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El buffer de lavado 1 y el de
lisado de tejido botella 8
contienen sales de
guanidina las cuales son
irritantes
El
mtodo se basa en
una previa
homogenizacin del tejido tambin utilizando
esferas magnticas apoyndose en un
mtodo apropiado de pre- extraccin asiendo
uso del buffer de lisado de tejido el cual
contiene sales de guanidina, con la finalidad
de obtener ARN de alta pureza y calidad.
muestras
de
tejido
aproximadamente de 84 min
congelado
es
Procedimiento
Material de Muestra
RNA
Tejido fresco
congelado
1 a 10 mg de :
Tejido fresco-congelado
Tejido descongelado
estable
RNA
Tejido con parafina
5 m a 20 m
Secciones de tejido
preparado don
formalina, embebido en
parafina.
Adicionar 80 l de buffer
lisador de tejido
(contenedor 8)
transferir 110 mg de
tejido al tubo
Transferir 350 l de
sobrenadante de lisado dentro
de el cartucho de muestra
Velocidad
Tiempo
6500 rpm
6500 rpm
50s
2x50s
6500 rpm
2-3 x50s
Transferir 350 l de
sobrenadante de lisado dentro
de el cartucho de muestra
Protocolo
1. Encender la computadora
2. Seleccionar el protocolo adecuado
Elegir entre
fres-frozen o unfrozen
satbilized tissue samples formalin-fixed,
paraffin-embedded tissue sections
1
Colocar la
muestra tubo
8
El ARN purificado es eludido a 70C desde
las MGPs estas son retenidas en el pico de la
reaccin y son descartadas.
6
Las MGPs ligadas con
RNA son lavadas
repetidamente con
buffer de lavado para
eliminar las sustancias
no ligadas como
nucleasas, membranas
celulares inhibidores de
PCR tales como la
heparina o hemoglobina
la concentracin de sal
Se aade el
buffer de lisis
resultando en el
lisado de la
clula y la
liberacin del
ARN en este
paso las RNases
son
desnaturalizadas
3
El ARN se pega a la superficie de
la silica de las adicionadas MGPs
debido a las condiciones de la
salinas, isopropanol y a la alta
carga inica del buffer de lisis
obligatorio.
7
De nuevo las MGPs con
ARN adherido son
magnticamente
separados con un
lavado de buffer
conteniendo derivados
residuales de la muestra
4
El genoma del DNA es
removido por incubacin
con DNase I
5
El ARN se recupera de las partculas
por la adicin de isopropanol. MGPs
con el ARN ligado son separados
magnticamente por los residuos de
la muestra lisada.