Professional Documents
Culture Documents
thuyết
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng
tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao ( High Performance Liquid Chromatography)
,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp
(High Pressure Liquid Chromatography)
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp
sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC
ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự
phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy
phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều
nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho
nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công
Phần I : Cơ sở lý thuyết
1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương
pháp chia tách trong đó pha động là châït lỏng và pha tĩnh
chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng
tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn
,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá
học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại
theo kích cỡ ( Rây phân tử ) .
2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột :
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của
quá trình sắc ký và lọai sắc ký .
Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ
pha thuận hoặc pha đảo .
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký
trao đổi ion .
Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử .
Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột
,chúng ta cần có một pha độüng .
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn
hợp chất phân tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết quả các
chất A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột
.Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp
các tương tác .
Cháút phán têch A
+B+C
F1 F2
F3 Pha âäüng
Pha ténh
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định
chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi
lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) .và ngược
lại .
Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi
03 lực F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò
quyết định .còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không
lớn .
Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột
.F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân
tích ra khỏi cột .
Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2
là khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ
di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách
Phần I : Cơ sở lý thuyết :
Phần minh hoạ quá trình tách các chất A
và B trong cột tách sắc ký
Pha
động
Thời gian A B
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
3 - Phân loại sắc ký :
Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loaüi như sau :
3.1 Sắc ký hấp phụ :
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác
nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải
( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột
.Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học
của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp
phụ :
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân
cực ,pha động không phân cực .
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không
phân cực ,pha động phân cực .
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách
các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và
thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình
như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau ....
Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký
hấp phụ pha đảo ( RP )
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột
có giá trị tương ứng như sau :
N = 5,54 ( tR / W0,5)2
T = a/b
a b
Peak dạng đôïi xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì
vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T,
Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.4Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)
* Khi T ≤ 2.5 thì phép định lượng được chấp
nhận
* Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó
xác định ,vì vậy phép định lượng cần phải thay
đổi các điều kiện sắc ký để làm cho Peack cân
đối hơn theo các cách sau :
+ Làm giảm thể tích chết tức là đoaün nối từ
cột đêïn Detector .
+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả
năng rửa giải tăng lên
+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng
Phần I : Cơ sở lý thuyết
5 Phân loại sắc ký và ứng dụng :
+ Theo cơ chế chia tách của sắc ký ,người ta phân ra các
loại sau đây :
Sắc ký hấp phụ ( NP - HPLC và RP - HPLC); sắc ký phân bố -
sắc ký chiết ( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc
ký rây phân tử - sắc ký gel ( IG - HPLC) .Nhưng thực tế
hiên nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ
vào phân tích mẫu .
Column
Degasse Pump
Tiím
mẫu
Detector
Phần II: Hệ thống HPLC
Trong đó :
1- Bình chứa dung môi pha độüng
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong
bộ điều nhiệt )
6- Detector ( nhận tín hiệu )
7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý
dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.
8- In dữ liệu .
Phần II: Hệ thống HPLC
II.1 - Bình đựng dung môi
- Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường
dung môi vào đầu bơm cao áp .Cho phép chúng ta
sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rưaó
giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi
của 04 đường là 100 % .
Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít
khi sử dụng 04 đường dung môi cùng một lúc mà
chúng ta chi sử dụng tối đa là 03và 02 đường để
cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất
hơn,hệ pha độüng đơn giản hơn để quá trình rửa
giải ổn định .
Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ yếu
cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian
Phần II: Hệ thống HPLC
Lưu ý : - Tất cả các dung môi
dùng cho HPLC đều phải là dung môi
tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là
dùng cho HPLC Hay dung môi tinh
khiết phân tích .
- Tất cả các hóa chất dùng để pha
mẫu và pha hệ đệm phải được sử
dụng là hóa chất tinh khiết phân
tích .
Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc
ký hay nhiễu đường nền,tạo ra các
Peak tạp trong quá trình phân tích .
Phần II: Hệ thống HPLC
II.2 Bộ khử khí Degasse :
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các
bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động .
Nêïu như trong quá trình phân tích mà dung
môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện
tượng sau đây sẽ sảy ra - Tỷ lệ pha động của
các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho
thời gian lưu của Peak thay đổi .
- Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí
không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ
không hút được dung môi (Bị e) khi đó áp suất
không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động .
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết
quả phân tích sai .
Phần II: Hệ thống HPLC
II.3- Pump Cao áp :
- Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện
quá trình chia tách sắc ký .Pump phải tạo được
áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at
đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump phải tạo
dòng liên tục .Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999
ml/phút .(hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp
suất rất cao lên đến 1200 bar)
- Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường
có áp suất tôïi đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-
9.999 ml/phút .
- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được
cài đặt . Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên
nhau đẩy dung môi liên tục .
Phần II: Hệ thống HPLC
II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection):
ĐêØ đưa mẫu vào cột phân tích theo phương
pháp không ngừng dòng chảy . Với dung tích
của loop là 5 - 100µl .
Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng
tiêm mẫu thủ công( tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu
tự động( Autosample) .
II.5 Cột sắc ký :
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ
thống sắc ký lỏng hiệu năng cao .
- Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép
không rỉ ,chiều dài cột khoảng 10 -30cm ,đường
kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ φ = 5-10 µ
m.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt
về kích thước và kích cỡ hạt....)
Phần II: Hệ thống HPLC
-Với chất nhồi cột cỡ φ = 1.8 -5 µm có thể
dùng cột ngắn ( 3-10 cm ) và nhỏ ( đường kính
trong 1-4.6 mm)loại cột naỳ có hiệu năng tách
cao.
- Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc
ký ( trong các dược điển USP 23 ,24 có tiêu
chuẩn hóa các lọai cột )
- Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha
thuận)
hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được
bao một lớp mỏng hữu cơ ( pha đảo ) ,ngoài ra
người ta còng dùng các loại hạt khác như :Nhôm
Oxit,Polyme xốp ,chất trao đổi ion.
* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi
Phần II: Hệ thống HPLC
II.6 - Detector :
- Là bộ phận Phát hiện các chất khi chúng ra
khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để
có thể định tính và định lượng .Tùy theo tính
chất của các chất cần phân tích mà người ta sử
dụng loaüi Detector thích hợp và phải thoả mãn
điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của
chất phân tích
A=k.C
Trong : A là tín hiệu đo được
C Nồng độ chất phân tích
k là hằng số thực nghiệm của Detector
đã chọn
Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; Cường
độ phát xạ ,cường độ điện thế ,độ dẫn điện ;độ
Phần II: Hệ thống HPLC
Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai
Detector sau :
+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để
phát hiện UV
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV -
VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ
quang .đây là loại thông dụng nhất
+Detector huỳnh quang đêí phát hiện các chất
hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các
dẫn chất có huỳnh quang .Là loại Detector có độ
chọn lọc cao nhất .
+Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array
,ELSD (Detector tán xạ bay hơi ) các Detector
này có khả năng quét chồng phổ để định tính
Phần II: Hệ thống HPLC
- Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là :
+ Detector điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ
dẫn ,điện lượng ..)
+ DetectorChiết suất vi sai : Detector khúc
xạ ( thông thường dùng cho đo các chất đường )
+ Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt ..
II.6 - Bộ phận ghi tín hiệu
- Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền
sang .
+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy
ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,thời gian
lưu,diện tích của Peak ,chiều cao ..
Phần II: Hệ thống HPLC
+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm
chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các
thông số,phổ đồ và các thông số của Peak như
tính đối xứng,hệ số phân giải .... trong quá trình
phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số
theo yêu cầu của người sử dụng như : Nồng
độ,RSD, ...
II.7 In kết quả :
+ Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in
kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn
thiện hồ sơ .
Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
Muốn có một kết quả táh tốt nhất ta phải tìm được
các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp
mẫu ; Các điều kiện đó bao gồm :
-Mẫu chuẩn :
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống
như mẫu thử trong cùng dung môi ,riêng về nồng độ
các thành phần giôïng như mẫu thử là tốt nhất
,ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm
trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành
phần.
4.4 Cách đo HPLC :
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy
thuôcü vào hãng sản xuất ,phần mền sắc ký . Tuy
nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tăïc sau
:
Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký
Người viết
KS Phan Hiền Lương
Mail :
luonghoak8@ymail.com