CONSERVACIN Y CONTROL DE CEPAS MICROBIANAS

Normas generales para la conservacin de cepas microbianas

Los tres objetivos para una correcta conservacin:

1.-Mantenimiento en Cultivo puro (PUREZA) 2.-Que este viva(70-80%) (VIABILIDAD) 3.-La cepa debe guardarse genticamente estable (ESTABILIDAD)

La conservacin de cepas microbianas

Mtodo de eleccin o de conservacin a largo plazo Mtodos Alternativos

Mtodos Restringidos

La conservacin de cepas microbianas

Mtodo de eleccin o de conservacin a largo plazo

Conservacin por congelacin Conservacin por liofilizacin

Conservacin de microorganismos por congelacin

La crioconservacin consiste en la conservacin de los microorganismos a temp. < 0 C. Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por la disminucin del agua disponible.

Objetivos de la crioconservacin

- Mantenimiento de la viabilidad
-crioprotectores -La temperatura de almacenamiento (-70,-139) -El estado fisiolgico de la clula (Final f.logartmica) - Mantenimiento de la estabilidad (fenotpica y genotpica) - Mantenimiento de la pureza

Hielo

Hielo
Hielo
H2O H2O

BACTERIA
H2O H2O

Hielo Hielo

Hielo

Hielo

Hielo

AGENTES CRIOPROTECTORES

OBJETIVOS
Minimizar daos durante la congelaci. Limitar la formacin de hielo (tasa de congelacin)

CARACTERISTICA S
No txico para la clula. Penetrar facilmente en la menbrana celular. Unirse a los electrolitos o a las molculas de agua.

Crioprotectores ms comunes

Glicerol (15-20%) Dimetilfulfxido (DMSO) cido glutmico Glucosa Sacarosa Meso inositol Lactosa Leche Descremada

Procedimiento
1.
2. 3. 4.

5. 6.

Crecer los cultivos a conservar hasta la mitad o final de la fase logartmica, a la temperatura ptima, en el medio ms adecuado. Ajustar el n de clulas a una concentracin final de 26x106 cl/ml. Aadir los crioprotectores adecuados a una concentracin ptima. Repartir la suspensin en ampollas de congelacin,cerrarlas hermeticamente y mantenerlas 30 minutos a 30. Disminuir la t lo mas rpido posible. A la hora de recuperar los microorganismos, descongelar rpidamente, sumergiendo las ampollas con el cultivo congelado en un bao a 37-40C.

Fundamentos tericos de la conservacin de microorganismos por liofilizacin

Liofilizacin

Es un mtodo de conservacin a largo plazo.

Se basa en la paralizacin del metabolismo celular por falta de agua: congelacin y sublimacin

PROCESO Congelar el agua libre de las clulas

Eliminacin del agua Agua congelada Vapor de agua

Sublimacin

1 Fase de la Desecacin

2 Fase de la Desecacin

PROCESO
P R O T E C T O R

Congelacin Rpida
T ambiente,4C,-196C Tubos marcados

BOMBA BOMBA

condensador

Sellado al vacio

Ampolla

Crioprotectores para liofilizar:

No se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de evaporacin y a su higroscopicidad, que provoca que los lifilos queden muy viscosos. Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfxido, porque es algo txico, y al concentrarse por la evaporacin del agua puede daar a las clulas microbianas.

Se recomiendan el inositol para la mayora de las bacterias y la leche descremada para hongos y actinomicetos

Cundo aplicar la Liofilizacin?

Es un mtodo ampliamente utilizado para conservar distintos Microorganismos. SI -Bacterias,Levaduras, Hongos,Algunos virus,Algas Ejemplos:Rhodospirillum, ,Azospirillum,vibrio y dems bacterias marinas. -Levaduras miceladas con dificultad en la esporulacin. -Hongos con grandes conidios o con dificultad en la esporulacin. NO -Dificultad de un crecimiento Adecuado. -Microorganismos delicados que no resisten el paso de congelacin. -A tamaos de clulas mayores, menos efectivo es el proceso Protozoos,Clulas animales, Clulas vegetales,Arqueobacterias y bacterias delicadas

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

Condiciones de Cultivo
El medio de cultivo Depender del tipo de microorganismo y sus requerimientos nutricionales. Fase de crecimiento del cultivo. F.exponencial. Suspenciones celulares de 108-109 Clulas/ml en bacterias, algo inferiores en hongos y levaduras. Condiciones de incubacin. T,aerobiosis, anaerobiosis, etc.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

Preparacin de las clulas para su conservacin - Composicin del medio de la suspensin y adecuada densidad ptica El medio de la suspensin deber proteger la viabilidad de las clulas. Usar el crioprotector adecuado en cada caso. Glucosa 7,5% para Anaerobios Glucosa 15% para Levaduras. Glutmico 0,67M para Bacterias Lcticas. Inositol 5% para Bacterias. Leche descremada para Levaduras, Hongos y Actinomicetos.
-

Tipos de ampollas,tubos y viales para la liofilizacin. Dependern del equipo del que se disponga o del tipo de muestra a liofilizar. Se aconseja que no sean de cristal de pyrex o borosilicato, porque por su elevada resistencia ofrecern muchas dificultad en su apertura.

FACTORES IMPLICADOS EN LA CONSERVACIN POR EL PROCESO DE LIOFILIZACIN

-Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C. -Grado de deshidratacin alcanzado. Lo ms alto posible. -Atmsfera de oxgeno en el tubo. Las clulas liofilizadas se guardan en tubos al vaco para evitar Rehidratacin o presencia de gases (como el oxgeno) que pueden daar las clulas. -Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante a 18C y sin bajar de los 0C y, en oscuridad

LIOFILIZACIN
VENTAJAS -Reduccin de la variabilidad del microorganismo. -Largo tiempo de conservacin. -Aplicabilidad para la produccin y distribucin de los lotes DESVENTAJAS -El alto coste inicial del equipo. -La preparacin de forma incorrecta de los distintos lotes puede desembocar en un estancamiento de la viabilidad y/o en prdidas en la estabilidad de los caracteres de los microorganismos

La conservacin de cepas microbianas

Mtodos Alternativos
Conservacin por transferencia peridica Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar estril

Conservacin por transferencia peridica

Los organismos permanecen activos durante el proceso. Consiste en la inoculacin de microorganismos en un medio de cultivo adecuado,la incubain a una T adecuada para obtener crecimiento y finalmente el almacenamiento bajo unas condiciones adecuadas. El proceso es repetido a intervalos que garanticen la obtencin de un cultivo fresco antes de la prdida del viejo.

PARA UNA BUENA RESIEMBRA PERIDICA

Medio de cultivo. Temperatura, tiempo y condiciones de incubacin (disminucin cantidad de inculo) Intervalo entre dos resiembras
Reduccin de la temperatura de almacenamiento (4-8 C) Medios no enriquecidos,con limitacin de nutrientes. Restriccin de la accesibilidad de aire del cultivo. Medio mineral estril

Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar esteril

Mtodo alternativo muy usado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como en levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estril unas cuantas clulas del cultivo que se quiere conservar (<104-105 clulas/ml). Para los hongos filamentosos que no esporulan, se puede poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en agua de mar diluida.

Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro Desecacin en suelos,arena silicagel,etc Desecacin en bolitas de alginato Desecacin en sal gorda para halobacterias

La conservacin de cepas microbianas

Mtodos Restringidos
Desecacin en papel de filtro Desecacin en suelos,arena silicagel,etc Desecacin en bolitas de alginato Desecacin en sal gorda para halobacterias

Mtodos de desecacin
Paquete cerrado

Papel de filtro

Papel Watman n4

15 minutos 121C

Paquetes semicerrado

Desecador
P R O T E C T O R

Papel con cultivo

2-3 semanas 4C

Cultivo

Suspensin celular

Gotas de cultivo

Cerrado de Los paquetes

Mtodos de desecacin

Suelo, arena o silica gel

20 minutos 121C

Tierra esteril 4C

P R O T E C T O R

4-5das 25C

Cultivo esporulado

Suspensin de esporas

G E R M I N A Agotamiento C de I nutrientes N

Microorganismos en fase durmiente

Almacenamiento a 18C

Mtodos de desecacin

Bolas de Alginato

Gotas

Placa petri con Papel secante

Alginato 3% 13 minutos 121C CaCl2 0,03M esteril Gotas de alginato con cultivo 30 minutos Cultivo Suspensin en agua esteril Medio de Cultivo 0,75M Sacarosa 48horas Gotas de alginato con cultivo

DESECACIN
Corriente de aire estril bomba de vaco a Temperatura controlada

Polimerizacin del Alginato

Prdida del 30% del peso

Comparacin de algunos mtodos de preservacin

Mtodo Almacenamient o (aos) Ventajas
Equipamiento requerido bajo, buena estabilidad gentica Bajo riesgo de contaminacin, buena a regular estabilidad gentica Simple, bajo costo, equipamiento requerido bajo bajo costo, equipamiento requerido bajo Simple , bajo costo, bajo equipamiento requerido Preparacin rpida, buena estabilidad gentica

Desventajas
Requiere protectores, Alto costo de freezer (-80C). Clulas pueden ser sensibles al O2 Alto costo de equipamiento Secado del agar, baja estabilidad gentica, riesgo contaminacin trabajo moderado, baja estabilidad gentica Estabilidad gentica regular Suministro regular de N lquido

Congelamiento

4-5

Liofilizacin

15-20

Agar

0.5-2

Aceite mineral

2-20

Agua

1-5

N lquido

infinito

Tipos de Liofilizadores

Liofilizador con centrifugacin

Se utilizan ampollas de vidrio taponadas La suspensin se centrifuga durante la 1 fase de la desecacin Se estrechan las ampollas y,despus de conectarlas a una bomba de vaco,se sellan.

Liofilizador con estantes

La suspensin se prepara en viales y,es precongelada a T muy bajas antes de aplicar el vaco. La segunda etapa de la desecacin se realiza tambin en el liofilizador.

Ventajas:Se utiliza la centrifugacin para que el proceso de congelacin sea suave y de forma homognea

Ventajas:La Desecacin es de manera progresiva y continuada