Ly Thuyet Sac Ky Long Hieu Nang Cao (HPLC)

Pháön I : Cå såí lyï
thuyãút
HPLC laì chæî viãút tàõt cuía 04 chæî caïi âáöu bàòng tiãúng Anh
cuía phæång phaïp sàõc kyï loíng hiãûu nàng cao ( High
Performance Liquid Chromatography) ,træåïc kia goüi laì phæång
phaïp sàõc kyï loíng cao aïp (High Pressure Liquid Chromatography)
Phæång phaïp naìy ra âåìi tæì nàm 1967-1968 trãn cå såí phaït triãøn
vaì caíi tiãún tæì phæång phaïp sàõc kyï cäüt cäø âiãøn . Hiãûn nay
phæång phaïp HPLC ngaìy caìng phaït triãøn vaì hiãûn âaûi hoaï cao
nhåì sæû phaït triãøn nhanh choïng cuía ngaình chãú taûo maïy phán
têch .Hiãûn nay noï aïp duûng ráút låïn trong nhiãöu nghaình kiãøm
nghiãûm âàûc biãût laì æïng duûng cho nghaình kiãøm nghiãûm
Thuäúc . Vaì noï hiãûn laì cäng cuû âàõc læûc trong phán têch caïc
thuäúc âa thaình pháön cho pheïp âënh tênh vaì âënh læåüng .
Pháön I : Cå såí lyï thuyãút
1 - Khaïi niãûm : Sàõc kyï loíng hiãûu nàng cao laì mäüt phæång phaïp chia
taïch trong âoï pha âäüng laì cháït loíng vaì pha ténh chæïa trong cäüt laì cháút
ràõn âaî âæåüc phán chia dæåïi daûng tiãøu phán hoàûc mäüt cháút loíng phuí
lãn mäüt cháút mang ràõn ,hay mäüt cháút mang âaî âæåüc biãún âäøi bàòng
liãn kãút hoaï hoüc våïi caïc nhoïm chæïc hæîu cå .Quaï trçnh sàõc kyï loíng
dæûa trãn cå chãú háúp phuû,phán bäú ,trao âäøi Ion hay phán loaûi theo kêch
cåî ( Ráy phán tæí ) .
2- Nguyãn tàõc cuía quaï trçnh sàõc kyï trong cäüt :
Pha ténh laì mäüt yãúu täú quan troüng quyãút âënh baín cháút cuía quaï trçnh
sàõc kyï vaì loüai sàõc kyï .
Nãúu pha ténh laì cháút háúp phuû thç ta coï Sàõc kyï háúp phuû pha thuáûn
hoàûc pha âaío .
Nãúu pha ténh laì cháút trao âäøi Ion thç ta coï Sàõc kyï trao âäøi ion .
Nãúu pha ténh laì cháút Loíng thç ta coï Sàõc kyï phán bäú hay sàõc kyï chiãút .
Nãúu pha ténh laì Gel thç ta coï Sàõc kyï Gel hay Ráy phán tæí .
Cuìng våïi pha ténh âãø ræía raíi cháút phán têch ra khoíi cäüt
,chuïng ta cáön coï mäüt pha âäüüng .
Nhæ váûy nãúu chuïng ta naûp máùu phán têch gäöm häùn håüp
cháút phán têch A,B,C .. Vaìo cäüt phán têch ,kãút quaí caïc cháút
A,B,C.. Seî âæåüc taïch ra khoíi nhau sau khi âi qua cäüt .Quyãút âënh
hiãûu quaí cuía sæû taïch sàõc kyï åí âáy laì täøng håüp caïc tæång taïc .
Cháút phán têch A +B+C
F1 F2
F3
Pha ténh Pha âäüng
thuyãút
Täøng cuía 03 tæång taïc naìy seî quyãút âënh cháút naìo
âæåüc ræía raíi ra khoíi cäüt træåïc tiãn khi læûc læu giæî trãn
cäüt laì nhoí nháút ( F1) .vaì ngæåüc laûi .
Âäúi våïi mäùi cháút ,sæû læu giæî âæåüc qui âënh båíi 03
læûc F1,F2,F3 .Trong âoï F1 vaì F2 giæî vai troì quyãút âënh
.coìn F3 laì yãúu täú aính hæåíng khäng låïn .
ÅÍ âáy F1 laì læûc giæî cháút phán têch trãn cäüt .F2 laì læûc
keïo cuía pha âäüng âäúi våïi cháút phán têch ra khoíi cäüt .
Nhæ váûy våïi caïc cháút khaïc nhau thç F1 vaì F2 laì khaïc
nhau ,Kãút quaí laì caïc cháút khaïc nhau seî di chuyãøn trong
cäüt våïi täúc âäü khaïc nhau vaì taïch ra khoíi nhau khi ra
khoíi cäüt . ( nhæ hçnh dæåïi âáy )
Pháön I : Cå såí lyï thuyãút :
Pháön minh hoaû quaï trçnh taïch caïc cháút A vaì B
trong cäüt taïch sàõc kyï
Pha âäüng
Thåìi gian A B
3 - Phán loaûi sàõc kyï :
Theo cå chãú taïch sàõc kyï ngæåìi ta phán loaüi nhæ sau :
3.1 Sàõc kyï háúp phuû :
Quaï trçnh sàõc kyï dæûa trãn sæû háúp phuû maûnh ,yãúu khaïc nhau cuía
pha ténh âäúi våïi caïc cháút tan vaì sæû ræía giaíi ( phaín háúp phuû ) cuía
pha âäüng âãø keïo cháút tan ra khoíi cäüt .Sæû taïch mäüt häùn håüp phuû
thuäüc vaìo tênh cháút âäüng hoüc cuía cháút háúp phuû . Trong træåìng
loaûi naìy coï 02 loaûi háúp phuû :
+ Sàõc kyï háúp phuû pha thuáûn ( NP - HPLC) : Pha ténh phán cæûc ,pha
âäüng khäng phán cæûc .
+ Sàõc kyï háúp phuû pha âaío (RP - HPLC) : Pha ténh khäng phán cæûc
,pha âäüng phán cæûc .
Loaûi sàõc kyï naìy âæåüc aïp duûng ráút thaình cäng âãø taïch caïc häùn
håüp caïc cháút coï tênh cháút gáön tæång tæû nhau vaì thuäüc loaûi khäng
phán cæûc,phán cæûc yãúu hay trung bçnh nhæ caïc Vitamin,thuäúc haû
nhiãût giaím âau ....
Hiãûn nay chuïng ta âang sæí duûng chè coï loaûi sàõc kyï naìy maì thäi.
Chuí yãúu hiãûn nay chuïng ta sæí duûng loüai sàõc kyï háúp
phuû pha âaío ( RP )
Trong dæåüc âiãøn USP khi chuïng ta tra cæïu cäüt coï giaï trë
tæång æïng nhæ sau :
L1 : RP 18 Kêch thæåïc haût tæång æïng tæì 5 - 10 m

L7 : RP 8 Kêch thæåïc haût tæång æïng tæì 5 - 10 m
L3 : Si 60 Kêch thæåïc haût tæång æïng tæì 5 - 10 m
Vaì coìn mäüt säú loaûi cäüt khaïc nhæ cäüt Diol , Cäüt NH 2,CN .
. vv
4 - Caïc âaûi læåüng âàûc træng cuía sàõc kyï âäö
Kãút quaí cuía quaï trinh taïch caïc cháút âæåüc Detector
phaït hiãûn ghi thaình sàõc kyï âäö nhæ hçnh trãn
To : Thåìi gian læu chãút
tr2
t’r1 : Thåìi gian læu thæûc cháút
A
tr1
t’r2 : Thåìi gian læu thæûc cháút
B
tr1 : Thåìi gian læu cháút A
t r1
’
tr2 : Thåìi gian læu cháút B

to t’r2
thuyãút
Tæì caïc thäng säú cuía caïc peak trãn âáy ,nhiãöu âaûi læåüng âàûc
træng vãö lyï thuyãút âæåüc âæa ra âãø đaïnh giaï mäüt quaï trçnh
sàõc kyï .Dæåïi âáy laì mäüt säú âaûi læåüng thæåìng duìng trong
thæûc tãú vaì caïch thay âäøi caïc âaûi læåüng naìy coï låiü cho quaï
trçnh phán têch sàõc kyï.
4.1 Thåìi gian læu thæûc t’r : Retention time
Thåìi gian læu cuía mäüt cháút laì thåìi gian tênh tæì khi båm máùu vaìo
cäüt cho âãún khi cháút âoï ra khoíi cäüt âaût giaï trë cæûc âaûi.
Thåìi gian læu cuía mäùi cháút laì hàòng âënh vaì caïc cháút khaïc nhau
thç thåìi gian læu seî khaïc nhau trãn cuìng mäüt âiãöu kiãûn sàõc kyï
âaî choün .Vç váûy thåìi gian læu laì âaûi læåüng âãø phaït hiãûn âënh
tênh caïc cháút.
Thåìi gian læu phuû thuäüc vaìo caïc yãúu täú :
+ Baín cháút sàõc kyï cuía pha ténh.
+ Baín cháút ,thaình pháön,täúc âäü cuía pha âäüng
+ Cáúu taûo vaì baín cháút phán tæí cuía cháút tan
+ Trong mäüt säú træåìng håüp thåìi gian læu coìn phuû thuộc vaìo
pH cuía pha âäüng .
thuyãút
Trong mäüt pheïp phán têch nãúu tr nhoí quaï thç sæû taïch keïm ,coìn nãúu tr
quaï låïn thç peak bë doaîng vaì âäü làûp laûi cuía Peak ráút keïm ,thåìi gian
phán têch ráút daìi âäöng thåìi keïo theo nhiãöu váún âãö khaïc nhæ hao täún
dung mäi,hoaï cháút, âäü chênh xaïc cuía pheïp phán têch keïm.
Âãø thay âäøi thåìi gian læu chuïng ta dæûa vaìo caïc yãúu täú trãn âaî trçnh
baìy .
4.2 Hãû säú dung læåüng K’ : Capacity Factor
Hãû säú dung læåüng cuía mäüt cháút cho biãút khaí nàng phán bäú cuía
cháút âoï trong hai pha cäüng våïi sæïc chæïa cäüt tæïc laì tyí säú giæîa
læåüng cháút tan trong pha ténh vaì læåüng cháút tan trong pha âäüng åí
trong thåìi âiãøm cán bàòng .
K’ = ( tR - t0)/ t0
Nãúu K’ nhoí thç tR cuîng nhoí vaì sæû taïch keïm . Nãúu K ’ låïn
thç Peak bë doaîng . Trong thæûc tãú K’ tæì 1- 5 laì täúi æu .
thuyãút
4.3 - Âäü choün loüc  :
Âäü choün loüc  cho biãút hiãûu quaí taïch cuía hãû thäúng
sàõc kyï ,khi 02 cháút A ,B coï K’A vaì K’B khaïc nhau thç
måïi coï khaí nàng taïch .,mæïc âäü taïch biãøu thë åí Âäü
choün loüc  .
 = K’B / K’A Våïi âiãöu kiãûn K’B > K’A

våïi  caìng khaïc 1 thç khaí nàng taïch caìng roî raìng
= 1.02 = 1.16 = 1.20

4.2 Säú âéa lyï thuyãút N:
Säú âéa lyï thuyãút laì âaûi læåüng biãøu thë hiãûu nàng cuía cäüt trong
mäüt âiãöu kiãûn sàõc kyï nháút âënh .Mäùi âéa lyï thuyãút trong cäüt sàc
kyï giäúng nhæ laì mäüt låïp pha ténh coï chiãöu cao laì H ,Táút nhiãn
låïp naìy coï tênh cháút âäüng tæïc laì mäüt khu væûc cuía hãû phán taïch
maì trong âoï mäüt cán bàòng nhiãût âäüng hoüc âæåüc thiãút láûp giæîa
näöìng âäü trung bçnh cuía cháút tan trong pha ténh vaì pha âäüng .
Bãö daìy H phuû thuäüc vaìo nhiãöu yãúu täú :
+ Âæåìng kênh vaì âäü háúp phuû cuía haût pha ténh
+ Täúc âäü vaì âäü nhåït ( âäü phán cæûc )cuía pha âäüng
+ Hãû säú khuyãúch taïn cuía caïc cháút trong cäüt .
Vç váûy våïi mäüt âiãöu kiãn sàõc kyï xaïc âënh thç chiãöu cao H cuîng
hàòng âënh âäúi våïi mäüt cháút phán têch vaì säú âéa lyï thuyãút cuía
cäüt cuîng âæåüc xaïc âënh.
4.2 Säú âéa lyï thuyãút N:
Säú âéa lyï thuyãút N âæåüc tênh theo cäng thæïc sau :
N = 5,54 ( tR / W0,5)2
Trong âoï : tR : Thåìi gian læu cuía cháút phán têch

.
W0,5 : Âäü räüng taûi âiãøm 1/2 cuía Peak .
Trong thæûc tãú N nàòm trong khoaíng 2500 âãún 5500 laì væìa
âuí .
4.3 Âäü phán giaíi R : ( Resolution )
Âäü phán giaíi laì âaûi læåüng biãøu thë âäü taïch cuía caïc cháút ra khoíi
nhau trãn mäüt âiãöu kiãûn sàõc kyï âaî cho. Âäü phán giaíi cuía 02 Peak
caûnh nhau phaíi âæåüc tênh theo cäng thæïc sau :
R= 2( t’RB - t’RA)/ (wa + wB)
Trong thæûc tãú nãúu caïc Peak cán âäúi ( Gass) thç âäü phán giaíi täúi thiãøu
âãø 02 Peak taïch laì R =1.0 .Trong pheïp âënh læåüng R=1,5 laì phuì håüp
+ Nãúu R nhoí thç caïc Peak chæa taïch hàón ,viãûc tênh toaïn diãûn têch
Peak seî khäng chênh xaïc ,luïc naìy phaíi tçm caïch tàng R theo 03 caïch sau:
* Laìm thay âäøi K’ bàòng caïch thay âäøi læûc ræía giaíi cuía pha âäüng
( Thay âäøi âäü phán cæûc nãúu laì RP - HPLC ,thay âäíi cæåìng âäü ion
nãúu laì IE - HPLC ....)
* Laìm tàng säú âéa lyï thuyãút cuía cäüt bàòng caïch duìng cäüt daìi hån
hoàûc cäüt coï kêch thæåïc nhoí hån .
thuyãút
4.3 Âäü phán giaíi R : ( Resolution )
* Laìm tàng âäü choün loüc  bàòng caïch duìng cäüt khaïc phuì
håüp hån våïi quaï trçnh taïch hoàûc thay âäøi thaình pháön pha âäüng .
+ Nãúu R låïn quaï thç thåìi gian phán têch seî láu,täún nhiãöu pha
âäüng ,âäü nhaûy seî keïm. Âãø khàõc phuûc ta coï thãø thay âäøi hãû
pha âäüng hay duìng chæång trçnh Gradient dung mäi . Tuy nhiãn trong
quaï trçnh chaûy sàõc kyï duìng chæång trçnh dung mäi thç mäüt säú pha
âäüng coï tyí lãû thay âäøi seî keïo theo sæû thay âäøi âæåìng nãön laìm
aính hæåíng ráút låïn âãún thåìi gian læu vaì diãûn têch cuía caïc Peak ta
phán têch .
Trong thæûc tãú nãn haûn chãú sæí duûng chæång trçnh Gradient
dung mäi maì chuí yãúu laì chuïng ta phaíi tçm âæåüc hãû pha âäüng ræía
giaíi phuì håüp, âaïp æïng caïc yãu cáöu trong quaï trçnh phán têch .
4.4 Hãû säú khäng âäúi xæïng T : ( Tailing factor)
Hãû säú khäng âäúi xæïng T cho biãút mæïc âäü khäng âäúi xæïng cuía
Peak trãn sàõc kyï âäö thu âæåüc .
T âæåüc tênh bàòng tyí säú âäü räüng cuía 02 næía Peak taûi âiãøm
1/10 chiãöu cao Peak :
T = a/b
a b
Peak daûng âäïi xæïng hçnh Gauss trãn thæûc tãú khoï âaût âæåüc vç váûy
phaíi quan tám âãún hãû säú khäng âäúi xæïng T,
4.4Hãû säú khäng âäúi xæïng T : ( Tailing factor)
* Khi T  2.5 thç pheïp âënh læåüng âæåüc cháúp nháûn
* Khi T > 2.5 thç âiãøm cuäúi cuía Peak ráút khoï xaïc âënh ,vç
váûy pheïp âënh læåüng cáön phaíi thay âäøi caïc âiãöu kiãûn
sàõc kyï âãø laìm cho Peack cán âäúi hån theo caïc caïch sau :
+ Laìm giaím thãø têch chãút tæïc laì âoaün näúi tæì cäüt âãïn
Detector .
+ Thay âäøi thaình pháön pha âäüng sao cho khaí nàng ræía
giaíi tàng lãn
+ Giaím båït læåüng máùu âæa vaìo cäüt bàòng caïch pha
loaîng máùu hay giaím thãø têch tiãm máùu .
5 Phán loaûi sàõc kyï vaì æïng duûng :
+ Theo cå chãú chia taïch cuía sàõc kyï ,ngæåìi ta phán ra caïc loaûi sau âáy :
Sàõc kyï háúp phuû ( NP - HPLC vaì RP - HPLC); sàõc kyï phán bäú - sàõc
kyï chiãút ( LLC); sàõc kyï trao âäøi ion ( IE - HPLC) ; sàõc kyï ráy phán
tæí - sàõc kyï gel ( IG - HPLC) .Nhæng thæûc tãú hiãn nay chuïng ta hiãûn
chè âang æïng duûng sàõc kyï háúp phuû vaìo phán têch máùu .
5.1 Sàõc kyï háúp phuû :

* Quaï trçnh sàõc kyï dæûa trãn sæû háúp phuû maûnh yãúu khaïc nhau cuía
pha ténh âäúi våïi caïc cháút tan vaì sæû ræía giaíi (phaín háúp phuû) cuaí
pha âäüng âãø keïo cháút tan ra khoíi cäüt .Sæû taïch mäüt häùn håüp phuû
thuäüc vaìo tênh cháút âäüng hoüc cuía cháút háúp phuû .Trong loaûi naìy
coï 02 kiãøu háúp phuû:
+ Sàõc kyï háúp phuû pha thuáûn (NP-HPLC): Pha
ténh phán cæûc ,pha âäüng khäng phán cæûc .
+ Sàõc kyï háúp phuû pha âaío ( RP - HPLC): Pha
ténh khäng phán cæûc pha âäüng phán cæûc .
Loaûi sàõc kyï naìy âæåüc aïp duûng ráút räüng
raîi ,thaình cäng âãø taïch caïc häùn håüp caïc cháút coï
tênh cháút gáön tæång tæû nhau vaì thuäüc loaûi khäng
phán cæûc ,phán cæûc yãúu hay trung bçnh nhæ caïc
Vitamin, caïc thuäúc haû hiãût giaím âau .......
Pháön II : Hệ thống HPLC
I- Maïy HP:C gäöm caïc bäü pháûn cå baín âæåüc toïm tàõt trãn så âồ sau
:
Column
Degasse Pump
Tiêm
mẫu
Detector
Phần II: Hệ thống HPLC
Trong âoï :
1- Bçnh chæïa dung mäi pha âäüüng
2- Bäü pháûn khæí khê
3- Båm cao aïp
4-Bäü pháûn tiãm máùu ( bàòng tay hay Autosample)
5-Cäüt sàõc kyï ( Pha ténh ) ( âãø ngoìai mäi træåìng hay trong bäü âiãöu
nhiãût )
6- Detector ( nháûn tên hiãûu )
7-Hãû thäúng maïy tênh gàõn pháön mãöm nháûn,tên hiãûu vaì xæí lyï
dæî liãûu vaì âiãöu khiãøn hãû thäúng HPLC.
8- In dæî liãûu .
II.1 - Bçnh âæûng dung mäi
- Hiãûn taûi maïy HPLC thæåìng coï 04 âæåìng dung
mäi vaìo âáöu båm cao aïp .Cho pheïp chuïng ta sæí duûng 04
bçnh chæïa dung mäi cuìng 1 láön âãø ræaó giaíi theo tyí lãû
mong muäún vaì täøng tyí lãû dung mäi cuía 04 âæåìng laì 100
%.
Tuy nhiãn theo kinh nghiãûm thç chuïng ta êt khi sæí
duûng 04 âæåìng dung mäi cuìng mäüt luïc maì chuïng ta chi
sæí duûng täúi âa laì 03vaì 02 âæåìng âãø cho hãû pha âäüng
luän âæåüc pha träün âäöng nháút hån,hãû pha âäüüng âån
giaín hån âãø quaï trçnh ræía giaíi äøn âënh .
Hiãûn 04 âæåìng dung mäi phuûc vuû chuí yãúu cho
viãûc ræía giaíi Gradial dung mäi theo thåìi gian vaì cäng taïc
xáy dæûng tiãu chuáøn .
Læu yï : - Táút caí caïc dung mäi duìng
cho HPLC âãöu phaíi laì dung mäi tinh
khiãút vaì coï ghi roî trãn nhaîn laì duìng cho
HPLC Hay dung mäi tinh khiãút phán têch .
- Táút caí caïc hoïa cháút duìng âãø pha
máùu vaì pha hãû âãûm phaíi âæåüc sæí
duûng laì hoïa cháút tinh khiãút phán têch .
Nhàòm muûc âêch traïnh hoíng cäüt sàõc kyï
hay nhiãùu âæåìng nãön,taûo ra caïc Peak
taûp trong quaï trçnh phán têch .
II.2 Bäü khæí khê Degasse :
Muûc âêch cuía bäü khæí khê nhàòm loaûi træì caïc boüt
nhoí coìn soït laûi trong dung mäi pha âäüng .
Nãïu nhæ trong quaï trçnh phán têch maì dung mäi pha
âäüng coìn soït caïc boüt khê thç mäüt säú hiãûn tæåüng sau âáy
seî saíy ra - Tyí lãû pha âäüng cuía caïc âæåìng dung mäi
láúy khäng âuïng seî laìm cho thåìi gian læu cuía Peak thay âäøi
.
- Trong træåìng håüp boüt quaï nhiãöu Bäü khæí khê
khäng thãø loaûi træì hãút âæåüc thç coï thãø Pump seî khäng
huït âæåüc dung mäi (Bë e) khi âoï aïp suáút khäng lãn vaì
maïy sàõc kyï seî ngæìng hoaût âäüng .
Trong báút cæï træåìng håüp naìo nãu trãn cuîng cho kãút quaí
phán têch sai .
II.3- Pump Cao aïp :
- Muûc âêch âãø båm pha âäüng vaìo cäüt thæûc hiãûn quaï
trçnh chia taïch sàõc kyï .Pump phaíi taûo âæåüc aïp suáút
cao khoaíng 3000-6000 PSI hoàûc 250 at âãún - 500 at ( 1at
=0.98 Bar) vaì pump phaíi taûo doìng liãn tuûc .Læu læåüng
båm tæì 0.1 âãún 9.999 ml/phuït .(hiãûn nay âaî coï nhiãöu
loaûi Pump coï aïp suáút ráút cao lãn âãún 1200 bar)
- Maïy sàõc kyï loíng cuía chuïng ta hiãûn nay thæåìng coï
aïp suáút täïi âa 412 Bar. Täúc âäü doìng 0.1-9.999 ml/phuït .
- Täúc âäü båm laì hàòng âënh theo thäng säú âaî âæåüc caìi
âàût . Hiãûn taûi båm coï 2 Pistone âãø thay phiãn nhau âáøy
dung mäi liãn tuûc .
II.4 Bäü pháûn tiãm máùu ( injection):
ÂãØ âæa máùu vaìo cäüt phán têch theo phæång phaïp khäng
ngæìng doìng chaíy . Våïi dung têch cuía loop laì 5 - 100l .
Coï 02 caïch láúy máùu vaìo trong cäüt : Bàòng tiãm máùu
thuí cäng( tiãm bàòng tay ) vaì tiãm máùu tæû
âäüng( Autosample) .
II.5 Cäüt sàõc kyï :
Cäüt chæïa pha ténh âæåüc coi laì traïi tim cuía hãû thäúng
sàõc kyï loíng hiãûu nàng cao .
- Cäüt pha ténh thäng thæåìng laìm bàòng theïp khäng rè
,chiãöu daìi cäüt khoaíng 10 -30cm ,âæåìng kênh trong 1-
10mm ,haût cháút nhäöi cåî  = 5-10 m.(ngoaìi ra coìn coï
mäüt säú træåìng håüp âàûc biãût vãö kêch thæåïc vaì kêch
cåî haût....)
-Våïi cháút nhäöi cäüt cåî  = 1.8 -5 m coï thãø duìng cäüt
ngàõn ( 3-10 cm ) vaì nhoí ( âæåìng kênh trong 1-4.6 mm)loaûi
cäüt nayì coï hiãûu nàng taïch cao.
- Cháút nhäöi cäüt tuìy theo loüai cäüt vaì kiãøu sàõc kyï ( trong
caïc dæåüc âiãøn USP 23 ,24 coï tiãu chuáøn hoïa caïc loüai cäüt )
- Thäng thæåìng cháút nhäöi cäüt laì Silicagel (pha thuáûn)
hoàûc laì Silicagel âaî âæåüc Silan hoïa hoàûc âæåüc bao mäüt
låïp moíng hæîu cå ( pha âaío ) ,ngoaìi ra ngæåìi ta coìng duìng
caïc loaûi haût khaïc nhæ :Nhäm Oxit,Polyme xäúp ,cháút trao
âäøi ion.
* Âäúi våïi mäüt säú phæång phaïp phán têch âoìi hoíi phaíi coï
nhiãût âäü cao hoàûc tháúp hån nhiãût âäü phoìng thç cäüt âæåüc
âàût trong bäü pháûn âiãöu nhiãût (Oven column)
II.6 - Detector :
- Laì bäü pháûn Phaït hiãûn caïc cháút khi chuïng ra khoíi cäüt
vaì cho caïc tên hiãûu ghi trãn sàc kyï âäö âãø coï thãø âënh
tênh vaì âënh læåüng .Tuìy theo tênh cháút cuía caïc cháút
cáön phán têch maì ngæåìi ta sæí duûng loaüi Detector thêch
håüp vaì phaíi thoaí maîn âiãöu kiãûn trong mäüt vuìng näöng
âäü nháút âënh cuía cháút phán têch
A=k.C
Trong : A laì tên hiãûu âo âæåüc
C Näöng âäü cháút phán têch
k laì hàòng säú thæûc nghiãûm cuía Detector âaî choün
Tên hiãûu naìy coï thãø laì : âäü háúp thuû quang ; Cæåìng âäü
phaït xaû ,cæåìng âäü âiãûn thãú ,âäü dáùn âiãûn ;âäü dáùn
nhiãût ;chiãút suáút ..
Trãn cå såí âoï ngæåìi ta chãú taûo caïc loüai Detector sau :
+ Detector quang phäø tæí ngoaûi 200 - 380 nm âãø phaït hiãûn
UV
+ Detector quang phäø tæí ngoaûi khaí kiãún ( UV - VIS): 190
- 900 nm âãø phaït hiãûn caïc cháút háúp thuû quang .âáy laì
loaûi thäng duûng nháút
+Detector huyình quang âãí phaït hiãûn caïc cháút hæîu cå phaït
huyình quang tæû nhiãn cuîng nhæ caïc dáùn cháút coï huyình
quang .Laì loaûi Detector coï âäü choün loüc cao nháút .
+Loaûi hiãûn âaûi âaûi hån coï Detector Diod Array ,ELSD
(Detector taïn xaû bay håi ) caïc Detector naìy coï khaí nàng
queït chäöng phäø âãø âënh tênh caïc cháút theo âäü háúp thu
cæûc âaûi cuía caïc cháút .
- Ngoaìi ra coìn coï mäüt säú loaûi Detector khaïc laì :
+ Detector âiãûn hoïa : Âo doìng ,cæûc phäø ,âäü
dáùn ,âiãûn læåüng ..)
+ DetectorChiãút suáút vi sai : Detector khuïc xaû
( thäng thæåìng duìng cho âo caïc cháút âæåìng )
+ Detector âo âäü dáùn nhiãût ,hiãûu æïng nhiãût ..
II.6 - Bäü pháûn ghi tên hiãûu
- Âãø ghi tên hiãûu phaït hiãûn do Detector truyãön sang .
+ Trong caïc maïy thãú hãû cuî thç sæí duûng maïy ghi
âån giaín coï thãø veî sàõc kyï âäö,thåìi gian læu,diãûn têch
cuía Peak ,chiãöu cao ..
+ Caïc maïy thãú hãû måïi âãöu duìng pháön mãöm
chaûy trãn maïy tênh noï coï thãø læu táút caí caïc thäng
säú,phäø âäö vaì caïc thäng säú cuía Peak nhæ tênh âäúi
xæïng,hãû säú phán giaíi .... trong quaï trçnh phán têch âäöng
thåìi xæí lyï ,tênh toaïn caïc thäng säú theo yãu cáöu cuía
ngæåìi sæí duûng nhæ : Näöng âäü,RSD, ...
II.7 In kãút quaí :
+ Sau khi âaî phán têch xong caïc máùu ta seî in kãút
quaí do pháön mãöm tênh toaïn ra giáúy âãø hoaìn thiãûn häö
så .
Pháön III : CHOÜN ÂIÃÖU KIÃÛN SÀÕC
KYÏ
Muäún coï mäüt kãút quaí täút nháút ta phaíi tçm âæåüc caïc
âiãöu kiãûn sàõc kyï täút nháút cho mäüt häùn håüp máùu ;
Caïc âiãöu kiãûn âoï bao gäöm:
Pha ténh : - Loaûi pha ténh

- Kêch thæåïc cäüt
Pha âäüng : Thaình pháön vaì tyí lãû ,pH , täúc âäü doìng,
nhiãût âäü ... Nãúu laì chæång trçnh ræía giaíi Isocratic
Thaình pháön vaì tyí lãû ,pH , täúc âäü doìng,
nhiãût âäü vaì chæång trçnh dung mäi ... Nãúu laì chæång
trçnh ræía giaíi Gradient.
Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký
Hãû thäúng trang bë:

- Loaûi Detector:
- Van tiãm máùu,thãø têch tiãm
- Hãû âæåìng dáùn
Caïc yãúu täú khaïc : nhiãût âäü ,âäü nhaûy cuía detector
bæåïc soïng phán têch
III.1 : Læûa choün pha ténh

- Dæûa vaìo caïc taìi liãûu ,Dæåüc âiãøn ,thaình pháön
vaì tênh cháút cuía caïc cháút coï trong máùu phán têch .....ta
læûa choün cäüt sàõc kyï phuì håüp coï thãø laì cäüt pha thuáûn,
cäüt pha âaío hay caïc loaûi cäüt khaïc nhau ...
Chuïng ta thäng thæåìng duìng 02 loaûi cäüt pha thuáûn
( NP) vaì cäüt pha âaío ( RP)
Ngoaìi ra ta coï thãø duìng mäüt säú loaûi cäüt khaïc nhæ
cäüt CN ,cäüt NH2 ,....
Cäüt pha thuáûn ( NP): Silicagel trung tênh
Pha ténh :Cäüt naìy laì loaûi cäüt duìng âãø taïch caïc cháút
khäng phán cæûc hay êt phán cæûc .Trãn bãö màût hoaût âäüng
cuía noï coï chæïa caïc nhoïm OH phán cæûc æa næåïc .
Vê duû cäüt Lichrosorb Si 40,Si 60... Cáúu taûo cäüt nhæ
sau :
OH OH OH
- O - Si - O - Si - O - Si - O -
OH OH OH
Pha âäüng : duìng cho loaüi naìy laì caïc dung mäi khäng phán
cæûc hay êt phán cæûc nhæ :
III.1 : Læûa choün pha ténh

Cäüt pha âaío ( RP) : ( Silicagel âaî Alkyl hoïa )
Duìng âãø taïch caïc cháút khäng phán cæûc ,êt phán cæûc ,caïc
cháút phán cæûc coï thãø taûo càûp Ion .Trãn bãö màût hoaût
âäüng caïc nhoïm OH âaî bë Alkyl hoïa tæïc laì thay thãú nguyãn
tæí H bàòng caïc maûch Carbon thàóng ( C8 hay C18 tæång
âæång RP 8 hay RP 18) hay caïc maûch Carbon voìng( Phenyl-
tæång âæång cäüt Phenyl )
vç thãú noï êt phán cæûc hay phán cæûc ráút êt .
Vê duû nhæ cäüt Lichrosor -Lichrospher RP 8 ...... ODS , Cäüt
Nucleosil C18........
Pha Âäüng : Pha âäüng duìng trong loaûi naìy laì caïc dung
mäi coï phán cæûc nhæ :Methanol ,Acetonitril,,næåïc hay caïc
loaûi dung dëch âãûm ,häùn håüp cuía caïc dung mäi-âãûm .
Sæû taïch cuía cháút nhäöi loaûi cäüt naìy coï âäü làûp
laûi cao vaì noï âæåüc æïng duûng chuí yãúu trong phán têch
Dæåüc pháøm . Hiãûn nay chuïng ta chè sæí duûng loaûi naìy laì
chuí yãúu .
Hiãûn nay pha ténh trãn nãön Silicagel âaî coï haìng tràm
cháút khaïc nhau tuìy thuäüc vaìo nhoïm thãú cuía nguyãn tæí
H ,ngoaìi ra coìn coï caïc loüai pha ténh trãn nãön Oxid
Nhäm,trãn nãön cháút hæîu cå cao phán tæí,trãn nãön maûch caïc
bon......
III.2 : Læûa choün pha âäüng

- Dæûa vaìo caïc taìi liãûu ,Dæåüc âiãøn ,thaình pháön
vaì tênh cháút cuía caïc cháút coï trong máùu phán têch .....ta
læûa choün pha âäüng phuì håüp âãø cho quaï trçnh ræía giaíi
taïch hoaìn toaìn caïc cháút coï trong máùu âaïp æïng âáöy âuí
caïc tiãu chuáøn cuía peak âaî trçnh baìy âäöng thåìi phaíi coï
thåìi gian phán tiïch phuì håüp nhàòm tiãút kiãûm âæåüc dung
mäi,hoïa cháút,thåìi gian phán têch máùu, giaím thiãøu sæû hoaût
âäüng cuía thiãút bë .
- Pha âäüng coï thãø laìm thay âäøi :
+ Âäü choün loüc 
+ Thåìi gian læu
- Pha âäüng coï thãø laìm thay âäøi :
+ Hiãûu nàng taïch cuía cäüt
+ Âäü phán giaíi
+ Tênh âäúi xæïng cuía Peak
Do âoï ,Trong mäüt pha ténh âaî choün nãúu ta choün
âæåüc pha âäüng coï thaình pháön phuì håüp thç ta seî coï hiãûu
suáút taïch sàõc kyï täút nháút âäúi våïi häùn håüp caïc cháút
cáön phán têch . Chênh vç váûy pha âäüng cáön coï cáöu yãu
cáöu sau :
+ Pha âäüng phaíi trå våïi pha ténh âaî coï .Khäng âæåüc
laìm cho pha ténh bë biãún âäøi hoïa hoüc . ( vd giaï trë pH : 2.5<
pH <8.5)
+Pha âäüng phaíi hoìa tan âæåüc caïc cháút phán têch thç
måïi ræía giaíi âæåüc chuïng.( âàûc biãût phaíi chuï yï khi thay
âäøi pha âäüng phaíi ræía cäüt bàòng dung mäi phuì håüp âãø
khäng laìm tuía caïc cháút coï trong cäüt ,hay pha âäüng coï sàôn
trong cäüt vd : âãûm phosphat ræaí ngay bàòng ACN hay MeOH
seî bë kãút tuía trãn column)
+ Pha âäüng phaíi bãön væîng theo thåìi gian : caìng bãön
láu caìng täút nhæng êt nháút laì pha âäüng khäng bë phán huíy
trong suäút thåìi gian phán têch máùu ).
+ Phaíi coï âäü tinh khiãút cao : dung mäi cho HPLC,
hoaï cháút tinh khiãút phán têch .
+Phaíi nhanh âaût cán bàòng trong quaï trçnh sàõc kyï
+ Phaíi phuì håüp våïi loaûi Detector : vd UV - VIS thç
dung mäi khäng âæåüc háúp thuû quang (vd acid acetic åí bæåïc song tháúp < 220 nm) .
Detector huyình quang thç dung mäi khäng âæåüc phaït quang.
+ Phaíi kinh tãú ,khäng quaï hiãúm vaì âàõt
Trong hãû sàõc kyï háúp phuû pha âaío ( RP - HPLC) pha âäüng
laì dung mäi phán cæûc laì : Næåïc,ACN,MeOH ,acid hay Base
hæîu cå vaì mäüt vaìi Amin hay Aminoacid ..
+ Do sæû thãm næåïc vaìo dung mäi hæîu cå taûo thaình
mäüt pha âäüng phán cæûc hån cháút hæîu cå nguyãn mäüt mçnh
noï .Vd thãm næåïc vaìo ACN hay MeOH .. Seî taûo âæåüc pha
âäüng phán cæûc hån noï . Táút nhiãn âäü phán cæûc phuû
thuäüc vaìo tyí lãû næåïc âæåüc thãm vaìo.
+ Ngoìai caïc dung mäi chênh thç trong thaình pháön pha
âäüng trong ráút nhiãöu træåìng håüp taïch RP- HPLC coìn coï
thãm häùn håüp âãûm pH âãø äøn âënh pH.Cháút taûo
phæïc,taûo càûp ion âãø taûo ra sæû ræía giaíi täút nháút .
+ Khi choün dung mäi ta thæåìng dæûa vaìo læûc ræía
raíi E cuía dung mäi theo baíng sau:
BAÍNG ÂÄÜ PHÁN CÆÛC CUÍA MÄÜT SÄÚ DUNG
MÄI
01- n Hexan 0.1 04 - Methanol 5.11
02-Tetra Chloro Carbon 1.6 05- Actenitril 5.8
03- Toluen 2.4 06- Næåïc cáút
10.20
- Viãûc læûa choün âiãöu kiãûn sàõc kyï laì cäng viãûc
hãút sæïc cáön thiãút trong quaï trçnh xáy dæûng chæång trçnh
sàõc kyï . Chè khi læûa choün âiãöu kiãn sàõc kyï täút,phuì håüp
thç chuïng ta måïi coï thãø âënh tênh,âënh læåüng âæåüc caïc
loüai thuäúc âa thaình pháön mäüt caïch nhanh choïng vaì hiãûu
quaí cao .
- Táút nhiãn pháön lyï thuyãút noïi ráút nhiãöu vãö caïc
phæång phaïp choün âiãöu kiãûn sàõc kyï tuy nhiãn âãø choün
âæåüc chæång trçnh sàõc kyï täút âäöi hoíi phaíi coï thåìi gian
,taìi liãûu vaì mäüt pháön kinh nghiãûm cuía nhæîng ngæåìi laìm
sàõc kyï
Phần IV : Tiến hành sắc ký
- IV -1 Chuáøn bë duûng cuû vaì maïy moïc :
+ Maïy HPLC phaíi âæåüc kiãøm chæïng theo âënh kyì
âãø baío âaím maïy hoüat âäüng täút cho kãút quaí phán têch coï
âäü âuïng,âäü làûp laûi,tuyãún tênh,tyí lãû dung mäi ,täúc âä
doìng,nàng læåüng âeìn ü ....âuïng theo yãu cáöu thäng säú cuía
maïy do nhaì saín xuáút âàût ra .
+ Âàûc biãût cäüt sàõc kyï phaíi âæåüc kiãøm tra vãö säú
âéa lyï thuyãút theo âënh kyì hay khi coï nghi ngåì vãö khaí nàng
taïch ,vaì ræía âuïng qui âënh sau mäùi láön chaûy sàõc kyï :
vd : Våïi sàõc kyï pha thuáûn NP-HPLC : ræía bàòng
MeOH Khäng ræàó bàòng Næåïc
Våïi sàõc kyï pha âaío RP-HPLC : Khi chaûy pha
Phần IV : Tiến hành sắc ký
-Tyí lãû ACN hay MeOH : Næåïc ( 50 : 50 ) cho saûch
hãút caïc cháút coìn âoüng laûi trong cäüt âäöng thåìi âãø baío
vãû cäüt khäng bë mäúc khi âãø láu . Tuyãût âäúi tçnh traûng chè
ræía bàòng næåïc 100% sau âoú âãø cäüt mäüt thåìi gian khäng
sæí duûng chàõc chàõn cäüt seî bë mäúc ,hoíng khäng thãø duìng
âæåüc . Xin læu yï nãúu ræàó cäüt khäng täút thç kãút quaí chaûy
sàõc kyï seî khäng thãø âaïp æïng âæåüc caïc yãu cáöu phán
têch .
4.2 - Chuáøn bë dung mäi pha âäüng :
Caïc dung mäi duìng cho sàõc kyï laì loaûi tinh khiãút
HPLC
Caïc hoïa cháút duìng phaíi laì loaûûi PA
Pha dung mäi âuïng ,chênh xaïc theo âuïng tyí lãû âaî
Phần VI : Kỹ Thuật tiến hành sắc ký
-4.3 Chuáøn bë máùu âo HPLC :
+ Máùu Thæí : xæí lyï máùu thæí theo âuïng chuyãn
luáûn ,qui trçnh theo nguyãn tàõc :
- Dung mäi hoìa tan hoaût cháút phaíi hoìa tan trong pha
âäüng ,trong nhiãöu træåìng håüp duìng dung mäi pha âäüng âãø
hoìa tan máùu - Phaíi loaûi boí caïc cháút khäng tan trong pha
âäüng hoàûc khäng ræàó giaíi âæåüc bàòng caïch loüc hay
chiãút ..
-Phaíi loüc vaì ly tám ,loüc máùu qua maìng loüc 0.2 -
0.45 m
- Näöng âäü máùu åí mæïc væìa phaíi,khäng væåüt quaï
khaí nàng taïch cuía cäüt.Coï thãø gáy ra ngheîn cäüt.
-Máùu chuáøn :
Pha dung dëch chuáøn coï thaình pháön giäúng nhæ máùu
thæí trong cuìng dung mäi ,riãng vãö näöng âäü caïc thaình
pháön giäïng nhæ máùu thæí laì täút nháút ,ngoaìi ra coï thãø
duìng näöng âäü khaïc nhæng phaíi nàòm trong khoaíng tuyãún
tênh âaî khaío saït cuía tæìng thaình pháön.
4.4 Caïch âo HPLC :
Mäùi maïy coï caïch váûn haình khaïc nhau tuìy thuäcü
vaìo haîng saín xuáút ,pháön mãön sàõc kyï . Tuy nhiãn caïch
váûn haình luän phaíi theo nguyãn tàïc sau :
+ chaûy maïy våïi dung mäi pha âäüng âãø âuoíi hãút
boüt khê coï trong hãû thäúng äúng dáùn træåïc khi cho vaìo
+ Âàût âáöy âuí caïc âiãöu kiãûn sàõc kyï

nhæ :
* Cáúu hçnh maïy
* Tyí lãû caïc dung mäi pha âäüng
* Bæåïc soïng,thaình pháön máùu, caïc
thäng säú cuía quaï trçnh phán têch yãu cáöu .
Phần V
Hệ thống sắc ký Merck - Hitachi

và phần mềm điều khiển
D7000 – Multi HSM manager
(Sẽ bổ sung sau)
Ngæåìi viãút
KS Phan Hiãön Læång
Mail : luonghoak8@ymail.com

Ly Thuyet Sac Ky Long Hieu Nang Cao (HPLC)

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Ly Thuyet Sac Ky Long Hieu Nang Cao (HPLC)

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Pháön I : Cå såí lyï

Cháút phán têch A +B+C

L1 : RP 18 Kêch thæåïc haût tæång æïng tæì 5 - 10 m

tr2 : Thåìi gian læu cháút B

 = K’B / K’A Våïi âiãöu kiãûn K’B > K’A

= 1.02 = 1.16 = 1.20

Trong âoï : tR : Thåìi gian læu cuía cháút phán têch

5.1 Sàõc kyï háúp phuû :

Pha ténh : - Loaûi pha ténh

Hãû thäúng trang bë:

III.1 : Læûa choün pha ténh

III.1 : Læûa choün pha ténh

III.2 : Læûa choün pha âäüng

+ Âàût âáöy âuí caïc âiãöu kiãûn sàõc kyï

Hệ thống sắc ký Merck - Hitachi

You might also like