TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.

HỒ CHÍ MINH
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

SEMINAR

CÁC PP PHÂN TÍCH HÓA LÝ

SẮC KÝ LỎNG HiỆU NĂNG
CAO(HPLC)
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN:
Tiến sĩ Nguyễn Thị Lan Phi
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
1. Bùi Tài
2. Phan Kim Anh
3. Trần Thị Ngọc
4. Phan Thị Thiên Trang
5. Đỗ Đặng Thuận
6. Huỳnh Thị Mai Trang
7. Phạm Thị Hoàng Oanh
I.Giới thiệu kỹ thuật sắc ký lỏng
Chất hữu cơ khó bay hơi??
Quá trình tách
Quá trình tách dựa
vào tính chất hóa học,
Pha động vật lý và hóa lý của
các chất.
Dựa trên 2 quá trình:
+Hấp phụ
+Giải hấp phụ

Pha tĩnh
 Phân loại HPLC
SKL chia thành 2 nhóm:
-SK lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)
-SK lỏng áp suất cao (SKL hiệu năng cao: HPLC)
(High Performance Liquid Chromatography)

Phân loại HPLC dựa bản chất tương tác:

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)
 Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn (adsorption or liquid-
solid chromatography)
 Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)
 Phân loại HPLC
Phân loại HPLC dựa vào trạng thái
pha tĩnh
 
Pha động: Lỏng
Pha tĩnh:Lỏng SK lỏng – lỏng
(LLC)

Pha động: lỏng SK lỏng – rắn

Pha tĩnh:Rắn
Định tính và định lượng
Khi nối với đầu do
(detector), HPLC
cho phép:
-Định tính: dựa vào
thời gian lưu
-Định lượng: dựa vào
chiều cao hoặc diện
tích peak
Ưu điểm của phương pháp HPLC:

-Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

-Không cần làm bay hơi mẫu
-Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
-Độ nhạy cao (nhờ đầu dò
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100mL)
II. Hệ thống HPLC

Column

Degasse Pump

Tiím
mẫu

Detector
1. Bình đựng dung môi
 Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và
cặn trong dung môi ( tránh làm hỏng
cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo
ra các Peak tạp trong quá trình phân
tích và ảnh hưởng đến chất lượng
detector.

 Trang bị các loại valves tỷ lệ

(proportionating valves) cho phép
đưa dung môi từ hai bình chứa với
các lưu lượng thay đổi liên tục
2. Bộ khử khí (Degasse)
-Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại
trong dung môi pha động.

-Nếu trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các
bọt khí thì một số hiện tượng:

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm
cho thời gian lưu của Peak thay đổi .

- Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại trừ hết
được thì có thể pump sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất
không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động .
3. Pump Cao áp :
Pump phải tạo được áp suất cao: 250
at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar)
Pump phải tạo dòng liên tục (Bơm có
2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung
môi liên tục).
Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999
ml/phút .
4. Bộ phận tiêm mẫu ( injecter):
 Đưa mẫu vào cột phân tích.
Với dung tích 5 - 100l .
Có 2 cách lấy mẫu vào
trong cột:
-Bằng tiêm mẫu thủ
công( tiêm bằng tay )
-Tiêm mẫu tự
động( Autosample) .
5. Cột sắc ký :
Cột sắc ký thông thường làm bằng thép
không rỉ.
Chiều dài cột khoảng: 10 -30cm
Đường kính trong: 1-10mm
Hạt chất nhồi cỡ : 5-10 m.
Nhiệt độ gần 150°C với sai số <
0,05°C.
Đối với một số phương pháp phân tích
đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp
hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt
trong bộ phận điều nhiệt.
Đươc gắn thêm cột bảo vệ
6. Detector( đầu dò)

Thiết bị phát hiện chất phân tích

(định tính và định lượng).
Có nhiều loại detector khác nhau,
tùy mục đích phân tích và tính chất
của các chất cần phân tích mà
người ta sử dụng loại detector phù
hợp.
 Để ghi tín hiệu phát hiện
7. Bộ phận ghi tín hiệu và in kết quả
do detector truyền sang.
Trong các máy thế hệ cũ
thì sử dụng máy ghi đơn
giản có thể vẽ sắc ký đồ,
thời gian lưu, diện tích của
Peak ,chiều cao …
Nguyên lý hoạt động của HPLC

Column

Degasse Pump

T iím
mẫu

Detector
III. CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm được các điều
kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu.
 Các điều kiện đó bao gồm :

Pha tĩnh : - Loại pha tĩnh

- Kích thước cột
Pha động
 Loại Detector.
 Van tiêm mẫu,thể tích tiêm .
Các yếu tố khác : nhiệt độ ,độ nhạy của detector bước sóng
phân tích.
CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
Lựa chọn pha động và pha tĩnh
Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân
tích, pha động, pha tĩnh.
Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử
cần phân tích và pha tĩnh là tương đương còn pha
động có độ phân cực sai biệt
Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống
nhau: tương tác mạnh giữa cấu tử cần phân tích
và pha tĩnh  thời gian phân tích kéo dài
 CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

Sắc ký lỏng pha thường và pha đảo

Pha thường Pha đảo

Pha tĩnh Phân cực Không phân cực

Pha động Không phân cực Phân cực

CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

1. Lựa chọn đk pha tĩnh:

Cột pha thuận ( NP)
Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay
ít phân cực .Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm
OH phân cực ưa nước .

Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel đã Alkyl hóa )

Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực ,các chất
phân cực có thể tạo cặp Ion .Trên bề mặt hoạt động các nhóm
OH đã bị Alkyl hóa. Vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất
ít .
CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
2. Lựa chọn pha động
Pha động có thể làm thay đổi :
+ Độ chọn lọc 
+ Thời gian lưu
+ Hiệu năng tách của cột
+ Độ phân giải
+ Tính đối xứng của Peak
Lựa chọn pha động
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có. Không được làm cho
pha tĩnh bị biến đổi hóa học . ( vd giá trị pH : 2.5< pH <8.5)
+Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa
giải được chúng.
+ Pha động phải bền vững theo thời gian.
+ Phải có độ tinh khiết cao.
CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

+ Phải phù hợp với loại Detector :

Vd: UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ quang
Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát
quang.
+ Phải kinh tế , không quá hiếm và đắt
vd: Thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha
động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên một mình nó .Vd
thêm nước vào ACN hay MeOH .. Sẽ tạo được pha động
phân cực hơn nó
IV.Tiến hành sắc ký
 References
Dr. Phạm Luận, cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu
suất cao, NXB ĐH và THCN, Hà Nội. 1999.
http://www.chemcenter/org
http://www.kerouac.pharm.uky.edu/asrg/wave/wavehp.html
http://www.anachem.umu.se/jumpstation.htm
http://www.lplc.com/
http://www.zirchrom.com/
http://hplc.chem.vt.edu/
http://www.chrom.com/
http://www.isopro.net/web8.htm
http://hiq.linde-
gas.com/International/Web/LG/SPG/likelgspg.nsf/DocByAli
as/anal_super