SECUENCIACIN DEL ADN

QU ES Y EN QUE CONSISTE LA DE
SECUENCIACIN DE ADN?

Es una tcnica en la que se hace un anlisis ms

detallado de la estructura del ADN y consiste en
un conjunto de tcnicas y mtodos bioqumicos
que nos permiten averiguar la secuencia de los
nucletidos (A, C, G, T) en el ADN.

ANTECEDENTES
A finales de la dcada de 1970 se desarrollaron
dos mtodos que permitan la secuenciacin de
una molcula de ADN de una manera sencilla y
rpida. Al principio, la idea consista en imitar
los clsicos mtodos de secuenciacin de
protenas, donde las molculas eran
fragmentadas y analizada su composicin en
funcin de sus caractersticas fisicoqumicas,
deduciendo asi su secuencia a partir de
fragmentos solapantes.
En 1977, los grupos de A. Maxam y W. Gilbert
por un lado, y de F. Sanger por otro desarrollaron
sendos mtodos de secuenciacin especficos para
el ADN.

El mtodo de degradacin qumica por Maxam y

Gilbert, en 1977
En 1977 Frederick Sanger (galardonado con el
Nobel de Qumica en 1980, con Walter Gilbert y
Paul Berg) desarrolla y publica las tcnicas de
secuenciacin del ADN, mediante el que pasara
a conocerse como mtodo de los terminadores de
cadena o dedeoxi (didesoxi).
En 1986 este mtodo es mejorado por el bilogo
molecular estadounidense Leroy Hood con la
automatizacin de las etapas de secuenciacin del
ADN y el anlisis computarizado de los geles
obtenidos, incorporando ordenadores y laser en
este proceso

MTODO ENZIMTICO DE SANGER

Conocido como mtodo de los terminadores de

cadena o dideoxi, se basa en el uso de
dideoxinucletidos (ddNTP)que se diferencian de
los deoxinucleotidos (dNTP) en que carecen del
grupo OH en el carbono 3 de la ribosa.

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de

un segmento de ADN por este mtodo, se necesitan
los siguientes compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea

secuenciar.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la
ADN Polimerasa I del bacteriofago T4.
Un cebador o "primer". El "primer" utilizado suele
marcarse radiactivamente.
Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP
y dTTP).
Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP,
ddTTP, ddCTP y ddGTP).

EL MTODO DE DEGRADACIN
QUMICA (MAXAM AND GILBERT,
1977).

En este mtodo, un fragmento de ADN de cadena

doble o sencilla se marca en los extremos 5 o 3
de una o ambas hebras con 32 P (fosforo
radioactivo). Despus, la muestra de ADN se
divide en cuatro alcuotas y se fragmenta en
cuatro
reacciones
qumicas
distintas.
Posteriormente, los fragmentos de ADN
generados
pueden
ser
separados
por
electroforesis en cuatro carriles distintos con
base en su tamao. Conociendo el nucletido en
el que se realizaron los cortes, se puede inferir la
secuencia de la molcula original

Las reacciones qumicas

utilizan para
fragmentar la molcula
ADN son::

1. Corte de las purinas.

2. Corte de adeninas.
3. Corte de pirimidinas.
4. Corte de citosina.

que se
de

MTODOS CONTEMPORNEOS EN
LA SECUENCIACIN
Algunos de los avances ms importantes que han permitido el desarrollo
de mtodos automatizados para la secuenciacin de ADN (usando el
mtodo de Sanger).
Avance

Descripcion

Reaccin en cadena de la Tcnica que permite la amplificacin

Polimerasa (PCR)
exponencial de un fragmento de ADN
Polimerasa Taq
Polimerasa termoestable que puede
utilizarse en el PCR
Marcaje del ADN
El marcaje y el tipo de deteccin utilizado
para identificar los fragmentos de ADN
sintetizados
Secuenciadores
Desarrollo de mquinas automatizadas
automatizados
con la capacidad determinar la secuencia
de miles de pares de bases por da

SECUENCIACIN AUTOMATIZADA
A finales de la dcada de los 80, con la
automatizacin del ADN y el anlisis
computarizado de los geles obtenidos, graias a la
incorporacin de ordenadores y laser en el
proceso, apareci la secuenciacin automtica.
Realmente se trata de una modificacin del
mtodo de Sanger. Dicha modificacin radica en
el hecho de que aqu el marcaje no es radioactivo
sino por fluorecencia , y en que los productos de
la reaccin se detectan directamente durante la
electroforesis gracias a un laser que capta la
fluorecencia emitida por los fluorforos exitados.

Actualmente el proceso es automatico y requiere

de un equipo llamado secuenciador por la labor
que hace, pero el nombre correcto es Analizador
Gentico. Por razones operativas se suelen
analizar cadenas de ADN de unos 500
nucletidos como mximo.
Una vez introducida la muestra, el proceso
analtico es automatico. El anlisis de una
muestra en un equipo tiene una duracin
aproximada de 2 h y 45 min, se obtiene una
representacin grafica cuatricolor. La
representacin de colores esta normalizada y
siempre se utiliza el rojo para la T, el azul para la
C, el negro para la G y el verde para la A.