Professional Documents
Culture Documents
Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào:
1. thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan
trọng ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh
2. thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu mẫu, phương pháp cố
định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân
lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv,
cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu.
3. số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông cũng ảnh hưởng đến kết quả
phân tích
→ Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích được sử dụng phải
đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh.
Các vấn đề khác
Cần phải thiết lập những giá trị giới hạn cho những phép
phân tích mà kết quả thu được có tính định lượng để xác
định kết quả âm tính và dương tính.
Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và
dương tính giả cũng như kết quả âm và dương tính thật.
Tính hiệu lực của phương pháp
Một phương pháp phân tích có tính hiệu lực là phương pháp có
thể cho ra kết quả phân biệt rỏ ràng giữ kết quả dương tính và âm
tính hoặc giữa cá thể bị nhiễm bệnh và không bị nhiệm bệnh.
Tính hiệu lực của phương phá biểu hiệu qua hai đặc điểm:
– Tính nhạy (khả năng xác định chính xác mẫu có nhiễm hay
không)
– Tính chuyên biệt (khả năng phát hiện mẫu không có nhiễm bệnh)
Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách so sánh
các cá thể cùng loài trong cùng một mẫu. Trong trường hợp khác
kết quả phải được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học.
Tính ổn định của phương pháp
Kary Mullis
Phương pháp PCR là gì?
Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn, và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì
chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tồng hợp. Hai mồi này gồm mồi xuôi và
mồi ngược theo chiều phiên mã gen.
PCR.EXE
Các giai đoạn của PCR
Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung
dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho
sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng,
thường là ở 92-95 oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.
90
80
70
60
50
40
Giai đoạn lai
90
80
70
60
50
40
Giai đoạn kéo dài
90
80
70
60
50
40
Sản phẩm PCR đầu tiên
Khuếch đại trình tự mong muốn
Thành phần của PCR
• Hệ gen DNA
• Hệ gen RNA, mRNA
• Máu (huyết tương)
• Các mô cơ thể (i.e. nơi bị nhiễm)
Thiết kế mồi
Bước 1
Biến tính Biến tính (92oC - 95oC)
93°C - 95°C tách hai mạch AND
xoắn kép thành 2 mạch đơn
Bước 2
Biến tính
92°C- 95°C Lai (37oC - 65oC) Mồi
lai với trình tự bổ sung trên
mạch khuộn DNA
25-35 CYCLES Bước 3
Kéo dài (70oC- 72oC)
Kéo dài Lai polymerase tổng hợp DNA
70°C-72°C 37°C- 65°C
mới
Exponential amplification
(khuếch đại theo cấp số nhân)
Plateau Effect
109
107
0 10 20 30 40 50 60
Số chu kỳ
Tối ưu hóa PCR
Mồi F1
Mạch khuôn
Mồi R1
Mồi F2
M N 1 2 3 4 5
262 bp HPV
232 bp WSSV
122 bp nội chuẩn
Nguyên lý của RT-PCR
mRNA 5’ AAAAAA 3’
TTTTTT
Reverse transcriptase Tổng hợp mạch cDNA thứ nhất
mRNA 5’ AAAAAA 3’
1st stranded cDNA 3’ TTTTTT 5’
RNaseH
Cắt mạch khuôn RNA
5’ AAAAAA 3’
3’ TTTTTT 5’
DNA polymerase
Tổng hợp mạch cDNA thứ 2
5’ AAAAAA 3’
3’ TTTTTT 5’
Double stranded
cDNA
Phương pháp PCR bao gồm các bước:
Quy trình chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên các loài thuộc họ tôm
He bằng kỹ thuật PCR tiêu chuẩn ngành (28 TCN202:2004) do Bộ
Thủy sản ban hành năm 2004. (nguồn: http://www.fistenet.gov.vn/standard.asp)
Gel chuẩn dùng chẩn đoán WSSV kit IQ2000