productos de degradacin y de sustancias relacionadas.

Este parmetro se refiere a la propiedad del mtodo analtico de
producir una seal medible debida slo a la presencia del analito y
que no corresponda a la interferencia de otros componentes de la
muestra.
Estos componentes pueden ser excipientes, productos de
degradacin, impurezas de sntesis.




VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

54
Para evaluar la Selectividad:

1) Se introducen determinados interferentes (impurezas,
sustancias relacionadas) y se compara la respuesta con
respecto a la solucin que contiene slo analito)
2) Se realizan degradaciones forzadas (cidas, alcalinas, reductoras,
oxidantes fuertes dbiles, hidrolticas) y se evalua que la seal de
los compuestos productos de la degradacin sea distinta del
analito.
3) Comparar con otros mtodos o tcnicas la habilidad del mtodo
en medir el analito (preferentemente con distintos principios de
deteccin).




VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

55
2) LINEALIDAD:

Se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin del
analito y su respuesta.
Adems se determina el rango lineal, es decir el intervalo de
concentraciones de analito para el cual el mtodo ha sido
probado, dentro de ese rango se pueden realizar
interpolaciones en una curva estndar.
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

56
3) EXACTITUD:

La exactitud indica la capacidad del mtodo analtico para
proporcionar resultados lo ms cerca posible del valor verdadero.
Si la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es pequea, la
exactitud es buena.
No deben confundirse exactitud y precisin.

La precisin est relacionada con la dispersin de una serie de mediciones,
pero no da ninguna indicacin de lo cerca que estn del valor verdadero.
Podemos tener mediciones muy precisas pero poco exactas, sin embargo,
para que un mtodo sea exacto se requiere un cierto grado de precisin.

VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

57
% Recuperacin =
C
3
(C
1
C
2
)
x 100
C
1
: Concentracin de la muestra fortificada
C
2
: Concentracin de la muestra sin fortificar
C
3
: Concentracin de fortificacin
Como se determina la Exactitud?
Existen cuatro mtodos: el de mayor aplicacin y utilizado en este
curso es el que consiste en agregar cantidades conocidas de analito a
la muestra (adicin de estndar), cuando no se pueden preparar
blancos de muestra:
Limites:
(97-103%)
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

58
4) PRECISIN:

Est relacionada con la dispersin de las medidas alrededor
de su valor medio y corresponde al grado de concordancia
entre ensayos individuales cuando el mtodo se aplica
repetidamente a mltiples muestras.
La precisin se expresa matemticamente como desviacin
estndar relativa (RSD) o coeficiente de variacin (CV).


RSD =



X
s 100

=
=
n
i
i
X X
1
1
1
2

=
|
|
.
|

\
|
n
n
i
X
i
X
s
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

59

La precisin de un mtodo analtico se estudia sobre:

El sistema: evaluando la dispersin de al menos 10
inyecciones del estndar

El mtodo: evaluando la dispersin de varias
preparaciones (generalmente en un nmeros de 6)
de la muestra preparada segn se indica en el
mtodo.
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

60
Dentro de la PRECISIN del mtodo se pueden distinguir tres tipos de
estudios:



Repetibilidad Precisin Intermedia Reproducibilidad
Mismo mtodo

Mismo mtodo Mismo mtodo

Misma muestra

Misma muestra

Misma muestra

Mismo Laboratorio

Mismo Laboratorio

Distinto Laboratorio

Mismo analista que
lleva a cabo la
validacin
Diferente analista

Diferente analista

Mismo equipo

Diferente equipo

Diferente equipo

En un corto intervalo
de tiempo

Mayores intervalos de tiempo

Largos intervalos de
tiempo

VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

61
5) ROBUSTEZ:
Capacidad de un mtodo analtico para que los resultados no se
vean afectados por variaciones en los parmetros del
procedimiento.
Es la resistencia de un mtodo a cambiar los resultados cuando se
realizan desviaciones en las condiciones experimentales descriptas
en el procedimiento.
Ejemplos (en HPLC):
Diferente columna
Cambiar la temperatura
Caudal
pH de la Fase mvil
Cambiar el % de SV orgnico en la FM, etc.
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

62
6) Sensibilidad
Se define cuantitativamente como la variacin de seal (X) al
variar la concentracin de analito (c)
Es la pendiente de la curva de calibracin, que es constante en la
mayora de las determinaciones por ser lineales.
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

63
7) LMITES DE DETECCIN Y CUANTIFICACIN:

El propsito es evaluar el mtodo analtico a bajas
concentraciones de analito.

LMITE DE DETECCIN:
Menor concentracin de analito que puede ser detectada pero
no necesariamente cuantificada.

LMITE DE CUANTIFICACIN:
Menor concentracin de analito que puede ser cuantificada con
una precisin y exactitud adecuada.


VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

64

LMITE DE DETECCIN (LoD):
Expresado en forma de concentracin

X
LoD
= X
bl
+ 3.SD
bl
LoD = X
LoD
- X
bl
S

LMITE DE CUANTIFICACIN (LoQ):


Expresado en forma de concentracin

X
LoQ
= X
bl
+ 10.SD
bl
LoQ = X
LoQ
- X
bl

S
VALIDACIN DE METDOS ANALTICOS

65
Bibliografa disponible en internet:

www.iupac.org
www.iso.org
www.ich.org ( Q2 (R1) Validacin de mtodos
analticos).
www.eurachem.ul.pt
www.fda.gov
www.usp.org (Captulo <1225>).

La validacin es un proceso tedioso pero garantiza la calidad
de los resultados analticos.
Problemas a realizar en clase
Problemas de espectrofotometra: 25
Adicin de estndar: 1
Ejercicios de complejos: 1
pk indicador: 5
Fluorescencia: 9
Problema 4 validacin- pg. 67-68
66
Trabajo Prctico
Anlisis cuantitativo de fluorescena en una solucin
inyectable
Objetivos:
1) Reconocer las diferencias instrumentales y operacionales entre
espectroscopa de fluorescencia y espectroscopa UV-vis.
2) Comparar dos mtodos analticos espectroscpicos, uno oficial y otro del
propio laboratorio, en cuanto a su aptitud para el anlisis cuantitativo de un
determinado compuesto. Los criterios a tener en cuenta son: precisin,
exactitud, sensibilidad, linealidad, selectividad y robustez.
3) Observar el fenmeno de quenching en una solucin concentrada de
fluorescena sdica.

67