Tinh chÕ enzyme

T¹i sao ph¶i tinh chÕ enzyme

 Nã rÊt quan träng ®Ó nghiªn cøu enzyme trong

hÖ thèng ®¬n gi¶n (víi c¸c ion, c¸c ph©n tö
dung m«i, cofactor,…) ®Ó hiÓu ®­îc cÊu tróc,
®éng häc, c¬ chÕ, sù ®iÒu hoµ cña nã vµ
nhiÖm vô trong hÖ thèng phøc t¹p.
 ViÖc tinh s¹ch enzyme lµ rÊt quan träng ®Ó sö
dông nã trong c¸c môc ®Ých y häc vµ c«ng
nghiÖp.
 Môc ®Ých cña viÖc tinh chÕ enzyme

Môc ®Ých:

+ N¨ng suÊt tèi ®a cã thÓ

+ ho¹t tÝnh xóc t¸c tèi ®a
+ TÝnh tinh s¹ch tèi ®a cã thÓ
 Chän nguån thu enzyme
Ph­¬ng ph¸p cæ ®iÓn liªn quan tíi viÖc chän nguån cã nhiÒu
enzyme.
- Acetyl CoA carboxylase (mammary gland)
-Alkailine phosphatase (kidney)

C¸ch tiÕp cËn hiÖn ®¹i nhê kü thuËt t¸i tæ hîp

-3-phosphoshikimate-t-carboxylvinyl transferase ë E. coli. (1984)
- T¨ng n¨ng suÊt 100 lÇn

Procaryon nh­lµ vsv chñ (E.coli, Bacillus)

-Ph¸t triÓn nhanh vµ thµnh phÇn m«i tr­êng ®¬n gi¶n
- BÊt lîi: thiÕu sù biÕn ®æi sau dÞch m· (glycosylation) vµ h×nh
thµnh inclusion bodies
NÊm men nh­lµ nguån thu enzyme
-S. cerevisiae Ýt h×nh thµnh cơ thể vùi (conclusion bodies),
nh­ng ph¸t triÓn chËm vµ t¹o ra hyperglycosylation.

TÕ bµo c«n trïng nh­baculovirus vector

-Cã thÓ sö dông nhiÒu sù biÕn ®æi protein, qu¸ tr×nh xö lý
vµ hÖ thèng vËn chuyÓn trong c¸c tÕ bµo eucaryont bËc cao.

“Fusion protein”
-Glutathione-S-transferase, maltose protein liªn kÕt hoÆc
His-tag ®­îc ­a dïng
- Lµm t¨ng ®¸ng kÓ lîi thÕ tinh s¹ch vµ ®«i khi c¶ tÝnh hoµ
tan cña protein.
C¸c enzyme quan t©m ®­îc s¶n xuÊt ë chñng quen biÕt

-Alkaline protease ho¨c a-amylase -> B. licheniformis,

- Glucoamylase -> Aspergillus
- acid cellulase -> Trichoderma
- glucose/xylose isomerase -> Streptomyces
Separation process options

Less specific methods

• centrifugation
• precipitation
• extraction
• filtration
• membrane microfiltration
• ultrafiltration
Separation process options

More specific methods

• adsorption
• gel filtration
• Special filtration steps
• Crystallization
 C¸c ph­¬ng ph¸p tinh chÕ chñ yÕu

1.Ph­¬ng ph¸p kÕt tña (ammonium sulphate)

2.T¸ch dùa trªn kÝch th­íc ph©n tö (läc gel)
3.T¸ch dùa trªn ®iÖn tÝch (s¾c ký trao ®æi
ion)
4.T¸ch dùa trªn sù t­¬ng t¸c ®Æc biÖt víi c¸c
ph©n tö sinh sinh häc (s¾c ký bio-affinity)
5.T¸ch dùa trªn c¸c nguyªn lý kh¸c (s¾c ký t­
¬ng t¸c kþ n­íc)
 Lecture 4

Topic 4: Tinh chÕ enzyme

Nguån enzyme
1. T¸ch b»ng kÕt tña
a. KÕt tña muèi
ChiÕt
b. KÕt tña dung m«i h÷u c¬
c. C¸c chÊt polymer h÷u c¬
T¸ch
2. Lo¹i muèi.
a. B¸n thÊm
Purity &
b. Läc gel
characterization
c. Siªu läc
 T¸ch b»ng kÕt tña
T¹i sao?
Nguån enzyme

Nh÷ng lîi Ých

ChiÕt  Lµm gi¶m thÓ tÝch chiÕt
 §¹t ®­îc sù t¸ch tõng phÇn
T¸ch  Cã lîi cho b­íc tinh chÕ ban ®Çu

Purity &
characterization
T¸ch b»ng kÕt tña nh­thÕ nµo

1. KÕt tña muèi

* B»ng ammonium sulfate

2. KÕt tña b»ng dung m«i h­u c¬

* B»ng acetone

3. Polymer h÷u c¬
* B»ng polyethyneglycol (PEG)
 KÕt tña muèi ammonium sulfate

Enzyme bÞ kÕt tña “salted out” b»ng t­¬ng t¸c sî

n­íc nh­thÕ nµo?

Sù cã mÆt cña c¸c amino acid sî n­íc trªn bÒ mÆt

Cña protein (nh­phe, tyr, leu, ile, met, val).

C¸c ph©n tö n­íc sÏ s¾p xÕp quanh patch

h¸o n­íc cña protein
 KÕt tña ammonium sulfate
C¸c ph©n tö n­íc sÏ s¾p xÕp
quanh vïng sî n­íc cña protein
C¸c ph©n tö n­íc tù do s½n cã bÞ xua
®uæi khi muèi ®­îc bæ sung. Buéc n­íc
“frozen” lo¹i bá
C¸c vïng sî n­íc lé ra ngoµi vµ
c¸c acid amin t­¬ng t¸c víi nhau
KÕt côc lµ:
* Protein kÕt hîp l¹i
* Sù cïng kÕt hîp m¹nh h¬n trong chÊt
chiÕt th«
 T¹i sao sö dông ammonium sulfate vµ
kh«ng sö dông c¸c muèi kh¸c?

 Ammonium sulfate dÔ thu ®­îc ë tr¹ng th¸i tinh khiÕt

vµ kh«ng ®¾t
 Tan tèt trong n­íc (4M, dd muèi)
æn ®Þnh protein (2-3M)
Ng¨n ngõa proteolysis
 KÕt tña ammonium sulfate
®­îc tùc hiÖn nh­thÕ nµo?
KiÓm tra thÓ tÝch t¸ch

TÝnh l­îng muèi

cÇn thiÕt ®Ó ®¹t ®­îc Ly t©m thu protein vµ hoµ tan
kÕt tña muèi mong muèn trong mét Ýt buffer

§Ó yªn dÞch t¸ch

Cho muèi tõ tõ vµo dÞch t¸ch
®Ó protein kÕt tña hoµn toµn
khÊy liªn tôc; ®Ó dÞch t¸ch trong
bÓ l¹nh
 Lµm thÕ nµo ®Ó biÕt dung dÞch b·o hoµ ammonium
sulfate lµ phï hîp nhÊt ®Ó kÕt tña protein quan t©m?

 Lµm thÕ nµo ®Ó biÕt sù kÕt tña ammonium sulfate

dïng ®Ó kÕt tña mét phÇn protein cña chóng ta?
Chóng ta thùc hiÖn thö nghiÖm ®Çu tiªn
sö dông c¸c d¶i muèi b·o hoµ kh¸c nhau

 0 ®Õn 20% ë mçi d¶i ph©n ®o¹n,

 20 ®Õn 40% x¸c ®Þnh l­îng protein thu ®­îc
 40 ®Õn 60% vµ ho¹t tÝnh enzym. Ph©n ®o¹n
 60 ®Õn 80% cã ho¹t tÝnh riªng cao nhÊt lµ
 80 ®Õn 100% enzyme mµ chóng ta muèn cã
TÝm sù ®iÒu chØnh tinh

 Dùa trªn sù t×m tßi ban ®Çu cña m×nh, chóng ta cã

thÓ t×m d¶i ph©n ®o¹n tinh chØnh
 NÕu chóng ta nghÜ r»ng protein/enzyme cã d¶i b·o hoµ
trong kho¶ng 40 –60%, chóng ta cã thÓ thö:
 40 ®Õn 45%
 45 ®Õn 55%
 55 ®Õn 60%
 B¶ng b·o hoµ ammonium sulphate
Init %  20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100

0 10.6 13.4 16.4 19.4 22.6 25.8 29.1 32.6 36.1 39.8 43.6 47.6 51.6 55.9 60.3 65.0 69.7

5 7.9 10.8 13.7 16.6 19.7 22.9 26.2 29.6 33.1 36.8 40.5 44.4 48.4 52.6 57.0 61.5 66.2

10 5.3 8.1 10.9 13.9 16.9 20.0 23.3 26.6 30.1 33.7 37.4 41.2 45.2 49.3 53.6 58.1 62.7

15 2.6 5.4 8.2 11.2 14.1 17.2 20.4 23.7 27.1 30.6 34.3 38.1 42.0 46.0 50.3 54.7 59.2

20 0 2.7 5.5 8.3 11.3 14.3 17.5 20.7 24.1 27.6 31.2 34.9 38.7 42.7 46.9 51.2 55.7
25 0 2.7 5.6 8.4 11.5 14.6 17.9 21.1 24.5 28.0 31.7 35.5 39.5 43.6 47.8 52.2
30 0 2.8 5.6 8.6 11.7 14.8 18.1 21.4 24.9 28.5 32.3 36.2 40.2 44.5 48.8
35 0 2.9 5.7 8.7 11.8 15.1 18.4 21.8 25.8 29.6 32.9 36.9 41.0 45.3
40 0 2.9 5.8 8.9 12.0 15.3 18.7 22.2 26.3 29.6 33.5 37.6 41.8
45 0 3.0 5.9 9.0 12.3 15.6 19.0 22.6 26.3 30.2 34.2 38.3
50 0 3.0 6.0 9.2 12.5 15.9 19.4 23.5 26.8 30.8 34.8
55 0 3.1 6.1 9.3 12.7 16.1 20.1 23.5 27.3 31.2
60 0 3.1 6.2 9.5 12.9 16.8 20.1 23.9 27.9
65 0 3.2 6.3 9.7 13.2 16.8 20.5 24.4
70 0 3.2 6.5 9.9 13.4 17.1 20.9
75 0 3.3 6.6 10.1 13.7 17.4
80 0 3.4 6.7 10.3 13.9
85 0 3.4 6.8 10.5
90 0 3.4 7.0
95 0 3.5
100 0
 KÕt tña dung m«i h÷u c¬

C¸c dung m«i cã thÓ trén lÉn víi n­íc ®­îc (acetone, ethanol)
Ho¹t tÝnh n­íc (water activity) sÏ gi¶m xuèng, t¹i sao?

 Buéc cÊu tróc n­íc quanh c¸c vïng sî n­íc thay thÕ c¸c ph©n
tö dung m«i h÷u c¬
 Lµm cho c¸c vïng ®ã cã tÝnh hoµ tan t­¬ng ®èi cao

KÕt côc lµ: lµm gi¶m tÝnh hoµ tan cña c¸c protein cã thÓ hoµ tan
trong n­íc, dÉn ®Õn:
 sù kÕt hîp vµ kÕt tña c¸c ph©n tö lín kÕt tña tr­íc hÕt
 do c¸c lùc tÜnh ®iÖn vµ ph©n cùc, van der waals
Chän dung m«i

 Cã thÓ trén hoµn toµn víi n­íc

 Kh«ng ph¶n øng víi protein
 Cã hiÖu øng kÕt tña tèt

Cã 2 lo¹i dung m«i th«ng dông

Acetone
 Ethanol
 KÕt tña polymer h÷u c¬

Polyethyleneglycol

 PEG 6000 hoÆc 20000

 Thµnh c«ng lín nhÊt víi c¸c protein Ýt tan

§iÒu bÊt lîi

 Khã lo¹i bá PEG
 Nång ®é PEG thÊp còng lµm h­hai ho¹t tÝnh cña enzyme
 Lo¹i muèi

CÇn thiÕt b­íc nµy v× c¸c lý do sau:

 Cã thÓ liªn quan tíi viÖc thö nghiÖm ho¹t tÝnh sinh häc
 Cã thÓ liªn quan tíi c¸c b­íc tinh chÕ ®ßi hái nång ®é
lùc ion thÊp trong mÉu

 S¾c ký trao ®æi ion

 chromatofocusing
 §iÖn di dù bÞ (preparative electrophoresis)
Cã nh÷ng ph­¬ng ph¸p g× ®Ó lo¹i muèi?

1. ThÈm tÝch sö dông tói cellulose

2. Läc gel sö dông ph©n tö gel sµng (sieve gel)

3. Siªu läc qua hÖ thèng mµng

Tãm l­îc

1. B­íc ®Çu tiªn th­êng ®­îc sö dông sau khi chiÕt t¸ch protein
lµ ®Ó lµm gi¶m thÓ tÝch cña mÉu b»ng kÕt tña muèi

2. C¬ së chÝnh cña b­íc nµy lµ kÕt tña protein.

3. Lo¹i bá muèi sau khi thùc hiÖn b­íc nµy cã thÓ lµ cÇn
thiÕt
vµ cã thÓ ®¹t ®­îc b»ng thÈm tÝch vµ läc gel
 Xö lý nhiÖt
 
Trong nhiÒu tr­êng hîp, ho¹t ®éng cña c¸c enzyme kh«ng
cÇn thiÕt cã thÓ ®­îc lo¹i bá b»ng viÖc xö lý nhiÖt.
NhiÒu enzym kh¸c nhau cã tÝnh nh¹y c¶m do biÕn tÝnh
nhiÖt vµ cã sù kÕt tña kh¸c nhau. §Ó lo¹i bá c¸c enzyme
kÐm chÞu nhiÖt ra khái hån hîp víi enzyme chÞu nhiÖt
th× yªu cÇu tr­íc tiªn lµ c¸c enzyme ph¶i t­¬ng ®èi chÞu
nhiÖt. Tinh s¹ch c¸c enzyme chÞu nhiÖt ho¹t ®éng cho
phÐp dÔ dµng vµ nhanh chãng.
§èi víi c¸c enzym nh­vËy viÖc xö lý nhiÖt lu«n ®­îc xem
nh­mét sù lùa ®Çu tiªn trong tinh s¹ch enzyme.
Ph­¬ng ph¸p ®Æc biÖt nµy ®· ®­îc ¸p dông thµnh c«ng
cho s¶n xuÊt glucose isomerase, trong ®ã nhiÖt ®é ®­îc
sö dông mét c¸ch t­¬ng ®èi cao (lµ 60 – 85oC trong 10
phót).