You are on page 1of 50

Phần I : Cơ sở lý

thuyết
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng
tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao ( High Performance Liquid Chromatography)
,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp
(High Pressure Liquid Chromatography)
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968
trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp
sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC
ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự
phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy
phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều
nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho
nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công
Phần I : Cơ sở lý thuyết
1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương
pháp chia tách trong đó pha động là châït lỏng và pha tĩnh
chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng
tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn
,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá
học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại
theo kích cỡ ( Rây phân tử ) .
2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột :
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của
quá trình sắc ký và lọai sắc ký .
Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ
pha thuận hoặc pha đảo .
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký
trao đổi ion .
Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử .
Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột
,chúng ta cần có một pha độüng .
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn
hợp chất phân tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết quả các
chất A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột
.Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp
các tương tác .
Cháút phán têch A
+B+C
F1 F2
F3 Pha âäüng
Pha ténh
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định
chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi
lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) .và ngược
lại .
Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi
03 lực F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò
quyết định .còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không
lớn .
Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột
.F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân
tích ra khỏi cột .
Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2
là khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ
di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách
Phần I : Cơ sở lý thuyết :
Phần minh hoạ quá trình tách các chất A
và B trong cột tách sắc ký

Pha
động

Thời gian A B
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
3 - Phân loại sắc ký :
Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loaüi như sau :
3.1 Sắc ký hấp phụ :
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác
nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải
( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột
.Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học
của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp
phụ :
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân
cực ,pha động không phân cực .
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không
phân cực ,pha động phân cực .
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách
các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và
thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình
như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau ....
Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký
hấp phụ pha đảo ( RP )
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột
có giá trị tương ứng như sau :

L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 -


10 µm
L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 -
10 µm
L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 -
10 µm
Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột
NH2,CN . . vv
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
4 - Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trinh tách các chất được


Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ như
hình trên
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
To : Thời gian lưu chết
tr2
t’r1 : Thời gian lưu thực
chất A
tr1
t’r2 : Thời gian lưu thực
chất B
tr1 : Thời gian lưu chất A
t’r1
tr2 : Thời gian lưu chất B
to t’r2
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại
lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để dánh giá
một quá trình sắc ký .Dưới đây là một số đại lượng
thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại
lượng này có lơiü cho quá trình phân tích sắc ký.
4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi
bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột
đạt giá trị cực đại.
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất
khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng
một điều kiện sắc ký đã chọn .Vì vậy thời gian lưu là
đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động
+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ
thuộc vào pH của pha động .
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém
,còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của
Peak rất kém ,thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo
theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá chất,
độ chính xác của phép phân tích kém.
Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã
trình bày .
4.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity Factor
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố
của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ
số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan
trong pha động ở trong thời điểm cân bằng .
K’ = ( tR - t0)/ t0
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém . Nếu
K’ lớn thì Peak bị doãng . Trong thực tế K’ từ 1- 5
là tối ưu .
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
4.3 - Độ chọn lọc α :
Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ
thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’A và K’B khác
nhau thì mới có khả năng tách .,mức độ tách
biểu thị ở Độ chọn lọc α .

α = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A


với α càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng

α= 1.02 α= 1.16 α= 1.20


Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.2 Số đĩa lý thuyết N:
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột
trong một điều kiện sắc ký nhất định .Mỗi đĩa lý thuyết
trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều
cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một
khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt
động học được thiết lập giữa nồìng độ trung bình của chất
tan trong pha tĩnh và pha động .
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :
+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh
+ Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha
động
+ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột .
Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiều cao
H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý
Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.2 Số đĩa lý thuyết N:
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức
sau :

N = 5,54 ( tR / W0,5)2

Trong đó : tR : Thời gian lưu của chất phân


tích .
W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak .
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500
là vừa đủ .
Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.3 Độ phân giải R : ( Resolution )
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra
khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải
của 02 Peak cạnh nhau phải được tính theo công thức sau
:
R= 2( t’RB - t’RA)/ (wa + wB)

Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ


phân giải tối thiểu để 02 Peak tách là R =1.0 .Trong phép
định lượng R=1,5 là phù hợp
+ Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán
diện tích Peak sẽ không chính xác ,lúc này phải tìm cách
tăng R theo 03 cách sau:
* Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của
pha động ( Thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay
đôíi cường độ ion nếu là IE - HPLC ....)
* Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
4.3 Độ phân giải R : ( Resolution )
* Làm tăng độ chọn lọc α bằng cách dùng cột khác
phù hợp hơn với quá trình tách hoặc thay đổi thành phần
pha động .
+ Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn nhiều
pha động ,độ nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay
đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi
. Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký dùng chương trình
dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo theo
sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian
lưu và diện tích của các Peak ta phân tích .
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình
Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được
hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng các yêu cầu trong
quá trình phân tích .
Phần I : Cơ sở lý
thuyết
4.4 Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)
Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng
của Peak trên sắc ký đồ thu được .
T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa Peak tại
điểm 1/10 chiều cao Peak :

T = a/b
a b

Peak dạng đôïi xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì
vậy phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T,
Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.4Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)
* Khi T ≤ 2.5 thì phép định lượng được chấp
nhận
* Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó
xác định ,vì vậy phép định lượng cần phải thay
đổi các điều kiện sắc ký để làm cho Peack cân
đối hơn theo các cách sau :
+ Làm giảm thể tích chết tức là đoaün nối từ
cột đêïn Detector .
+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả
năng rửa giải tăng lên
+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng
Phần I : Cơ sở lý thuyết
5 Phân loại sắc ký và ứng dụng :
+ Theo cơ chế chia tách của sắc ký ,người ta phân ra các
loại sau đây :
Sắc ký hấp phụ ( NP - HPLC và RP - HPLC); sắc ký phân bố -
sắc ký chiết ( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc
ký rây phân tử - sắc ký gel ( IG - HPLC) .Nhưng thực tế
hiên nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ
vào phân tích mẫu .

5.1 Sắc ký hấp phụ :


* Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác
nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản
hấp phụ) cuả pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự
tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của
chất hấp phụ .Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:
Phần I : Cơ sở lý thuyết
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC):
Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực
.
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC):
Pha tĩnh không phân cực pha động phân cực
.
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng
rãi ,thành công để tách các hỗn hợp các
chất có tính chất gần tương tự nhau và
thuộc loại không phân cực ,phân cực yếu
hay trung bình như các Vitamin, các thuốc
hạ hiệt giảm đau .......
Phần II : Hệ thống HPLC
I- Máy HP:C gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ
đồ sau :

Column

Degasse Pump

Tiím
mẫu

Detector
Phần II: Hệ thống HPLC
Trong đó :
1- Bình chứa dung môi pha độüng
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong
bộ điều nhiệt )
6- Detector ( nhận tín hiệu )
7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý
dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.
8- In dữ liệu .
Phần II: Hệ thống HPLC
II.1 - Bình đựng dung môi
- Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường
dung môi vào đầu bơm cao áp .Cho phép chúng ta
sử dụng 04 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rưaó
giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi
của 04 đường là 100 % .
Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít
khi sử dụng 04 đường dung môi cùng một lúc mà
chúng ta chi sử dụng tối đa là 03và 02 đường để
cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất
hơn,hệ pha độüng đơn giản hơn để quá trình rửa
giải ổn định .
Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ yếu
cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian
Phần II: Hệ thống HPLC
Lưu ý : - Tất cả các dung môi
dùng cho HPLC đều phải là dung môi
tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là
dùng cho HPLC Hay dung môi tinh
khiết phân tích .
- Tất cả các hóa chất dùng để pha
mẫu và pha hệ đệm phải được sử
dụng là hóa chất tinh khiết phân
tích .
Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc
ký hay nhiễu đường nền,tạo ra các
Peak tạp trong quá trình phân tích .
Phần II: Hệ thống HPLC
II.2 Bộ khử khí Degasse :
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các
bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động .
Nêïu như trong quá trình phân tích mà dung
môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện
tượng sau đây sẽ sảy ra - Tỷ lệ pha động của
các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho
thời gian lưu của Peak thay đổi .
- Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí
không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ
không hút được dung môi (Bị e) khi đó áp suất
không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động .
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết
quả phân tích sai .
Phần II: Hệ thống HPLC
II.3- Pump Cao áp :
- Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện
quá trình chia tách sắc ký .Pump phải tạo được
áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at
đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump phải tạo
dòng liên tục .Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999
ml/phút .(hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp
suất rất cao lên đến 1200 bar)
- Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường
có áp suất tôïi đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-
9.999 ml/phút .
- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được
cài đặt . Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên
nhau đẩy dung môi liên tục .
Phần II: Hệ thống HPLC
II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection):
ĐêØ đưa mẫu vào cột phân tích theo phương
pháp không ngừng dòng chảy . Với dung tích
của loop là 5 - 100µl .
Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng
tiêm mẫu thủ công( tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu
tự động( Autosample) .
II.5 Cột sắc ký :
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ
thống sắc ký lỏng hiệu năng cao .
- Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép
không rỉ ,chiều dài cột khoảng 10 -30cm ,đường
kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ φ = 5-10 µ
m.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt
về kích thước và kích cỡ hạt....)
Phần II: Hệ thống HPLC
-Với chất nhồi cột cỡ φ = 1.8 -5 µm có thể
dùng cột ngắn ( 3-10 cm ) và nhỏ ( đường kính
trong 1-4.6 mm)loại cột naỳ có hiệu năng tách
cao.
- Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc
ký ( trong các dược điển USP 23 ,24 có tiêu
chuẩn hóa các lọai cột )
- Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha
thuận)
hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được
bao một lớp mỏng hữu cơ ( pha đảo ) ,ngoài ra
người ta còng dùng các loại hạt khác như :Nhôm
Oxit,Polyme xốp ,chất trao đổi ion.
* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi
Phần II: Hệ thống HPLC
II.6 - Detector :
- Là bộ phận Phát hiện các chất khi chúng ra
khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để
có thể định tính và định lượng .Tùy theo tính
chất của các chất cần phân tích mà người ta sử
dụng loaüi Detector thích hợp và phải thoả mãn
điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của
chất phân tích
A=k.C
Trong : A là tín hiệu đo được
C Nồng độ chất phân tích
k là hằng số thực nghiệm của Detector
đã chọn
Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; Cường
độ phát xạ ,cường độ điện thế ,độ dẫn điện ;độ
Phần II: Hệ thống HPLC
Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai
Detector sau :
+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để
phát hiện UV
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV -
VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ
quang .đây là loại thông dụng nhất
+Detector huỳnh quang đêí phát hiện các chất
hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các
dẫn chất có huỳnh quang .Là loại Detector có độ
chọn lọc cao nhất .
+Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array
,ELSD (Detector tán xạ bay hơi ) các Detector
này có khả năng quét chồng phổ để định tính
Phần II: Hệ thống HPLC
- Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là :
+ Detector điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ
dẫn ,điện lượng ..)
+ DetectorChiết suất vi sai : Detector khúc
xạ ( thông thường dùng cho đo các chất đường )
+ Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt ..
II.6 - Bộ phận ghi tín hiệu
- Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền
sang .
+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy
ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,thời gian
lưu,diện tích của Peak ,chiều cao ..
Phần II: Hệ thống HPLC
+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm
chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các
thông số,phổ đồ và các thông số của Peak như
tính đối xứng,hệ số phân giải .... trong quá trình
phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số
theo yêu cầu của người sử dụng như : Nồng
độ,RSD, ...
II.7 In kết quả :
+ Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in
kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn
thiện hồ sơ .
Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
Muốn có một kết quả táh tốt nhất ta phải tìm được
các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp
mẫu ; Các điều kiện đó bao gồm :

Pha tĩnh : - Loại pha tĩnh


- Kích thước cột
Pha động : Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng,
nhiệt độ ... Nếu là chương trình rửa giải Isocratic
Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng,
nhiệt độ và chương trình dung môi ... Nếu là
chương trình rửa giải Gradient.
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

Hệ thống trang bị:


- Loại Detector:
- Van tiêm mẫu,thể tích tiêm
- Hệ đường dẫn
Các yếu tố khác : nhiệt độ ,độ nhạy của
detector bước sóng phân tích
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.1 : Lựa chọn pha tĩnh


- Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần
và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích
.....ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha
thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau ...
Chúng ta thông thường dùng 02 loại cột pha
thuận ( NP) và cột pha đảo ( RP)
Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác
như cột CN ,cột NH2 ,....
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

Cột pha thuận ( NP): Silicagel trung tính


Pha tĩnh :Cột này là loại cột dùng để tách các chất
không phân cực hay ít phân cực .Trên bề mặt hoạt
động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa
nước .
Ví dụ cột Lichrosorb Si 40,Si 60... Cấu tạo cột
như sau :
OH OH OH
- O - Si - O - Si - O - Si - O -
OH OH OH
Pha động : dùng cho loaüi này là các dung môi
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.1 : Lựa chọn pha tĩnh


Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel đã Alkyl hóa )
Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân
cực ,các chất phân cực có thể tạo cặp Ion .Trên bề
mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là
thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng
( C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các
mạch Carbon vòng( Phenyl- tương đương cột Phenyl
)
vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít .
Ví dụ như cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 ...... ODS ,
Cột Nucleosil C18........
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

Pha Động : Pha động dùng trong loại này là các


dung môi có phân cực như :Methanol
,Acetonitril,,nước hay các loại dung dịch đệm ,hỗn
hợp của các dung môi-đệm .
Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp
lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân
tích Dược phẩm . Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại
này là chủ yếu .
Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có
hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế
của nguyên tử H ,ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh
trên nền Oxid Nhôm,trên nền chất hữu cơ cao phân
tử,trên nền mạch các bon......
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.2 : Lựa chọn pha động


- Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần
và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích
.....ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình
rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp
ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày
đồng thời phải có thời gian phân tiïch phù hợp nhằm
tiết kiệm được dung môi,hóa chất,thời gian phân
tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị .
- Pha động có thể làm thay đổi :
+ Độ chọn lọc α
+ Thời gian lưu
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

- Pha động có thể làm thay đổi :


+ Hiệu năng tách của cột
+ Độ phân giải
+ Tính đối xứng của Peak
Do đó ,Trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta
chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta
sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp
các chất cần phân tích . Chính vì vậy pha động cần
có cầu yêu cầu sau :
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có .Không
được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học . ( vd giá
trị pH : 2.5< pH <8.5)
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+Pha động phải hòa tan được các chất phân


tích thì mới rửa giải được chúng.( đặc biệt phải chú
ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi
phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột
,hay pha động có sẵn trong cột vd : đệm phosphat
rưả ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên
column)
+ Pha động phải bền vững theo thời gian :
càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha
động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân
tích mẫu ).
+ Phải có độ tinh khiết cao : dung môi cho
HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích .
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+ Phải phù hợp với loại Detector : vd UV - VIS


thì dung môi không được hấp thụ quang (vd acid acetic ở bước
sáng thấp < 220 nm) . Detector huỳnh quang thì dung môi

không được phát quang.


+ Phải kinh tế ,không quá hiếm và đắt
Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC) pha
động là dung môi phân cực là : Nước,ACN,MeOH
,acid hay Base hữu cơ và một vài Amin hay
Aminoacid ..
+ Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo
thành một pha động phân cực hơn chất hữu cơ
nguyên một mình nó .Vd thêm nước vào ACN hay
MeOH .. Sẽ tạo được pha động phân cực hơn nó .
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+ Ngòai các dung môi chính thì trong thành


phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP-
HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định
pH.Chất tạo phức,tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải
tốt nhất .
+ Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực
rửa rải E của dung môi theo bảng sau:
BẢNG ĐỘ PHÂN CỰC CỦA MỘT SỐ DUNG MÔI
01- n Hexan 0.1 04 -
Methanol 5.11
02-Tetra Chloro Carbon 1.6 05- Actenitril
5.8
Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

- Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc


hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương
trình sắc ký . Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký
tốt,phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính,định
lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách
nhanh chóng và hiệu quả cao .
- Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các
phương pháp chọn điều kiện sắc ký tuy nhiên để
chọn được chương trình sắc ký tốt đồi hỏi phải có
thời gian ,tài liệu và một phần kinh nghiệm của
những người làm sắc ký
Phần IV : Tiến hănh sắc ký
- IV -1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc :
+ Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định
kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân
tích có độ đúng,độ lặp lại,tuyến tính,tỷ lệ dung môi
,tốc đô dòng,năng lượng đèn ü ....đúng theo yêu cầu
thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra .
+ Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về
số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về
khả năng tách ,và rửa đúng qui định sau mỗi lần
chạy sắc ký :
vd : Với sắc ký pha thuận NP-HPLC : rửa bằng
MeOH Không rưẳ bằng Nước
Phần IV : Tiến hănh sắc ký
-Tỷ lệ ACN hay MeOH : Nước ( 50 : 50 ) cho
sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời
để bảo vệ cột không bị Mốc khi để lâu . Tuyệt đối
tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đoú để cột
một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị
mốc ,hỏng không thể dùng được . Xin lưu ý nếu rưẳ
cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể
đáp ứng được các yêu cầu phân tích .
4.2 - Chuẩn bị dung môi pha động :
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh
khiết HPLC
Các hóa chất dùng phải là loạûi PA
Pha dung môi đúng ,chính xác theo đúng tỷ lệ
Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

-4.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC :


+ Mẫu Thử : Sử lý mẫu thử theo đúng chuyên
luận ,qui trình theo nguyên tắc :
- Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan
trong pha động ,trong nhiều trường hợp dùng dung
môi pha động để hòa tan mẫu - Phải loại bỏ
các chất không tan trong pha động hoặc không rưẳ
giải được bằng cách lọc hay chiết ..
-Phải lọc và ly tâm ,lọc mẫu qua màng lọc 0.2
- 0.45 µm
- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải,không vượt
quá khả năng tách của cột.Có thể gây ra nghẽn cột.
Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

-Mẫu chuẩn :
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống
như mẫu thử trong cùng dung môi ,riêng về nồng độ
các thành phần giôïng như mẫu thử là tốt nhất
,ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm
trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành
phần.
4.4 Cách đo HPLC :
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy
thuôcü vào hãng sản xuất ,phần mền sắc ký . Tuy
nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tăïc sau
:
Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

+ Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký


như :
* Cấu hình máy
* Tỷ lệ các dung môi pha động
* Bước sóng,thành phần mẫu,
các thông số của quá trình phân tích
yêu cầu .
Phần V

Hệ thống sắc ký Merck - Hitachi


vă phần mềm diều khiển
D7000 – Multi HSM manager
(Sẽ bổ sung sau)

Người viết
KS Phan Hiền Lương
Mail :
luonghoak8@ymail.com

You might also like