Biotecnología Vegetal

• Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos

 micropropagación
 mejoramiento de plantas
 producción de compuestos de interés comercial
producción de metabolitos secundarios
producción de proteínas
producción de polímeros biodegradables
 establecimiento de plantas transgénicas
plantas resistentes a virus
plantas con rutas metabólicas modificadas
plantas mejoradas en cuanto a composición de
proteínas, aceites, etc.
 fitorremediación
remoción de xenobióticos
remoción de metales pesados
Sumario Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

Micropropagación vegetal

Consideraciones técnicas de la propagación

clonal masiva de plantas

Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis

Sistemas de micropropagación vegetal

Agrobiotecnología Alcances de la propagación clonal masiva de plantas

Cultivo de tejidos
vegetales Referencias
 Técnicas del cultivo de células
y tejidos vegetales

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Principales • Existen tres conceptos básicos que
conceptos fundamentan el cultivo in vitro de células y
fisiológicos tejidos vegetales:
aplicables a los
cultivos in vitro
- Totipotencialidad celular

- Desdiferenciación / Rediferenciación

- Balance de reguladores del crecimiento

Agrobiotecnología
vegetal
Cultivo de tejidos
vegetales
Fundamentos
• La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada
teóricos y
por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda
prácticos del célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta
cultivo de entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de
diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones
tejidos específicas referidas al medio del cultivo, relaciones
vegetales hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.

• La desdiferenciación consiste en la transformación y

pérdida de las características de especialización de un tipo
celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El
siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta
es la rediferenciación de las células previamente
desdiferenciadas.

• Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance

Agrobiotecnología entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento,
fundamentalmente de auxinas y citocininas.
Cultivo de tejidos
vegetales
Técnicas
• Micropropagación vegetal
del cultivo
de células • Regeneración de plantas
y tejidos (embriogénesis y organogénesis)
vegetales • Cultivo de meristemos
• Cultivo de suspensiones de células vegetales
• Cultivo de protoplastos
• Cultivo de anteras
• Cultivo de óvulos y embriones

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
 Micropropagación vegetal

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
La • La micropropagación vegetal, o propagación clonal
micropropagación masiva de plantas superiores, posibilita la obtención
constituye la y cultivo de plantas a gran escala.
principal aplicación • Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en
comercial del un medio sintético nutritivo y con control de temperatura,
cultivo de tejidos luz y fotoperíodo.
vegetales

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
 Consideraciones técnicas de la propagación
clonal masiva de plantas

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
La
micropropagación • Laboratorio
vegetal requiere - Area de preparación de medios.
disponer de una - Area de lavado y esterilización.
infraestructura - Cuarto estéril.
mínima - Cámara de cultivo.
especializada - Area de rusticación.
y de condiciones
controladas • Material vegetal
de cultivo
- Plantas madres seleccionadas
(pre-acondicionamiento).
- Explantes (elección, disección,
esterilización, etc.).

• Condiciones de cultivo
Agrobiotecnología
- Asepsia.
Cultivo de tejidos - Recipientes.
vegetales - Temperatura.
- Luz y fotoperíodo.
Medios de cultivo: composición general

Compuestos inorgánicos Reguladores del crecimiento

Macronutrientes: NO3- , PO43- , K+, Ca2+, Auxinas
Mg2+, SO42- Citocininas
Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Giberelinas
Mo2+, Co2+, I-
Soporte inerte (medios semisólidos)
Carbohidratos Agar (0,7 a 1%)
Sacarosa, glucosa, mio-inositol Gelrite®

Vitaminas pH
Tiamina (B1) 5,6 – 5,8
Piridoxina
Acido nicotínico (C) Esterilización
Biotina 1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

Aminoácidos
Glicina
Formulación
básica
de un medio • Soluciones concentradas de macroelementos (100x)
de cultivo
• Soluciones concentradas de microelementos (100x)
para tejidos
vegetales • Vitaminas grupo B (500 ó 1000x)

• Mio-inositol (100 mg/L)

• Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa

en concentraciones de aproximadamente 30 g/L.

• Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso

molecular extraído a partir de algas. Se usa entre

Agrobiotecnología 5 y 10 g/L
Cultivo de tejidos
vegetales
Propiedades
Semisólido
físicas
Consistencia
de los medios del medio
de cultivo Líquido

• El metabolismo de los tejidos puede modificarse

dependiendo de las características del medio de cultivo
(líquido o semi-sólido).

• En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad

del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo
del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.).

• El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando

la propagación in vitro es desarrollada a través
de las siguientes vías:
Agrobiotecnología
- Inducción de embriogénesis*.
Cultivo de tejidos - Cultivo de protoplastos.
vegetales
- Cultivo de suspensiones celulares.

*también en medio semisólido

 • Intercambio gaseoso:
Propiedades
físicas Los recipientes de cultivo se tapan con una película de
polietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambio de
de los medios gases. La organogénesis puede verse modificada
de cultivo si el intercambio de gases se ve dificultado.
- La inducción de yemas a partir de callos
de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno.
- La acumulación de etileno puede inhibir
la regeneración de brotes.

• pH:
- Constituye un factor crítico.
- Se ajusta en el rango 5,5 – 5,8.
- Se modifica durante el crecimiento de los cultivos.

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Composición de medios de cultivo comúnmente usados
Composición de medios de cultivo comúnmente usados
Reguladores del crecimiento comúnmente usados
en los medios de cultivos vegetales
Reguladores • Grupos básicos de reguladores del crecimiento:
del crecimiento - Auxinas
- Citocininas
- Giberelinas
- Acido abscísico
- Etileno

• Generalidades:

- Actúan a bajas concentraciones

- Interactúan unos con otros (los resultados

están determinados por las concentraciones
relativas entre las diferentes fitohormonas).

- Los reguladores endógenos del crecimiento

están presentes en la planta durante todo
su ciclo de vida pero su concentración fluctúa.
Su concentración relativa varía en función
Agrobiotecnología del estado fisiológico de la planta y en cada
uno de los órganos de ésta.
Cultivo de tejidos
vegetales
- Están involucrados en numerosos procesos
fisiológicos.
 O
Auxinas: estos
Acido indol acético (AIA)
compuestos se OH (auxina endógena)
emplean N

básicamente
• Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir
como de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero
promotores de químico responsable de la elongación y de la respuesta
fototrópica del coleóptilo de gramíneas.
la proliferación - Alargamiento y división celular
celular y la - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos
- Formación de raíces adventicias
inducción de la - Dominancia apical
- Acción herbicida
morfogénesis - Estimulación de la producción de etileno

• Se sintetizan en las yemas, las hojas jóvenes, los frutos y

en el embrión. La concentración endógena en la planta varía
entre 0,001 y 0,1 mg·Kg-1.
Agrobiotecnología
• Su transporte es polar
Cultivo de tejidos • Auxinas sintéticas:
vegetales
- Acido indol butírico (IBA)
- Acido naftalen acético (ANA)
- 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
Citocininas: en • Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias
promotoras de la división celular in vitro.
combinación
con las auxinas, • Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas:
determinan - Promoción de la división celular
- Promoción de la organogénesis (relación
diferentes auxinas/citocininas)
respuestas - Retardo de la senescencia
- Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos
morfogenéticas
• Citocininas endógenas:
- Zeatina (Zea)
- Isopenteniladenina (2iP)

• Citocininas sintéticas:
- Cinetina (Kin)
- Benziladenina (BAP)
Agrobiotecnología
• Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran
Cultivo de tejidos
en todos los tejidos. La concentración endógena en
vegetales plantas varía entre 0,1 y 500 g·Kg-1.

• Su transporte es no polar.
Estructura química de las principales citocininas
Las giberelinas
Acido giberélico (GA3)
se utilizan para
favorecer el
crecimiento y el
alargamiento de
los entrenudos
de los brotes • Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz
infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos
de novo entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando
extractos solubles del hongo.

• El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En

la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas.

• Algunos efectos mediados por las giberelinas son:

- Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos
o plantas bianuales
- Crecimiento de yemas latentes
Agrobiotecnología - Germinación de semillas en dormancia
- Floración
- Movilización de reservas en la semilla.
Cultivo de tejidos
vegetales
• Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión.

• Su transporte no es polar.
 Etapas del cultivo in vitro
de plantas superiores

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
 • Iniciación
Etapas de la
- Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre
micropropagación - Elección del explante inicial y de la formulación
del medio de cultivo
vegetal - Desinfección superficial de los explantes
- Establecimiento del cultivo in vitro

• Multiplicación

- Multiplicación del material stock

• Enraizamiento

- Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro

• Rusticación

- Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones

de maceta o a campo

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Existen dos
posibles vías • Posibles vías morfogenéticas:
morfogenéticas
implicadas en la - Organogénesis
diferenciación - Embriogénesis
de novo
de brotes y/o • Diferencias entre las dos posibles vías:
plantas - La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o
completas cluster de células del explante inicial se desdiferencía
inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un
órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas
directamente.

- La embriogénesis se presupone de origen unicelular.

Una célula del explante se aísla y constituye el punto
Agrobiotecnología de partida para la obtención de un embrión somático.
Se diferencian embriones o estructuras bipolares
Cultivo de tejidos que completan cada una de las etapas implicadas
vegetales
en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es
una planta completa.
Etapas implicadas
en el protocolo de Elección de una planta
madre selecta
micropropagación
de una especie
Explantes
vegetal
ETAPA 1
Desinfección superficial

Establecimiento en medio
de cultivo apropiado

Transferencia a un
medio de
multiplicación
ETAPA 2
Formación de
brotes o embrioides

Transferencia a un medio
Agrobiotecnología ETAPA 3 para el enraizamiento de
los brotes
Cultivo de tejidos
vegetales Pasaje a maceta en
ETAPA 4
un invernadero
Elección del explante inicial
Los explantes
deben ser Protocolo tipo de esterilización superficial
esterilizados de material vegetal:
antes de ser
establecidos - Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos.
en condiciones
- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO)
de cultivo al 5 a 20%, entre 5 y 30 min
Este paso puede ser reemplazado por el uso
de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio
(HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante agua estéril

(4 ó 5 veces).

- En el caso del HgCl2, el material se debe

Agrobiotecnología
enjuagar sucesivas veces pues es difícil
Cultivo de tejidos
de eliminar.
vegetales
Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro
 Vías morfogenéticas:
organogénesis y embriogénesis

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Propagación vegetativa por embriogénesis somática
Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales
Semillas sintéticas de
orquídea obtenidas por
encapsulación en alginato
Sistemas de micropropagación vegetal
 Sistemas de micropropagación vegetal
Proliferación de yemas axilares o apicales

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Propagación
vegetativa a • Proliferación de yemas apicales o axilares
partir de yemas - Consiste en la multiplicación de plantas a partir
preexistentes de las yemas axilares preexistentes.
Representa la aceleración in vitro del crecimiento
natural de dichos meristemos.

- La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula con

base en el número de brotes o vástagos obtenidos
a partir de un explante inicial, entre una resiembra
y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20
brotes por mes, dependiendo de la especie
en cuestión, entre otras variables.

- Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían

obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año,
a partir de una única yema inicial.
Agrobiotecnología
- El cultivo de meristemos es un caso especial
del uso de esta técnica.
Cultivo de tejidos
vegetales
 Sistemas de micropropagación vegetal
Proliferación de tejidos desdiferenciados

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Resulta posible • Consideraciones generales:
regenerar brotes
- Callo: masa de células desdiferenciadas
o yemas a partir obtenidas a partir de un explante cultivado
de tejidos in vitro (disco de hoja, meristemo,
células en suspensión, etc.)
vegetales
desdiferenciados - Es posible regenerar brotes o vástagos a partir
de estos callos.
in vitro
- Las plantas diferenciadas pueden
no ser uniformes, debido al posible desarrollo
de variantes somaclonales. Esto debe tenerse
en cuenta, especialmente cuando se trabaja en
propagación clonal a gran escala.

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Sistemas de propagación vegetativa in vitro
Regeneración directa e indirecta
Sistemas de
propagación
vegetativa
in vitro

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
 Sistemas de micropropagación vegetal
Cultivo de meristemos

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
Los meristemos
Los meristemos determinan el crecimiento de
son grupos de
la planta y dan origen a sus diferentes
células órganos
indiferenciadas
que retienen
la capacidad de
dividirse
durante todo el
ciclo de vida de
una planta

• Posibilitan la micropropagación de diferentes especies

vegetales.
Agrobiotecnología
• Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in
Cultivo de tejidos
vegetales
vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias.

• Son ampliamente utilizados como explantes para la

criopreservación y conservación de germoplasma.
En el cuerpo
• Meristemos apicales
de una planta
- Están localizados en la porción terminal o distal del vástago
se reconocen y de la raíz.
diferentes tipos - Sus divisiones dan lugar a las células de los tejidos
pimarios del tallo y la raíz.
de meristemas - Son organogénicos.
- Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces.

• Meristemos secundarios
- Determinan el crecimiento radial de los órganos vegetales.
- Dan lugar a los tejidos de conducción.

• Meristemos florales
- Derivan de la transformación de meristemos apicales.
- Se limitan a la producción de órganos florales.

Agrobiotecnología • Meristemos intercalares

- En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos
Cultivo de tejidos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros.
vegetales
- Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces
El empleo Cultivo de meristemas
de los meristemos
como explantes
del cultivo in vitro
constituye
una posible
herramienta para
el saneamiento de
plantas infectadas

Agrobiotecnología

Cultivo de tejidos
vegetales
El cultivo de
meristemos - El domo meristemático no está vascularizado
facilita la (muchos patógenos se translocan por los tejidos
eliminación de de conducción).
patógenos
- El número de partículas virales es menor
en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934).

- La velocidad de división celular a nivel del meristema

es mayor que la velocidad de replicación de un virus.

- Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo

de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin
Agrobiotecnología entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y
Dahlia.
Cultivo de tejidos
vegetales
Aspectos • Equipamiento
Asp
técnicos - Elementos generales para cultivo in vitro.
del cultivo - Lupa estereoscópica.
- Instrumental de disección.
de meristemas
• Etapas del cultivo
- Elección del explante: escencialmente meristemos apicales
de vástago. Domo meristemático desnudo o acompañado
por 2 ó 3 pares de primordios foliares.
Tamaño aproximado 0,5 mm.

- Esterilización de la yema o porción apical del vástago

conteniendo al meristemo propiamente dicho.

- Disección del meristemo bajo lupa. Eliminación

de las primeras hojas.

- Transferencia del explante al medio de cultivo semi-sólido.

Agrobiotecnología - Regeneración de yemas axilares. Subcultivo a medio

sin hormonas para la obtención de plantas completas.
Cultivo de tejidos
vegetales - Propagación del material (a partir de estacas uninodales, etc.)

- Rusticación.
Consideraciones
• La eficiencia del cultivo de meristemos como
prácticas sobre procedimiento para la obtención de plantas sanas
el cultivo de dependerá del tamaño del explante.
meristemos • Existe una situación de compromiso entre el tamaño
mínimo posible del meristemo y su capacidad de
desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro.

Ejemplos prácticos:

- Frutilla (Fragaria sp) / ¿patógeno?:

Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas.

- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X:

Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas
sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios
el % de plantas sanas es menor.
Agrobiotecnología
- Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V:
Cultivo de tejidos Se obtienen altas eficiencias de saneamiento
vegetales cultivando explantes de no más de 2 pares
de primordios foliares.
Alcances de la
micropropagación • Propagación vegetativa rápida y a gran escala
vegetal
• Uniformidad seleccionada del material clonado

• Multiplicación de plantas recalcitrantes

a las técnicas convencionales

• Reducción en el tiempo de multiplicación

y en el espacio requerido para tal fin

• Mayor control sobre la sanidad del material

propagado

• Introducción rápida de nuevos cultivares

Agrobiotecnología
• Conservación de germoplasma

Cultivo de tejidos • Facilidades para el intercambio internacional

vegetales
de material vegetal