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Terminar de preparar la muestra para RT-PCR

No mesclar los reactivos de


los lotes diferentes del kit

No utilizar un kit despus de que ha ex


Es importante realizar un eficiente
rompimiento y homogenizacin del
material de muestra ya que es esencial
para extraer el RNA intracelular de tejido

El buffer de lavado 1 y el de
lisado de tejido botella 8
contienen sales de
guanidina las cuales son
irritantes

Recordar que todas las


muestras son
potencialmente
infecciosas
No mesclar la solucin de
lisado de tejido con
hipoclorito de sodio porque se
producen altas cantidades de
gas toxico

192 aislamientos a partir de tejido fresco congelado


o
96 aislamientos a partir de tejido fijado en formalina o
parafina

Esta metodologa permite la extraccin de ARN y total a partir


de diferentes tipos de muestras como, sangre completa,
suero, clulas sanguneas, cultivos celulares, bacterias,
hongos etc.; este procedimiento se realiza con alta calidad en
la obtencin del ARN de las muestras que lo que da
confiabilidad del mtodo y posteriormente se utilizaran por la
tcnica de PCR o bien se conservaran para un posterior analis.

El

mtodo se basa en
una previa
homogenizacin del tejido tambin utilizando
esferas magnticas apoyndose en un
mtodo apropiado de pre- extraccin asiendo
uso del buffer de lisado de tejido el cual
contiene sales de guanidina, con la finalidad
de obtener ARN de alta pureza y calidad.

Montaje de prueba es de 15 minutos


32

muestras
de
tejido
aproximadamente de 84 min

congelado

es

122 min para extraccin de 32 muestras de tejido

embebido en formalina usando el protocolo de


parafina con tejido
No se considera el tiempo requerido para pasos de
pre- extraccin

Procedimiento

Material de Muestra

RNA
Tejido fresco
congelado

1 a 10 mg de :
Tejido fresco-congelado
Tejido descongelado
estable

RNA
Tejido con parafina

5 m a 20 m
Secciones de tejido
preparado don
formalina, embebido en
parafina.

Adicionar 80 l de buffer
lisador de tejido
(contenedor 8)
transferir 110 mg de
tejido al tubo

Centrifugar 2 min a 13,000 x g

Transferir 350 l de
sobrenadante de lisado dentro
de el cartucho de muestra

Eleccin de velocidad y tiempo


Material de
muestra
Hgado/Rion
Bazo/tejido de
tumor
Cola/odo/piel

Velocidad

Tiempo

6500 rpm
6500 rpm

50s
2x50s

6500 rpm

2-3 x50s

Incubar las muestras


30 min a t.a.

Colocar los reactivos en el orden


que se indica para el protocolo de
tejido congelado

350 l de buffer lisador de


tejido en el rotor la
homogenizacin del tejido se
logra de 5 a 90 seg en la
presencia de este buffer

Centrifugar 2 min a 13,000 x g

Transferir 350 l de
sobrenadante de lisado dentro
de el cartucho de muestra

Incubar las muestras


30 min a t.a.

Colocar los reactivos en el orden


que se indica para el protocolo de
tejido congelado

Moler exhaustivamente 110 mg de tejido en


nitrgeno liquido

Adicionar 350 l del buffer


lisador (botella 8) a la
muestra , para la
homogenizacin pasar la
muestra con una jeringa con
aguja de 0.6 mm varias veces.

Transferir el polvo congelado


introducirlo en un recipiente
apropiado para centrifugacin

Todo el nitrgeno liquido


remanente se evapora pero
hay que tener cuidado de no
descongelar el tejido

Centrifugar 2 min a 13,000 x g


Incubar las muestras
30 min a t.a.
Transferir 350 l de
sobrenadante de lisado dentro
de el cartucho de muestra

Colocar los reactivos en el orden


que se indica para el protocolo de
tejido congelado

Un previa incubacin con proteinasa K


Las muestras lisadas son transferidas a el MagNa pure lc

instrument . este paso mejora la lisis de la clula y la


digestin de protenas .
La

unin del ARN a la superficie de las partculas


magnticas de vidrio
(por sus siglas en ingles MGPs)
adicionadas bajo condiciones de sal caotropica. Las
sustancia limitantes son removidas por varios pasos de
lavado.

Protocolo
1. Encender la computadora
2. Seleccionar el protocolo adecuado
Elegir entre
fres-frozen o unfrozen
satbilized tissue samples formalin-fixed,
paraffin-embedded tissue sections

3. Seguir instrucciones del software y especificar


el numero de muestras
4. Se llenan los tubos con los reactivos fuera del
aparato con el requerimiento de los reactivos
que se enlistan en la pantalla
5. Usar la informacin proporcionada para colocar
todo el material y reactivos necesarios para
realizar el corrimiento por muestra

6. Transferir el cartucho de muestra que contiene


los lisados .se confirman el correcto lugar de
todos los dispositivos plsticos y reactivos
asiendo un click con el mouse en el cuadro de
texto
7. Dar click en ok y el aparato comenzara con la
extraccin de ARN de las muestras

1. Dispensar todos loa reactivos dentro del cartucho de proceso


2. Dispensar el buffer de elusin dentro de el cartucho de
elusin bloque de calefaccin
3. Adicionar 350 l de binding buffer y 100l de proteinasa K
para el lisado, mezclar
4. Transferir 800 l de la mezcla de lisado en 200l de
suspensin de MGP, mezcla incuba y separa las partculas
5. Transferir las cuentas dentro de 290 l de Dnase solution,

incubar 10 min, separar la partculas

6. Transferir las cuentas a 850 l de buffer de lavado I, mezclar,

separar las partculas

7. Transferir las cuentas a 450l

de buffer de lavado II,

mezclar, separar partculas


8. Transferir las cuentas en 450l de buffer de lavado mezclar y
separar las partculas
9. Transferir las cuentas a 450 l e buffer de
lavado mezclar y separar las partculas
10. Transferir las partculas a 100l de buffer de
elusin mezclar incubar , eluir RNA y descartar
la MGPs
11. Transferir el eluido al cartucho de almacenaje

1. Dispensar todos loa reactivos dentro del cartucho de proceso


2. Dispensar el buffer de elusin dentro de el cartucho de
elusin bloque de calefaccin
3. Adicionar 350 l de binding buffer, mezclar
4. Transferir 700 l de la mezcla de lisado en 200l de
suspensin de MGP, mezcla incuba y separa las partculas
5. Transferir las cuentas dentro de 290 l de Dnase solution,

incubar 10 min, separar la partculas


6. Transferir las cuentas a 850 l de buffer de lavado I, mezclar,
separar las partculas
7. Transferir las cuentas a 450l de buffer de lavado II,
mezclar, separar partculas
8. Transferir las cuentas en 290l de solucin de proteinasa
mezclar y separar las partculas
9. Transferir las cuentas a 850 l e buffer I de lavado
mezclar y separar las partculas
10. Transferir las partculas a 450l de buffer de lavado II,
mezclar incubar, separar las partculas
11. Transferir las partculas a 450l de buffer de lavado II,
mezclar incubar, separar las partculas
12. Transferir las partculas a 100l de buffer de elusin,
mezclar, incubar, eluir el RNA descartar las MGPs
13. Transferir la elusin cartucho de almacenaje

1
Colocar la
muestra tubo

8
El ARN purificado es eludido a 70C desde
las MGPs estas son retenidas en el pico de la
reaccin y son descartadas.

6
Las MGPs ligadas con
RNA son lavadas
repetidamente con
buffer de lavado para
eliminar las sustancias
no ligadas como
nucleasas, membranas
celulares inhibidores de
PCR tales como la
heparina o hemoglobina
la concentracin de sal

Se aade el
buffer de lisis
resultando en el
lisado de la
clula y la
liberacin del
ARN en este
paso las RNases
son
desnaturalizadas

3
El ARN se pega a la superficie de
la silica de las adicionadas MGPs
debido a las condiciones de la
salinas, isopropanol y a la alta
carga inica del buffer de lisis
obligatorio.

7
De nuevo las MGPs con
ARN adherido son
magnticamente
separados con un
lavado de buffer
conteniendo derivados
residuales de la muestra

4
El genoma del DNA es
removido por incubacin
con DNase I

5
El ARN se recupera de las partculas
por la adicin de isopropanol. MGPs
con el ARN ligado son separados
magnticamente por los residuos de
la muestra lisada.

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